Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Murin Spinotrapezius Model til at vurdere virkningen af ​​arteriolær Ligering om Mikrovaskulære Funktion og Remodeling

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Vi viser en ny arteriel ligation model i murine spinotrapezius muskler, herunder en trin-for-trin procedure og beskrivelse af ønsket instrumentering. Vi beskriver kirurgi og relevante resultater målinger af vaskulære netværk remodellering og funktionelle vasodilation med intravital og konfokal mikroskopi.

Abstract

Den murine spinotrapezius er en tynd, overfladisk skelet support muskel, der strækker sig fra T3 til L4, og er let tilgængeligt via dorsal incision i huden. Dens unikke anatomi gør spinotrapezius anvendelige til undersøgelse af iskæmisk skade og efterfølgende mikrovaskulær remodeling. Her vil vi vise en arteriolær ligation model i den murine spinotrapezius muskel, der blev udviklet af vores forskning team og tidligere offentliggjorte 1-3. For visse udsatte musestammer, såsom Balb / c-mus, pålideligt denne ligering operation skaber skeletmuskulatur iskæmi og tjener som en platform for undersøgelse terapier, der stimulerer revaskularisering. Metoder til vurdering er også demonstreret, herunder brug af intravital og konfokal mikroskopi. Den spinotrapezius er velegnet til sådanne billeddiagnostiske undersøgelser på grund af dens tilgængelighed (overfladisk dorsal anatomi) og relativ tynd (60-200 um). Den spinotrapezius muskel kan monteres en face, lettebilleddannelse af hel-muskel mikrovaskulære netværk uden histologisk sektionering. Vi beskriver anvendelse af intravital mikroskopi at opnå målinger efter en funktionel vasodilation procedure specifikt øgede arterilar diameter som følge af muskelkontraktion. Vi viser også procedurerne for høst og fastsættelse af væv, en nødvendig forløber immunfarvning undersøgelser og brug af konfokal mikroskopi.

Introduction

Dyremodeller for kronisk iskæmi er værdifulde værktøjer til undersøgelse patofysiologien af ​​iskæmiske sygdomme, såsom perifer arteriesygdom, koronararteriesygdom og cerebrovaskulær sygdom. Hos gnavere, som hos mennesker arterieokklusion fører til strukturel omformning af det vaskulære netværk, herunder arteriogenese og angiogenese. Hos raske og yngre patienter, kan dette remodeling være tilstrækkeligt til at redde væv fra iskæmi-induceret skade, men co-morbiditet, såsom diabetes kan bringes i alvorlig fare remodeling og nyttiggørelse. Forstå mekanismerne bag vaskulær remodellering begivenheder er afgørende for at udvikle behandlinger, der stimulerer disse endogene revaskulariseringsprocedurer processer.

Currently, femorale arterie ligering eller resektion i bagbenet er standard teknik til at studere kronisk iskæmi-induceret vaskulær remodellering i små dyr 4,5. Analyse af diameteren, forbindelse og reaktiviteten afde mikrokar, der udgør det vaskulære netværk nedstrøms for den ligerede femorale arterie er imidlertid vanskeligt på grund af tykkelsen af ​​musklerne. Vi har udviklet en arteriolær ligation model i mus spinotrapezius muskel: unilateral ligering af den laterale foder arterie i denne stabiliserende rygmuskel 1. De relativt tynde spinotrapezius (60-200 um) er modtagelig for en face immunfarvning for vurdering af hele netværkstopologi med encellede opløsning, der giver en detaljeret gennemgang af vaskulær remodellering arrangementer på tværs af hele væv. Det spinotrapezius er også overfladisk og tilgængelig, og dermed dets skibe er let ses af intravital mikroskopi, til effektiv karakterisering af virkningen af ​​remodeling og arteriolær ligation på vaskulær reaktivitet.

