Summary
Surveillance perfusion cérébrale a été démontré pour améliorer la précision dans ischémiques modèles d'AVC. Les difficultés techniques limitent souvent l'utilisation de cet outil essentiel pour la recherche vasculaire cérébral. Dans cette vidéo, un système optimisé est indiqué pour obtenir un contrôle simple ou multi-sites hémodynamique pendant intraluminale occlusion de l'artère cérébrale moyenne chez le rat.
Abstract
Le potentiel de translation de recherche pré-clinique AVC dépend de la précision de la modélisation expérimentale. Suivi la perfusion cérébrale dans des modèles animaux d'AVC ischémique aigu permet de confirmer le succès occlusion artérielle et d'exclure une hémorragie méningée. Surveillance perfusion cérébrale peut également être utilisée pour étudier la circulation collatérale intracrânienne, qui est en train de devenir un puissant déterminant de l'issue accident vasculaire cérébral et une cible thérapeutique possible. En dépit d'un rôle reconnu de la surveillance Laser Doppler perfusion dans le cadre des lignes directrices actuelles pour l'ischémie cérébrale expérimentale, un certain nombre de difficultés techniques existent qui limite son utilisation à grande échelle. L'un des problèmes majeurs est l'obtention d'un attachement sécurisant et prolongée d'une sonde de profondeur de pénétration laser Doppler au crâne animal. Dans cette vidéo, nous montrons notre système optimisé pour la surveillance de la perfusion cérébrale au cours occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne par le filament intraluminal chez le rat. Nous j'ai développén-maison d'une méthode simple pour obtenir un support sur mesure pour bi-fibres (profondeur de pénétration) des sondes Doppler laser, qui permettent multi-sites de surveillance si nécessaire. Une surveillance continue et prolongée de la perfusion cérébrale pourrait facilement être obtenu sur le crâne intact.
Introduction
Recherche translationnelle sur les facteurs hémodynamiques concernant la physiopathologie et thérapie course doit être mis en œuvre, depuis cette importante question est souvent paradoxalement négligé par les études de recherche de base 1.
Suivi la perfusion cérébrale est un outil essentiel, mais sous-utilisé, pour la modélisation précise course ischémique 2. Mis à part la confirmation de l'occlusion vasculaire artérielle et de l'exclusion de 3 hémorragie méningée, une surveillance continue de perfusion cérébrale peuvent fournir des données utiles sur le degré et la cohérence de déficit de perfusion, l'état fonctionnel des vaisseaux collatéraux intracrâniennes et l'effet hémodynamique de nouvelles approches thérapeutiques.
Une étude récente de notre groupe montrent que la surveillance hémodynamique multi-sites peuvent être utilisés pour évaluer la circulation collatérale intracrânienne et peuvent prédire la taille de l'infarctus et déficit fonctionnel 4. Ces résultats expérimentaux sont consistent avec des études cliniques qui ont montré que les performances fonctionnelles de la circulation collatérale cérébrale est prédictif de la réponse clinique chez les patients avec AVC ischémique 5, 6. Pour cette raison, les collatérales cérébrales ont été préconisés comme une cible potentielle thérapeutique dans la phase aiguë de 7 accident vasculaire cérébral ischémique.
Laser-Doppler (LD) instruments sont l'outil le plus couramment utilisé pour mesurer la perfusion cérébrale dans l'AVC ischémique expérimentale et leur utilisation est recommandée par les directives récentes sur ce thème 8. LD perfusion microvasculaire instruments de mesure dans un petit volume cortical, la profondeur du signal enregistré étant fonction de la largeur de séparation des fibres, avec deux sondes LD fibres permettant une pénétration plus profonde par rapport à des sondes individuelles de fibres LD 9. Les valeurs du flux sanguin sont exprimés en unités arbitraires de perfusion (PU) qui indiquent relative plutôt que la circulation sanguine cérébrale absolue. Calibration de PU est généralement effectuée usinnormes motilité g, selon les instructions du fabricant. LD débitmétrie permet une surveillance continue, dynamique et production de données quantitatives au sein de la même session.
Parmi les problèmes techniques qui limitent actuellement l'utilisation de LD, un enjeu majeur est d'obtenir une fixation sûre et prolongée d'une sonde de profondeur de pénétration laser Doppler au crâne animal. Cela est essentiel pour une surveillance prolongée et si plusieurs sondes sont utilisées pour différents territoires artériels cérébraux, comme nous jouons dans notre laboratoire.