I denne rapport beskriver vi i detaljer og demonstrere musen spinotrapezius arteriole ligation model. Både in vivo og ex vivo migthods skøn efter operation er beskrevet, herunder måling af funktionel vasodilation, som har vist sig at være forringet under iskæmiske tilstande 6 og immunofluorescent afbildning af hel-muskel mikrovaskulære netværk. Vi har også omfatte resultaterne af to separate pilotundersøgelser at demonstrere anvendeligheden af ​​modellen. For det første anvendte vi den arterielle ligation model til at inducere en statistisk signifikant stigning i beholderen snoning i C57BL / 6 mus (figur 2B). Tortuositet stiger under arteriogenese i arteriole soeskende. I andre musestammer, er der mere sårbare over for iskæmi på grund af fravær af CSA arterioler (fx Balb / c), er kapillær arterialization observeret 10. Kapillær arterialization detekteres af øgede diametre og udvikling af α-glat muskel-actin reaktivitet. Sekund, funktionel elektrisk stimulering af musklen medfører vasodilatation i terminale arterioler i spinotrapezios (figur 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius Feed Artery Ligation Kirurgi

  1. Bedøve mus ved intraperitoneal injektion. I en 0,5 ml sprøjte, formulere: 0,06 ml 100 mg / ml Ketamin
    0,03 ml af 20,0 mg / ml xylazin
    0,01 ml 0,4 mg / ml Atropin
    0,30 ml 0,9% saltvand.
    Dosis: 0,01 ml * per gram legemsvægt, ip

* Dosis variabel ved musestamme og lager, justere i overensstemmelse hermed så mus opsving er inden for en time fra induktion.

  1. Anvend standard ophthalmisk salve for at forhindre hornhinden udtørring.
  2. Fjern hår fra bagsiden ved hjælp af trimning neglesaks, efterfulgt af kort anvendelse af hårfjerningsmiddel.
  3. Desinficere det kirurgiske område med chlorhexidin eller povidon-iod. Alternate povidon-iod med ethanol tre gange, sluttende med povidon-iod.
  4. Overfør musen til den tidligere fremstillede kirurgiske arbejde overflade, med varmepude og sterilt afdækningsstykkepå plads.
  5. Skabe en lineær incision (3-5 mm) gennem den dorsale hud cirka 5 mm caudalt til knoglefremspring af bovbladet ved hjælp af iris saks og standardmønster tænger (f.eks FST, 11271-30) ved udspiling af vævet og opskæring parallelt med rygsøjlen. Målet incisionssted kan identificeres ved transdermal visualisering af den dorsale fedtpude hvis hudens pigmentering tillader det skæres ved den caudale grænse fedtpuden. Udvide snit efter behov, og strækker sig gennem sekundære hudlag ved hjælp af fjeder saks.
    1. Anatomisk note - Den spinotrapezius muskel ligger dorsalt og strækker sig fra T4 til L3 langs hver side af rygsøjlen. Den forreste kant strækker sig sideværts til ca skulderbladet. Musklen tilspidser i haleretningen, således at den mest posteriore kant ligger medialt til den forreste kant, og kan fastsætte flugter med rygsøjlen. To fedtpuder er også vigtigt at bemærke, om direkte dorsale og ventrale til spinotrapeziusmuskel mod den kraniale halvdel.
    2. Inflammation på grund af indsnit har vist sig at have nogen virkning på vaskulær remodellering respons, som sham ligering operation viste ingen ændring i remodellering af spinotrapezius vaskulatur. To rumlige faktorer bidrager til dette resultat. Først snittet fjernes ved 5 mm i kranie retning fra området af interesse, hvor den vaskulære reaktion i musklen typisk undersøges. Derudover er incisionssted på den dorsale hud adskilt fra beholderen ligeringsstedet med en ventral fedtpude, der ligger oven på det kraniale tredjedel af spinotrapezius musklen.
  6. Skyl snittet med warmed Ringers opløsning for at forhindre muskel udtørring. Anvendelse af vasodilatorer, såsom papaverin vil bidrage til visualisering af målet arterie til ligering.
  7. Under et dissektionsmikroskop, bruge pincet til stumpe dissekere og adskille (men ikke fjerne) den dorsale hvide fedtpude fra den underliggende muscular væv for at visualisere kar, som den kommer ind i og forlader spinotrapezius på sin sidekant.
  8. Lokalisere målet arterie, hvilket sammen med en eller to parrede vener, passerer gennem fedtpuden, der er ventral til spinotrapezius på vej i den laterale kant af musklen. Denne arterie føder en væsentlig del af den kaudale halvdel af musklen, hvilket kan bekræftes ved at reflektere og udskiftning af musklen for at observere stien af ​​arterien inden for musklen. Målplaceringen til ligering er det segment af arterie forlader den ventrale fedtpuden og ind i musklen, og er helt tilgængelige i denne region. Arterie-vene parret kan være nødvendigt at forsigtigt adskilt fra den ventrale fedtpuden i denne region. Bemærk at spinotrapezius næres af flere arterie-vene par, herunder fartøjer, der tværgående enten de dorsale og ventrale fedtpuder. Pas på ikke at forstyrre disse fartøjer.
    1. Flere indikatorer kan anvendes til at skelne arteriefra venen. En af de bedste metoder er at forsigtigt blokere blodgennemstrømning med mikrosonde og flytte opstrøms væk fra musklen, flow vil ikke genoptage i arterien, indtil forhindringen er frigivet. Farve kan også anvendes, som vene vægge indeholder en hvidlig lag af bindevæv, der arterier mangler. Yderligere kan man betragte diameteren før anvendelse af vasodilatator som vener er typisk større i størrelse.
  9. Arterien er typisk tæt på den parrede vene, brug stump dissektion med en mikrosonde og nr. 5 pincet til at isolere et cirka 5 mm segment, ved at lede mikrosonde bag arterien, og med spidsen for at gøre en større forskel i uforarbejdet kløft mellem arterie og vene. Dette er forskellen gennem hvilken suturen kan trådes.
  10. Anvendelse 10-0 enkelt tråd sutur og nåleholderen sted en ligering rundt om foderet arterie (~ 70 um diameter) mod den proximale ende af det dissekerede segment under anvendelse af en kirurg knude. Place en yderligere ligering hen imod den distale ende af det dissekerede arterie segmentet med tilstrækkelig adskillelse mellem ligaturer at tillade transektion af arterien.
    1. Den lille skala i forbindelse med spinotrapezius foder arterie fører til øget kirurgisk vanskelighed, sammenlignet med ligering af et større fartøj, såsom femoralarterien. Uerfarne kirurger især vil have høje avulsion, utilsigtet hemorrhaging og andre kirurgiske komplikationer. Af særlig bekymring er vanskeligheden ved at identificere og skære den farveløse arterie efter flow er blevet hindret lige før skæring. Af disse grunde er at placere 2 ligaturer anbefales til dem uvant til proceduren, som kirurgen har en visuel guide til at lokalisere hvor man transektere arterien samt en bekræftelse af snittet med den let kan observeres adskillelse af de 2 ligaturer. Imidlertid kan en mere erfaren kirurg finde en enkelt ligatur tilstrækkelig, så længe de er i stand til klartidentificere og skar arterie nedstrøms for ligatur. Selv om denne teknik reducerer risikoen for utilsigtet nicking en nærliggende fartøj med den skarpe ligering sutur, er det ikke uden ulemper, herunder forøget vanskelighed med at bekræfte arterie blev transected.
  11. Kontrollere ligering ved at observere formindskelse af blodgennemstrømning (blokeret RBC kolonne) nedstrøms for ligeringsstedet (dvs. mod muskel).
  12. Brug dissekere saks transektere det ligerede arterie, mellem de to ligaturer. Hvis kun en ligatur blev placeret (11a), skåret med største omhu i nedstrømsretningen.
  13. Drug loaded plain-film (1 mm) kan placeres nedstrøms (caudalt) som en del af eksperimentelle procedure.
  14. Flyt fortrængte fascia og fedtvæv til deres oprindelige orientering.
  15. Luk hudincision med 8-0 ikke-resorberbare suturer. Derefter placere musen i en forberedt opvarmet recovery bur under observation og administrere en apmæssig analgetikum, såsom bupivacain, 0,02-0,05 ml 0,25% lokal infiltration.