En particulier, allongement du temps opératoire est nécessaire si les sondes sont fixées à l'aide de crâne trépanations crâniennes ou de vis, tandis que de mauvaise réception et de fixation non sécurisé se produit si seule fibre (faible pénétration) LD sondes sont fixées sur le crâne de la colle chirurgicale simple. Jumeaux de fibres (profondeur de pénétration) des sondes LD fournir un signal plus élevée et plus constante, mais elles sont plus grandes que les sondes à fibre unique et ne peut pas être àattachée à l'aide d'une colle chirurgicale crâne seulement.
Dans cette vidéo, nous montrons notre système optimisé pour la surveillance de la perfusion cérébrale au cours occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne par le filament intraluminal chez le rat. Nous décrivons une méthode simple pour obtenir un système efficace, sur mesure, support à faible coût pour simple ou multiple bi-fibre (profondeur de pénétration) des sondes LD, être utilisé pour la surveillance prolongée de la perfusion cérébrale sur le crâne intact.
La procédure chirurgicale pour MCAO transitoire chez le rat pourrait être vu dans la vidéo-article de Uluç et ses collègues 10 et n'est pas représenté dans cette vidéo.
Protocol
1. Comment faire le porte-sonde (site unique ou multi-sites)
- Les matériaux nécessaires sont en caoutchouc naturel, petits tubes en plastique et un stylet métallique. Le support de sonde peuvent être personnalisés pour la taille de l'animal, le nombre et la taille des sondes Doppler à laser, et le territoire vasculaire cérébral qui doit être surveillée.
- Couper le caoutchouc naturel de la taille adéquate (environ 10 mm x 10 mm pour un rat 300 g).
- Marquer la position de la sonde (s) et le bregma sur le caoutchouc naturel, selon les coordonnées stéréotaxiques désirées, par occlusion de l'artère cérébrale moyenne, les coordonnées typique pour le noyau ischémique sont attendus au bregma -1 mm, 5 mm en dehors de la ligne médiane, pour un territoire borderzone périphérique ischémique, les coordonnées peuvent être attendus au bregma +2 mm, 2 mm latéralement à la ligne médiane.
- Marquer très clairement la position du bregma avec un X, c'est le point de repère pour fixer le support de sonde sur le crâne. </ Li>
- Insérez le stylet dans un petit tube en plastique (sa taille doit correspondre à la taille de la sonde).
- Insérer le mandrin dans le caoutchouc naturel à l'endroit où la sonde doit être placée; pousser le stylet dans le caoutchouc jusqu'à ce que le tube en matière plastique a été inséré dans le caoutchouc trop.
- Retirez le stylet.
- Si plusieurs sondes sont nécessaires, répétez les étapes 1.5 à 1.7 pour les positions de la sonde autres.
- En option pour de multiples sondes: enrouler un ruban autour des tubes en matière plastique pour assurer une meilleure stabilisation des sondes.
- En option: la stérilisation chimique des supports de sondes plusieurs pour des utilisations futures.
2. Préparation préopératoire
- MCAO course modèle est généralement effectuée sous forme d'une chirurgie de survie. Dans ce cas, comme le montre notre vidéo (temps de survie 24 heures après la chirurgie), le chirurgien utilise une technique aseptique avec des instruments stérilisés et des fournitures.
- Anesthésier le rat avec de l'isoflurane (inductio 3%n phases, la maintenance 1,5%).
- Placez le rat en décubitus ventral sur la table d'opération.
- Doucement raser la tête du rat.
- Appliquer une solution antiseptique pour une compresse de gaze et désinfecter la peau.
- Administrer lidocaïne 2% à 5 mg / kg par voie sous cutanée dans la région crânienne.
3. Positionnement de la sonde et sécurisation sur le crâne intact
- Faire une incision paramédiane droite la peau (pour la droite MCAO) et disséquer le tissu sous-cutané pour atteindre l'aponévrose crânienne (galea aponeurotica).
- Faire une incision paramédiane droite de l'interface client crânienne et effectuer la dissection mousse pour atteindre l'os du crâne; préparer une zone de l'os du crâne qui est assez grand pour l'application du porte-sonde.
- S'il vous plaît noter: pas besoin de forage ou d'amincissement des os.
- Appliquer la solution merbromine pour désinfecter et sécher la surface du crâne.