2. Spinotrapezius intravital mikroskopi, in situ

  1. Bedøve musen i et induktionskammer med 3-4% isofluran fordampet i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 3-4 l · min-1.
    1. Anvendelsen af ​​inhalant anæstesi foretrækkes for funktionelle målinger, fordi der er mindre kardiovaskulær depression end med injicerbare anæstetika. Hvis inhalant anæstesi i ikke tilgængelige, langtidsvirkende injicerbare anæstetika, såsom natriumpentobarbital foretrækkes for at undgå gentagne injektioner, når dyret er blevet anbragt.
  2. Når bedøvet, løbende levere isofluran gennem en narkose maske (aka næse kegle) ved vedligeholdelse koncentrationer (almindeligvis ~ 2%) og flow rate på 0,5-1 l · min -1.
    1. Mus overvejende ventileres gennem deres nasale passager, så det er kun nøddige for at dække deres næse med anæstesi maske mellemgulvet.
  3. Hvis det er nødvendigt, fjerne hår fra bagsiden ved hjælp af trimning klippere og hårfjerningsmiddel.
  4. Transportere dyr til varmepude.
    1. Det er vigtigt at fastholde mus i en euthermic staten for at forhindre kold-induceret vasokonstriktion, hvilket kan opnås ved lamper, vand cirkulerende varme puder, microwavable opvarmer pads osv.
  5. Sæt rektal temperatursonde og indstille termo-controller til 35 ° C.
  6. Lave en incision i huden ved den kaudale ende af de spinotrapezius hjælp iris saks og standardmønster pincet.
  7. Forlæng snittet kranialt til fedtpuden, hvilket skaber en hestesko indsnit, og dække huden flap med plastfolie for at forhindre udtørring.
  8. Blunt dissekere det subkutane bindevæv med pincet og foråret saks for at maksimere synligheden.
  9. Placer stimulerende elektroder så tæt together som muligt, for at minimere størrelsen af ​​det aktuelle felt, og placere dem i den kaudale ende af den eksponerede musklen lige lateralt i forhold til rygsøjlen.
  10. Udfør en test stimulation for at bekræfte elektrode placering ved hjælp af en elektrode dataopsamlingssystem, elektrode stimulus isolator, og computer controller, med firkantede bølger af en 200 usek varighed, 2 mA amplitude, der leveres på 1 Hz.
  11. Anbring plastfolie over den blottede musklen for at forhindre udtørring.
  12. Begynd timing af en 30 min periode, hvor fartøjet diametre vil ækvilibrere.
  13. Placer intravital mikroskop over spinotrapezius musklen til at se den vaskulære arkitektur.
    1. Hvis du bruger en fordybelse linse, placere en dråbe PBS mellem det objektive og plastikfolie.
  14. Begyndende over de vigtigste arteriole (det største skib synlig), manipulere scenen i XY-planet for at finde skibet af interesse.
    1. Visualisering lille arterioles med reflekteret lys mikroskopi kræver større kontrast end fastsat af den røde-celle kolonne. Vi primært bruger en sidestrøm dark-field imaging mikroskop for at forbedre mikrovaskulær kontrast, men derimod kan også forbedres med et reflekteret lys fluorescerende mikroskop efter den intravenøse injektion af en høj molekylvægt fluorescerende dextran.
  15. Efter den 30-min ækvilibrering, tage et billede / video af skibet af interesse.
  16. Stimulere musklen med firkantbølger på 200 usek varighed, 2 mA amplitude, der leveres på 8 Hz, i 90 sekunder, som beskrevet ovenfor.
  17. Capture et andet billede / video umiddelbart efter stimulation og fortsætte med at fange hvert minut, indtil fartøjet er vendt tilbage til hvilende diameter, ~ 10 min.
  18. Gentag trin 6-18 med den kontralaterale muskel.
  19. Dataanalyse kan udføres i realtid med video calipre eller off-line med billedanalyse-software.
  20. Aflive musen følgerING IACUC protokol.

3. Spinotrapezius Tissue Harvest og Fiksering

  1. Bedøve mus ved intraperitoneal injektion, formulering som i Spinotrapezius Feed Artery Ligation trin 1.
  2. Lave et snit flere millimeter kranie til knoglefremspring af musens skulderblad hjælp iris saks og standard mønster pincet. Udvid snittet sideværts og derefter caudalt på begge sider.
  3. Slip huden fra dorsal torso ved forsigtigt afspejler huden og skære den overfladiske fascia.
  4. Brug stump dissektion for at fjerne dorsal fedtvæv under anvendelse af standard pincet, og derefter afspejle muskel og lignende dissekere ventrale fedtvæv.
  5. Fjern fascia overliggende musklen med pincet og saks fjeder. Dette trin kan være vanskelig og tidskrævende, men er vigtigt at forbedre immunfluorescensfarvning og billeddannelse. Holde vævet hydreret kan lette fjernelse af fascia.
  6. FindDen laterale kant af musklen, og bruge stump dissektion for at adskille spinotrapezius muskel fra fedtpuden der ligger ventrale til den.
  7. Fortsætte stump dissektion i et kraniel til haleretningen. Bemærk, at flere blodkar ind og ud denne ventrale overflade af musklen, hvis perfusion er påkrævet, bør den udføres før transecting disse fartøjer. Bemærk også, at i den kaudale halvdel af musklen, dens laterale grænser inserts i musklen liggende ventrale til den. Nogle skæring kan være nødvendigt langs denne grænse til helt definere og befri kanten.
  8. Udskære spinotrapezius muskel. Sådan gør du:
    1. Fri sidekanten af ​​musklen som beskrevet ovenfor.
    2. Skåret på tværs over musklen mest kraniel omfang.
    3. Skåret langs den mediale grænse (langs rygsøjlen), i sagittalplanet.
  9. Gentag proceduren trin 4-9 på den kontralaterale muskel, og derefter aflive mOuse ved en IACUC godkendt metode.
  10. Fastgør væv på gelatineovertrukne objektglas ved neddypning i afkølet methanol (4 ° C) eller i en 4% paraformaldehyd / deioniseret vandopløsning ved stuetemperatur i 20 minutter.
    1. Alternativt kan perfusion fiksering anvendes. Før trin 2 udføres en torakotomi, lave et snit i højre atrium, og perfundere vaskulatur med 5 ml 1 x Tris-bufret saltvand med 0,1 mM CaCI2 og 2% heparin gennem den venstre ventrikel, fulgt af 5 ml 4 % paraformaldehyd i fartøjets fiksering, og endelig 5 ml 1 x Tris-bufret saltvand med 0,1 mM CaCl2 7.
  11. Umiddelbart efter fiksering, vaskes prøven fire gange i 20 minutter hver ved hjælp af 0,01 M phosphatbufret saltvand (PBS) med 0,1% saponin.

Representative Results

En kirurgisk visning af hovedpulsåren fodring spinotrapezius muskel, der undergår ligering er vist i figur 1, med etiketter, interesseområder. Et eksempel konfokalt billede af den høstede og immunfarvet region af muskler placeret direkte nedstrøms for ligeret arterie en uge efter ligering er vist i figur 2A. Forstørret sikkerhedsstillelse arterioler indeholdende glat muskel alfa-actin udtrykker glatte muskelceller (rød) viser karakteristiske snoning efter ligering. Fartøjets snoning, rapporteret som forholdet mellem fartøjet vejlængde og ledningen afstand (dvs. linjen strækker sig over samme karbane slutpunkter), i den ligerede musklen (til højre) er forbedret i forhold til ikke-ligerede kontralaterale muskler (figur 2B, n = 8) . Figur 3 viser resultaterne af en pilotundersøgelse, hvor terminale arteriole funktionel vasodilatation blev målt under anvendelse af intravital mikroskopi. Som forventet arteriolær di ameter øger efter elektrisk stimulering-induceret muskelkontraktion.

Figur 1
Figur 1. Kirurgiske område af reflekteret spinotrapezius muskel og foder arterie. Foderet arterie ligeres på de to steder er angivet med A0. Mellem disse ligaturer og efter obstruktion af blodgennemstrømning, der arterien transected på stedet angivet ved A. Den målrettede segment af arterie overgange fra den ventrale fedtpude, beskrevet af C, i spinotrapezius muskel, beskrevet af D, på stedet angivet med arrow B. strømningsretning er angivet med stiplede pil E.

ghres.jpg "/>
Figur 2. Konfokal billede af spinotrapezius muskel mikrovaskulære netværk for pilotundersøgelse af snoning. (A) Høstet og hel-monteret muskel blev immunfarvet for glat muskel-alpha-actin og filmede med konfokal mikroskopi. Synsfeltet viser området af muskler placeret direkte nedstrøms for den ligerede arteriole 1 uge efter ligering. Bugtede kar er tydelige i musklen som følge af ligeringen (B) pilotundersøgelse Resultaterne viser signifikant forøget (p = 0,035, 1 halet Students t-test). Snoning udvises af mikrokar i den ligerede muskel som målt ved fartøjets vejlængde til ledningen afstand forhold til et forsøg på C57BL / 6 mus (n = 8) sammenlignet med kontralateral kontrol.