- Utilisez un sèche-cheveux (réglé sur l'air froid) afin d'accélérer le séchage de la surface du crâne. À ce stade, les sutures crâniennes et le bregma sont clairement visibles.
- Personnaliser le porte-sonde en coupant les bords avec des ciseaux stériles.
- Appliquez une petite quantité de colle chirurgicale (cyanoacrylate, vétérinaire agréé) à la surface sous le support de la sonde, en évitant soigneusement l'ouverture inférieure des tubes en plastique (s'il vous plaît noter: si une quantité importante de colle entre la surface optique de la sonde et le crâne, ce qui peut produire un signal faible et risque d'endommager la sonde après plusieurs utilisations).
- Appliquer le support de sonde à la surface du crâne, soigneusement correspondant au bregma avec le repère X. Appliquez une légère pression sur le porte-sonde.
- Utilisez un sèche-cheveux (réglé sur l'air froid) afin d'accélérer le séchage de la colle chirurgicale.
- Fixez le support de sonde en attachant un fil chirurgical autour du porte-sonde et la tête de l'animal; faire attention à positionner le fil chirurgical au cours de la mandibule, en évitant la région sous-maxillaire et ee cou.
- En option: remplir le tube (s) du porte-sonde avec un gel optique (par exemple, une échographie ou un gel commune électrocardiographie), ce qui augmentera la qualité du signal LD.
- Placer la sonde (s) dans le support de sonde et vérifier la lecture réelle du débitmètre LD. Utilisez le débitmètre LD selon les instructions du fabricant.
- Fixer la sonde (s) en les attachant autour de la tête de l'animal; faire attention à positionner le fil chirurgical au cours de la mandibule, en évitant la région sous-maxillaire et du cou.
4. Surveillance perfusion cérébrale cours MCAO
- Placez le rat en décubitus dorsal, en évitant soigneusement les forces de traction sur la sonde (s) ou porte-sonde.
- Début de surveillance au cours de la perfusion cérébrale MCAO.
5. Titulaire retrait de la sonde (s) et de la sonde
- Couper les fils de suture autour de la sonde (s), le porte-sonde et la tête de l'animal.
- Doucement émousser disséquer les tissus mous du crâne et la peau autour de la base de caoutchouc naturel du porte-sonde.
- Retirez le support de sonde.
- Appliquer une solution antiseptique à la surface du crâne.
- Suturer la peau du crâne.
6. Soins post-opératoires
- Administrer 2,5 ml de solution saline sous-cutanée pour prévenir la déshydratation et conserver la chaleur animale au moyen d'un coussin chauffant après l'arrêt de l'anesthésie gazeuse.
- Pour la chirurgie de survie: une analgésie préventive avec kétoprofène 4 mg / kg par voie sous cutanée et répétez la même dose à 12 h post-opératoire
- Dans nos conditions expérimentales, l'euthanasie a été effectuée à 24 h post-opératoire par inhalation de CO 2.
Representative Results
Transitoire MCAO (60 min) a été induite par l'insertion d'un filament enduit de silicone dans l'artère carotide externe. Le filament est alors poussé à travers l'extrémité terminale de l'artère carotide interne jusqu'à l'origine de la MCA, sous la surveillance LD. L'artère carotide commune et l'artère occluse pterygopalatin ont été transitoirement pendant l'insertion du filament chirurgical. Une représentation schématique de la procédure chirurgicale est illustré à la figure 1A.
Les coordonnées du crâne pour positionner les deux sondes LD ont été choisis en fonction du territoire sous-jacent artérielle. Des expériences préliminaires avec la perfusion de gélatine encre (figure 1B) ont montré que le noyau ischémique est attendue dans le territoire central MCA (bregma -1 mm à 5 mm de la ligne médiane; Sonde 1), tandis que la circulation collatérale est prévu sur le territoire borderzone entre le branches corticales de moyenne et antérieure artères cérébrales (bregma +2 mm, 2 mm de la ligne médiane; Sonde 2).
Hémodynamique cérébrale a été étudiée à l'aide multi-sites Laser Doppler sondes pendant toute la durée de l'intervention chirurgicale, soit avant, pendant et après MCAO (Figure 2). Le déficit de perfusion cérébrale au cours de MCAO était plus petite et a montré un plus haut degré de variabilité de la sonde 2 par rapport à la sonde 1, suggérant différences inter-individuelles dans les performances fonctionnelles des collatéraux intracrâniennes dans des conditions ischémiques. Le site multi-laser Doppler surveillance permet également d'étudier les changements hémodynamiques cérébrales pendant l'occlusion proximale de l'extra-crâniennes artères cérébrales (l'artère carotide commune, carotide interne, artère pterygopalatin).
Course résultat a été évaluée 24 heures après la reperfusion par volume de l'infarctus, calculé sur 19 sections consécutives colorées avec du violet de crésyl (figure 3), et Garcia fonctionnelle neuroscore 11. Immunohistochimie spécifique pour les marqueurs associés à une lésion cérébrale ischémique a été effectuée, de façon à obtenir une distribution topographique de la perte neuronale (protéine associée aux microtubules 2, MAP2) et pénombre ischémique (protéine de choc thermique-70, Hsp70) par rapport à la surveillance hémodynamique multi-sites de la circulation intracrânienne (Figure 4).
Figure 1. Surveillance au cours de la perfusion cérébrale intraluminale MCAO chez le rat. A. Représentation schématique de la procédure chirurgicale pour MCAO transitoire. Un filament enduit de silicone a été utilisé pour occlure l'origine de la MCA, après avoir été introduit dans l'artère carotide externe et poussé à travers l'artère carotide interne. Proximaux des artères cervicales ont été soit ligaturé (artère carotide externe) ou transitoire occlusion (artère pterygopalatin et l'artère carotide commune) au cours de la procéduredure. B. Un représentant du cerveau est affiché après la gélatine à l'encre de coloration. Transcardiaque perfusion de solution de gélatine d'encre ont été effectuées 60 minutes après le début de l'ischémie, sans reperfusion. Le cerveau normalement perfusé a été souillé par de la gélatine d'encre et est apparu comme de couleur grise avec des bateaux colorés en noir, tandis que la zone ischémique (non-perfusé) restent non colorées (de couleur rose). Coordonnées crâniennes pour positionner les deux sondes LD sont affichés. Sonde 1 = -1 mm à partir du bregma, 5 mm de la ligne médiane; Sonde 2 = +2 mm à partir du bregma, 2 mm de la ligne médiane.
Figure 2. Cérébrales enregistrements hémodynamiques à l'aide multi-sites Laser Doppler sondes. Un modèle hémodynamique typique qui suggère fonctionnellement actifs collatéraux intracrâniennes dans des conditions ischémiques est affiché. Chez cet animal, tracés LD a montré un petitdéficit de perfusion er en Probe 2 canaux, par rapport à la sonde 1 canal, à la fois pendant la CCA occlusion et l'occlusion MCA. MCA-O = occlusion de l'artère cérébrale. CCA-O = occlusion artère carotide commune. PU = unités de perfusion.
Figure 3. Coupes de cerveau représentatifs pour le calcul de volume de l'infarctus histologiques sections coronales (50 um; n = 19 à 250 um intervalle; bregma +2,5 mm à -3,0 mm). Sont fixés dans du paraformaldéhyde à 4% et colorées au violet de crésyl 0,1%. Volume de l'infarctus est calculé en utilisant un logiciel de traitement d'image ImageJ, corrigé des asymétries inter-hémisphériques en raison de l'œdème cérébral, et exprimée en mm 3. Cliquez ici pour agrandir la figure
Figure 4. Immunomarquage de marqueurs moléculaires de la perte neuronale et de la pénombre représentatives des coupes de cerveau consécutives sont présentés, qui ont été colorées avec du violet de crésyl 0,1% (A) ou même méthode avec des marqueurs de la perte neuronale associée aux microtubules (protéine 2, MAP2, B). Et pénombre ischémique (chaleur shock protein-70, Hsp70, C).
Discussion
Nous avons développé en interne un système simple et peu coûteux pour une fixation sûre de l'une ou plusieurs double-fibres (pénétration profonde) sondes LD au crâne intact du rat au cours de la procédure MCAO. Même s'il semble un problème trivial, l'obtention d'une fixation fiable de la sonde de LD au crâne est en fait un problème majeur dans ce cadre expérimental, puisque c'est la condition sine qua non pour un signal de détection lisse et un bon suivi de la perfusion cérébrale.