Figur 3
Figure 3. Intravital mikroskopi billeddannelse af funktionel vasodilation i spinotrapezius arterioler, in vivo. (A) Repræsentative mikrofotografier af spinotrapezius terminale arterioler i hvile (venstre) og umiddelbart efter ophør af 8 Hz muskelsammentrækning (til højre). (B) Terminal arteriole diameter i hvile ( 8,5 ± 0,5 um, venstre) og umiddelbart efter (11 ± 1 um, midten) 90 sek i muskelsammentrækning, hvilket betydeligt arteriolær diameter (p = 0,032, en-halet parret t-test) i Balb / C mus (n = 6). Procentvis ændring indiceret (til højre).

Discussion

Den murine spinotrapezius ligation model præsenteres her er en effektiv lille dyremodel til at studere de funktionelle og strukturelle tilpasninger, der skyldes en arteriel okklusion. Denne model er komplementær til den vidt udbredte bagben iskæmimodel 4, idet den tilvejebringer en hel-muskel billede af intakte mikrovaskulære netværk med høj rumlig opløsning. Endvidere, fordi denne muskel er placeret lige under den dorsale hud, er den tilgængelig for seriel billeddannelse med intravital mikroskopi, og til lokal lægemiddelafgivelse via superfusionssystem eller tynd film implantation 2. Disse funktioner gør det et attraktivt lille dyremodel, hvor at studere virkningerne af nye terapeutiske mål for vaskulær remodellering og funktionel vasodilation efter arteriel okklusion.

Bemærk, at forsigtighed bør udvises, når man sammenligner data erhvervet i spinotrapezius ligatur model til data indsamlet i bagbenet ligatur model på grund af flere nøgle differences. Først er de spinotrapezius muskler stabiliserende muskler, og de adskiller sig fra benmusklerne i form af funktion og fibertype distribution. Vores gruppe har tidligere påvist, at arteriolerne ligation i spinotrapezius muskel skaber mindre eller ubetydelig iltsvind i stammer med veludviklede sikkerhedsstillelse arteriolære netværk, sammenlignet med den hypoxi observeret i bagpote efter femoralarterien ligation i bagbenet model 1,8 - 10. Vi har også vist, at spinotrapezius ligation model giver en anden remodeling respons i Balb / c mus sammenlignet med C57BL / 6 mus, med Balb / c-mus net remodeling ved kapillær sikkerhedsstillelse og C57BL / 6 remodeling ved udvidelse af eksisterende arteriolære forbindelser 3. Der er en interessant parallel mellem disse observationer og oplysningerne i bagbenenes ligation modeller, hvor Balb / c-mus oplever en forlænget perfusion genopretning efter ligering sammenlignet med C57BL / 6 mus 9,11,12 </ Sup>. I andre modeller af vævsiskæmi, mus 13 år køn 14 og forekomsten af sygdommen 15 også påvirke de væv svar på arteriolær okklusion, selv om vi endnu ikke har testet disse prædiktorer i spinotrapezius ligation model.

For det andet er størrelsen af arterien, der er ligeret i spinotrapezius model er væsentlig mindre end den femorale arterie, og derfor ligeringen påvirker et mindre vævsvolumen, der er yderligere nedstrøms, dvs ved et lavere niveau af kredsløbet træet, i spinotrapezius sammenlignet med bagbenet 3. Derfor bør den anatomiske forskelle i placeringen af ligering i disse to modeller tages i betragtning, når man sammenligner de respektive fysiologiske reaktioner (f.eks vaskulær remodellering) til dette indgreb.