Les procédures invasives, comme les trous de trépan et vis à os, le plus souvent de prolonger la durée de la chirurgie et d'introduire davantage de variables expérimentales liées à la craniotomie, ce qui peut décourager les chercheurs et les s'abstenir d'utiliser la surveillance LD. D'autre part, l'utilisation de la fibre unique (faible pénétration) des sondes, qui sont plus minces et relativement facile d'être collé directement sur la surface du crâne, donne mauvaise qualité du signal et ne peut pas être utilisée de manière fiable avec des rats adultes sans percer ni fluidifier le crâne.
Nous avons utilisé des matériaux simples et peu coûteux, tels que le caoutchouc naturel, des tubes en plastique et un stylet métallique. Un support de sonde sur mesure peut être réalisée en quelques minutes et adaptée aux conditions expérimentales. Ces supports de sondes peut accueillir une ou plusieurs sondes de pénétration profonde LD, pour la surveillance du site classique unique sur le noyau ischémique ou plusieurs sites de surveillance dans les différents territoires artériels dans le même hémisphère ou dans les deux hémisphères. De nombreux supports de sondes pourraient être produites, stérilisé chimiquement, et stockés pour une utilisation future. Vétérinaire agréé colle chirurgicale (cyanoacrilate), accélérée par l'air froid, est utilisé pour fixer le support de sonde sur la surface du crâne intact rat, selon les coordonnées désirées crâniens. Enfin, la sonde mise en place est en outre maintenue en place par des sutures communs.
Le temps global de cette sonde LD set-up, après avoir maîtrisé cette technique, est d'environ 10 min.
Comme le montre in cette vidéo, nous avons l'habitude de surveiller la perfusion cérébrale dans le territoire central MCA (LD sonde 1: noyau ischémique) et dans le territoire périphérique MCA (LD sonde 2: principalement une zone de pénombre). Dans notre étude récente, nous avons montré que la variabilité des changements du flux sanguin dans LD sonde 2 (moyenne 52% ± 16% SD, par rapport à la ligne de base) est plus élevé par rapport à la sonde LD 1 (moyenne 31% ± 6% SD, par rapport à la de référence) et peut être utilisée pour prédire 4 Résultat course.
Nous pouvons fournir quelques conseils de dépannage pour les chercheurs qui souhaitent utiliser notre propre système développé. Au début de l'expérience, veillez à bien sécher la surface du crâne (avec merbromine et l'air froid) avant de fixer le support de la sonde pour éviter le décollement prématuré. En outre, veiller à appliquer la colle sur le caoutchouc naturel, en évitant le contact avec l'extrémité ouverte du tube de matière plastique et la surface optique de la sonde LD, pour empêcher signal faible et risque d'endommagement de la sonde. Lorsque attacher le fil de suture autour de la tête de l'animal, être prudent afin d'éviter l'obstruction des voies aériennes (ceci est empêché par le positionnement de la suture de l'os mandibulaire). Après le positionnement et la fixation des sondes, veiller à ne pas les câbles des sondes de traction dans les virages de l'animal en décubitus dorsal pour la chirurgie cervicale; cette étape nécessite habituellement deux personnes, une personne tenant l'animal et une deuxième personne détenant les câbles des sondes et doucement en les positionnant dans la position souhaitée. Enfin, la contamination du sang éventuelle de la sonde bi-fibre LD est facilement géré en suivant les instructions de nettoyage fournies par le fabricant.
Notre système optimisé pour la surveillance de la perfusion cérébrale, comme le montre cette vidéo, pourrait fournir une alternative plus facile, plus rapide et plus fiable pour la sonde mise en place des systèmes qui sont actuellement vendus par des sociétés commerciales dans ce domaine. En outre, nous pensons que l'utilisation de ce système par d'autres chercheurs peuvent améliorer le goujony du hémodynamique cérébrale dans le domaine expérimental course, menant à l'élaboration d'une nouvelle génération de produits thérapeutiques collatérales cérébrales.
Disclosures
Le financement de la production de cette vidéo a été fourni par l'article Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Royaume-Uni), qui produit les instruments laser Doppler présentés dans notre étude expérimentale.
Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l'Université de Milano Bicocca, en conformité avec les directives nationales sur l'utilisation des animaux de laboratoire (DL 116/1992) et la directive de l'Union européenne pour l'expérimentation animale (2010/63/UE ), sous licence de projet (n. 219/2011-B) du ministère italien de la Santé.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Mme Caroline Robertson pour la voix-off et Mme Elena Pirovano pour son aide dans la production vidéo. Cette étude a été soutenue par l'Université de Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
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| VP12 probe | Moor Instruments |
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| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
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