For det tredje kan tykkelse af spinotrapezius tillade oxygen at nå unperfused del af væv fra tilgrænsendevæv, sammenlignet med den kombinerede iskæmi og hypoksi i bagbenet model som anført ovenfor 3. For det fjerde genvinding af strømning til den del af de spinotrapezius nedstrøms for ligering er større end i bagbenet ligering. Den spinotrapezius ligation model er en enestående kronisk model og bør ikke forveksles med andre modeller af forbigående tillukning af blodkar eller modeller af iskæmisk reperfusionsbeskadigelse. Vi anser det for muligt at tilpasse denne model til at rumme disse typer af betingelser, men dette er uden for omfanget af det arbejde præsenteret heri. Endelig er vi advare mod direkte tilknytning præ-kliniske observationer i denne model til kliniske manifestationer af iskæmisk sygdom hos mennesker, især når der anvendes unge og ellers raske mus og på grund af de iboende fysiologiske grænser såsom højere puls 5. Ikke desto mindre betragter vi denne nye model som et værdifuldt redskab til at afdække grundlæggende mekanismer i vævsreaktioner til ligering og identificere potentielle denrapeutic mål i en in vivo indstilling.

Ud over de kirurgiske noter i spinotrapezius foder arterie ligatur procedure (anatomisk note (6a), adskille arterie fra venen (9a), og brug af en enkelt ligatur (11a)), et par andre aspekter af proceduren gavn af diskussion.

For det første er den indledende indsnit i den dorsale fedtpude kant (eller flere mm caudalt til skulderbladet, hvis transdermal visualisering ikke er mulig) ideelt gjort så lille som kirurgen er fortrolig med, og udvides under proceduren om nødvendigt. Denne praksis minimerer sutur kræves for at lukke snittet, som er praktisk for kirurgen, reducerer fremgangsmåden tid, og er også mindre irriterende for dyret under restitution. Alternativt kan en større hud indsnit være nødvendigt i forhold til kirurg præference, da musklen kan være lettere at finde med et udvidet felt. I dette tilfælde kan indsnittetdrage fordel af en hestesko form med en medial åbent ansigt for at tillade folde mod rygsøjlen. Samtidig med at hudincision og strækker sig gennem de sekundære hudlag, hvis et overfladefartøj er beskadiget og forårsager blødning, et let tryk med steril gaze og give tid til hæmostase.

Også at bemærke er det vigtigt at behandle vævet med det krævede minimum kraft, og så vidt muligt have med pincet tættere på musklens laterale kant og væk fra den tiltænkte iskæmiske zone. Denne praksis med til at undgå knusningsskade, hvilket kan føre til yderligere inflammatorisk-medierede vævsreaktioner, som kan forvirre vaskulær remodellering respons fremkaldt af den arterielle ligering.

Sammenfattende har vi vist, at brug af det murine spinotrapezius musklen som en kirurgisk model til at undersøge kar og væv reaktioner på arteriolær ligering. Denne model er velegnet til intravital vurdering af vaskulære ændringer (forEksempelvis funktionel vasodilation), og til ex vivo-vurdering af vaskulære ændringer (f.eks immunofluorescent afbildning og kvantificering af vaskulære netværk). Både prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at et individs respons på arteriolær obstruktion (fx via ligering hos mus eller atherosclerotiske plaques hos mennesker) afhænger af deres alder af tilstedeværelsen eller fraværet af sygdom (fx diabetes mellitus) diameteren af blokeret arterie , den genetiske sammensætning af individet, og metabolisk behov i vævet 11-15. Murine modeller, som den præsenteres her, benytte forskeren af ​​stamme-specifik anatomiske og genetiske forskelle og sygdomsspecifikke fænotyper, hvilket letter undersøgelse af disse komplicerede forhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender Kevin Macleod til brug af hans creative commons licens musik i den tilhørende video, herunder (i rækkefølge efter udseende) hans spor "Airport Lounge", "Baggrund" og "Evening Melodrama." Vi vil også gerne anerkende Ndubisi Okeke og Frederick Torstrick for deres assistance med kirurgi video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Murin Spinotrapezius Model til at vurdere virkningen af ​​arteriolær Ligering om Mikrovaskulære Funktion og Remodeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter