Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Murin Spinotrapezius modell för att bedöma effekten av arteriolär Ligering på Microvascular Funktion och Remodeling

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Vi visar en ny arteriell ligering modell i murin spinotrapezius muskel, inklusive en steg-för-steg och beskrivning av instrumentering som krävs. Vi beskriver operationen och relevanta mätningar utfall avseende vaskulär nätverk ombyggnad och funktionell vasodilatation med intravital och konfokalmikroskopi.

Abstract

Den murina spinotrapezius är en tunn, ytlig skelett stöd muskel som sträcker sig från T3 till L4, och är lätt åtkomliga via rygghuden snitt. Dess unika anatomi gör spinotrapezius användbara för undersökning av ischemisk skada och efterföljande mikrovaskulär ombyggnad. Här visar vi en arteriolär ligering modell i murina spinotrapezius muskeln som utvecklades av vår forskargrupp och tidigare publicerade 1-3. För vissa utsatta musstammar, såsom Balb / c-mus, skapar ligering operation tillförlitligt skelettmuskulaturen ischemi och fungerar som en plattform för att undersöka terapier som stimulerar revaskularisering. Metoder för bedömning är också visat, bland annat användning av intravital och konfokalmikroskopi. Den spinotrapezius lämpar sig väl för sådana imaging studier på grund av dess tillgänglighet (ytlig dorsala anatomi) och relativa tunnhet (60-200 nm). Den spinotrapezius muskeln kan monteras en face, vilket underlättaravbildning av hela muskler mikrovaskulära nätverk utan histologisk snittning. Vi beskriver användning av intravital mikroskopi att förvärva mått efter en funktionell vasodilatation förfarande, särskilt ökningen av arterilar diameter som en följd av muskelkontraktion. Vi visar också de förfaranden för skörd och fastställande av vävnader, en nödvändig förelöpare till immunfärgning studier och användning av konfokalmikroskopi.

Introduction

Djurmodeller av kronisk ischemi är värdefulla verktyg för att undersöka patofysiologin för ischemiska sjukdomar, såsom perifer kärlsjukdom, kranskärlssjukdom, och cerebrovaskulär sjukdom. Hos gnagare som hos människor leder arteriell ocklusion till strukturell omdaning av det vaskulära nätverket, inklusive arteriogenes och angiogenes. Hos friska och yngre patienter, kan denna ombyggnad vara tillräckligt för att rädda vävnad från ischemi-inducerad skada, men komorbiditet såsom diabetes kan allvarligt äventyra ombyggnad och återhämtning. Förstå mekanismerna bakom kärlremodellering händelser är viktigt för att utveckla behandlingar som stimulerar dessa endogena revaskularisering processer.

För närvarande är lårbensartären ligering eller resektion i bakbenet standard teknik för att studera kronisk ischemi-inducerad kärlremodellering i små djur 4,5. Analys av diametern, konnektivitet och reaktivitetde mikrokärl som utgör det vaskulära nätverket nedströms ligerade lårbensartären är dock svårt, beroende på tjockleken av musklerna. Vi har utvecklat en arteriolär ligering modell i mus spinotrapezius muskeln: ensidig ligering av den laterala foder artär i denna stabiliserande ryggmuskeln 1. De relativt tunna spinotrapezius (60-200 nm) är mottaglig för en face immunfärgning för bedömning av hela nätverkstopologi med encelliga upplösning, vilket gör en grundlig undersökning av kärlremodellering händelser över hela vävnaden. Den spinotrapezius är också ytlig och tillgänglig, och därmed dess fartyg är lätt iakttas av intravital mikroskopi, för effektiv karakterisering av effekterna av ombyggnad och arteriolär ligering på vaskulär reaktivitet.

I denna rapport beskriver vi i detalj och demonstrera mus spinotrapezius arteriolära ligering modell. Både in vivo och ex vivo migthods bedömning efter operation beskrivs, inklusive mätning av funktionell vasodilatation, som har visat sig vara nedsatt enligt ischemiska tillstånd 6, och immunofluorescerande avbildning av hela muskel mikrovaskulära nätverk. Vi inkluderar även resultaten av två separata pilotstudier att visa användbarheten av modellen. Först, utnyttjade vi den arteriella ligering modellen att inducera en statistiskt signifikant ökning i kärlet slingrighet i C57BL / 6 möss (Figur 2B). Slingrighet ökar under arteriogenes i arteriole säkerheter. I andra musstammar, som är mer utsatta för ischemi på grund av frånvaron av kollaterala arterioler (t.ex. Balb / c), är kapillär arterialization observeras 10. Kapillär arterialization detekteras av ökade diametrar och utveckling av α-glattmuskelaktin reaktivitet. Andra leder funktionell elektrisk stimulering av muskeln till vasodilation i terminal arterioler i spinotrapezioss (Figur 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius Feed Artery Ligation Kirurgi

  1. Söva mus genom intraperitoneal injektion. I en 0,5 ml spruta, formulera: 0,06 ml av 100 mg / ml Ketamine
    0,03 ml av 20,0 mg / ml Xylazin
    0,01 ml av 0,4 mg / ml Atropin
    0,30 ml av 0,9% saltlösning.
    Dos: 0,01 ml * per gram kroppsvikt, ip

* Dos variabel på musstam och lager, justera därefter så mus återhämtning inom en timme från induktion.

  1. Applicera standard oftalmisk salva för att förhindra uttorkning hornhinnan.
  2. Ta bort hår från baksidan med trimning Clippers, följt av korta tillämpning av hårborttagningskräm.
  3. Desinficera kirurgiska området med klorhexidin eller povidon-jod. Alternativa povidon-jod med etanol tre gånger, slutar med povidonjod.
  4. Överför musen till den tidigare beredda kirurgiska arbetsyta, med värmedynan och steril draperingpå plats.
  5. Skapa en linjär snitt (3-5 mm) genom den dorsala huden ungefär 5 mm kaudalt om benutskott av skulderbladet med iris sax och vanliga pincett mönster (t.ex. FST, 11.271-30) genom tälta vävnaden och skära parallellt med ryggrad. Målet incisionsstället kan identifieras genom transdermal visualisering av den dorsala fettkudden om tillstånd hudpigmentering, skuren vid kaudala gräns fettkudden. Expandera snittet som behövs, och sträcker sig genom sekundära hudlagren med Spring sax.
    1. Anatomisk Obs - Den spinotrapezius muskeln ligger dorsalt och sträcker sig från T4 till L3 längs båda sidor av ryggraden. Den främre gränsen sträcker sig i sidled till ungefär skulderbladen. Muskeln avsmalnar i den kaudala riktningen så att den mest bakre gränsen ligger medialt till den främre gränsen, och bestämmer i jämnhöjd med ryggraden. Två fett kuddar är också viktigt att notera, om direkt dorsala och ventrala till spinotrapeziusmuskel mot den kraniala halv.
    2. Inflammation på grund av snittet har visat sig ha någon effekt på den kärlremodellering responsen, som bluff ligering kirurgi uppvisade ingen förändring i remodellering av spinotrapezius vaskulaturen. Två rumsliga faktorer bidrar till detta resultat. Först snittet avlägsnas genom 5 mm i den kraniala riktningen från regionen av intresse där den vaskulära responsen i muskeln typiskt undersöks. Dessutom är snittstället på den dorsala huden separeras från kärlet ligeringsstället genom en ventral fettkudden som ligger på toppen av den kraniala tredjedelen av spinotrapezius muskeln.
  6. Skölj snittet med uppvärmda Ringers lösning för att förhindra muskel uttorkning. Tillämpning av vasodilatorer såsom papaverin hjälper att visualisera målet artären för ligering.
  7. Under ett dissektionsmikroskop använder pincett för att trubba dissekera och separera (men inte ta bort) den dorsala vita fett pad från den underliggande Muscular vävnad för att visualisera vaskulaturen när den går in och lämnar spinotrapezius på sin sidokant.
  8. Leta upp mål artär, som tillsammans med en eller två parade vener, passerar genom fettkudden som är ventralt till spinotrapezius på väg in till den laterala kanten av muskeln. Denna artär matar en väsentlig del av den kaudala delen av muskeln, vilket kan bekräftas genom att reflektera och ersätta muskeln att observera bana artären i muskeln. Målplatsen för ligering är det segment av artären lämnar ventrala fettkudden och in i muskeln, och är helt tillgänglig i denna region. Artären-ven paret kan behöva försiktigt separeras från den ventrala fettkudden i denna region. Observera att spinotrapezius matas av flera artär-ven par, inklusive fartyg som tvärgående antingen de dorsala och ventrala fettkuddarna. Se till att inte störa dessa fartyg.
    1. Flera indikatorer kan användas för att särskilja artärfrån ven. En av de bästa metoderna är att försiktigt hindra blodflödet med mikrosondanalys och flytta uppströms från muskeln, flöde kommer inte att återupptas i artären tills hindret släpps. Färg kan också användas, såsom ven väggar innehåller en vitaktig hölje av bindväv som artärer saknar. Vidare kan man tänka diametern före applicering av vasodilator som vener är typiskt större i storlek.
  9. Artären är typiskt i nära närhet till dess parade ven; använda trubbig dissektion med en mikrosond och # 5 pincett för att isolera en ca 5 mm segment, genom att föra mikrosondanalys bakom artären, och med hjälp av spetsen för att göra en bredare gap i den naturliga klyftan mellan artär och ven. Detta är den öppning genom vilken suturen skall gängas.
  10. Med användning 10-0 enda tråd sutur och nålhållaren plats en ligering runt fodret artären (~ 70 | im diameter) mot den proximala änden av den dissekerade segmentet med en kirurgs knut. Place ytterligare ligering mot den distala änden av den dissekerade artären segmentet, med tillräcklig separation mellan ligaturer för att tillåta transektion av artären.
    1. Den småskaliga associerad med spinotrapezius matning artären leder till ökad kirurgisk svårighet, jämfört med ligering av ett större kärl, såsom femoralartären. Oerfarna kirurger särskilt har höga avulsion, oavsiktlig blödning och andra kirurgiska komplikationer. Särskilt oroande är att det är svårt att identifiera och minska den färglösa artären efter flöde har hindrat strax före skärning. Av dessa skäl ställer 2 ligaturer rekommenderas för dem ovana förfarandet, eftersom kirurgen har en visuell guide att hitta var för tvärsnitt artären samt en bekräftelse av snittet med lätt observerbara separation av 2 ligaturer. Emellertid kan en mera erfaren kirurg hitta en enda ligatur tillräcklig, så länge som de har förmåga att tydligtidentifiera och skär artären nedströms ligaturen. Medan denna teknik minskar risken för oavsiktligt nicking en närliggande kärl med den vassa ligering suturen, är det inte utan nackdelar, inklusive ökad svårighet att bekräfta artären transekterades.
  11. Verifiera ligering genom att observera minskningen av blodflödet (hindras RBC kolonn) nedströms om ligeringsstället (dvs mot muskeln).
  12. Använda dissekera sax transekt den ligerade artären, mellan de två ligaturer. Om endast en ligatur placerades (11a), skär med stor försiktighet i nedströms riktning.
  13. Läkemedel laddad vanlig film (1 mm) kan placeras nedströms (kaudalt) som en del av experimentell procedur.
  14. Flytta den undanträngda fascia och fettvävnad till sin ursprungliga orientering.
  15. Stäng huden snitt med 8-0 icke-resorberbara suturer. Placera sedan muspekaren i ett förberett uppvärmd återhämtning bur under observation och administrera en APändamålsenliga smärtstillande såsom bupivakain, 0,02-0,05 ml 0,25% lokal infiltration.

2. Spinotrapezius intravital Mikroskopi, in situ

  1. Söva musen i en induktionskammare med 3-4% isofluran förångas i 100% syre vid en flödeshastighet av 3-4 L · min -1.
    1. Användningen av inhalationsmedel anestesi är att föredra för funktionella mätningar eftersom det finns mindre kardiovaskulär depression än med injicerbara anestetika. Om inhalant anestesi i inte tillgängliga, långverkande injicerbara anestetika, såsom natrium pentobarbital föredras för att undvika upprepade injektioner när djuret har placerats.
  2. När sövda, ständigt leverera isofluran genom anestesi mask (aka noskon) vid underhåll koncentrationer (vanligtvis ~ 2%) och flöde av 0,5-1 L · min -1.
    1. Möss huvudsakligen ventilera genom sina näsgångar, så det är bara NECdiga för att täcka sin näsa med anestesi masken membran.
  3. Om det behövs, ta bort hår från baksidan med trimning Clippers och hårborttagningskräm.
  4. Transportera djuret till värmedyna.
    1. Det är viktigt att hålla möss i en euthermic tillstånd att förhindra att kall-inducerad vasokonstriktion, vilket kan åstadkommas genom lampor, vatten cirkulerande värme kuddar, värmer microwavable kuddar etc.
  5. Sätt den rektala temperaturen sonden och ställa termo-regulator till 35 ° C.
  6. Gör en hud snitt vid kaudala änden av spinotrapezius med iris sax och standard pincett mönster.
  7. Förläng snittet kranialt till fettkudden, skapar en snitt hästsko, och täcka huden luckan med plastfolie för att förhindra uttorkning.
  8. Trubbiga dissekera den subkutana bindväven med pincett och sax våren för att maximera synligheten.
  9. Placera stimulerande elektroder så nära together som möjligt, för att minimera storleken på det aktuella fältet, och placera dem i den kaudala änden av den exponerade muskeln bara lateralt till ryggraden.
  10. Utför ett test stimulering för att bekräfta elektrodplacering med ett elektrodsystem datainsamling, elektrod stimulans isolator, och dator styrenhet, med fyrkantiga vågor av en 200 ^ sek varaktighet, 2 mA amplitud, levereras vid 1 Hz.
  11. Placera plastfolie över den exponerade muskler för att förhindra uttorkning.
  12. Börja ta tid en 30 min period under vilken fartyget diametrar kommer jämvikt.
  13. Placera intravital mikroskopet över spinotrapezius muskeln att visa vaskulära arkitektur.
    1. Om du använder en nedsänkning lins, placera en droppe PBS mellan målet och plastfolie.
  14. Starta ovanför den viktigaste arteriolen (den största kärlet synlig), manipulera steget i XY-planet för att lokalisera kärlet av intresse.
    1. Visualisera små arterioles med reflekterat ljus mikroskopi kräver större kontrast än tillhandahålls av röda celler kolumn. Vi använder oss främst en sidoström mörkfält avbildning mikroskop för att förbättra mikrovaskulär kontrast, men kontrasten kan också förbättras med en reflekterad ljus fluorescerande mikroskop efter intravenös injektion av en hög molekylvikt fluorescerande dextran.
  15. Efter 30-minuter jämvikt, ta en bild / video av fartyget av intresse.
  16. Stimulera muskler med fyrkantiga vågor på 200 ^ sek varaktighet, 2 mA amplitud, levereras vid 8 Hz, under 90 sekunder, såsom beskrivits ovan.
  17. Fånga en annan bild / video omedelbart efter stimulering och fortsätter att fånga varje minut tills fartyget har återvänt till den vilande diameter ~ 10 min.
  18. Upprepa steg 6-18 använder kontralaterala muskeln.
  19. Dataanalys kan utföras i realtid med video bromsok eller off-line med bildanalys programvara.
  20. Avliva musen följerning IACUC protokollet.

3. Spinotrapezius Tissue Harvest och fixering

  1. Söva möss genom intraperitoneal injektion, formulering som i Spinotrapezius Feed Artery Ligation steg 1.
  2. Gör ett snitt flera millimeter kraniella den benutskott av musens skulderblad med iris sax och standard pincett mönster. Expandera snittet sidled och sedan kaudalt på båda sidor.
  3. Släpp huden från dorsala torso genom att försiktigt speglar huden och skära den ytliga fascian.
  4. Använd trubbig dissektion för att ta bort ryggen fettvävnad med vanliga pincett, och sedan spegla muskler och liknande dissekera ventrala fettvävnad.
  5. Ta fascia överliggande muskeln med pincett och sax våren. Detta steg kan vara svårt och tidskrävande, men är viktigt att förbättra immunfluorescensfärgning och avbildning. Hålla vävnaden hydrerad kan underlätta avlägsnande av fascia.
  6. Letaden laterala kanten av muskeln, och använda trubbig dissektion för att separera spinotrapezius muskler från fettkudden som ligger ventralt den.
  7. Fortsätt trubbig dissektion i en kranial till kaudal riktning. Observera att flera blodkärl in och lämna denna ventrala yta av muskeln, om perfusionen krävs, bör den utföras innan transecting dessa fartyg. Notera också att i den kaudala delen av muskeln, dess laterala gränser skär i muskeln ligger ventrala till den. Viss kapning kan krävas längs denna gräns att helt definiera och befria kanten.
  8. Excise den spinotrapezius muskeln. Gör så här:
    1. Fri sidokanten av muskeln som beskrivits ovan.
    2. Skär tvärs över muskeln mest kraniala utsträckning.
    3. Klipp längs den mediala gränsen (längs ryggraden), i sagittalplanet.
  9. Upprepa proceduren steg 4-9 på den kontralaterala muskeln och sedan avliva på mOuse av en godkänd IACUC metod.
  10. Fäst vävnader på gelatinbelagda objektglas genom nedsänkning i kyld metanol (4 ° C) eller i en 4% paraformaldehyd / avjoniserat vatten-lösning vid rumstemperatur under 20 minuter.
    1. Alternativt, kan perfusion fixering användas. Före steg 2, utför en torakotomi, göra ett snitt i höger förmak, och perfundera kärlsystem med 5 ml 1 x Tris-buffrad saltlösning med 0,1 mM CaClj 2 och 2% heparin genom den vänstra ventrikeln, följt av 5 ml av 4 % paraformaldehyd för fixering fartyg, och slutligen 5 ml 1 x Tris-buffrad saltlösning med 0,1 mM CaCla 2 7.
  11. Omedelbart efter fixering, tvätta provet fyra gånger under 20 min vardera med 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,1% saponin.

Representative Results

Ett kirurgiskt syn på pulsådern matar spinotrapezius muskler som genomgår ligering visas i figur 1, med etiketter som anger områden av intresse. Ett exempel konfokal bild av den skördade och immunfärgades område av muskel belägen direkt nedströms från den ligerade artären en vecka efter ligering visas i figur 2A. Förstorade säkerheter arterioler innehållande glattmuskel a-aktin uttryckande glatta muskelceller (röd) uppvisar karakteristiska slingrighet efter ligering. Fartyg slingrighet, redovisas som förhållandet mellan fartygets våglängd och sladd avstånd (dvs linje som sträcker sig över samma effektmått fartyg väg), i den ligerade muskeln (till höger) är förbättrad i förhållande till oligerade kontralaterala muskeln (Figur 2B, n = 8) . Figur 3 visar resultaten av en pilotstudie i vilken terminal arteriol funktionell vasodilatation mättes med användning intravital mikroskopi. Som väntat, arteriolär di ameter ökar betydligt efter elektrisk stimulering-inducerad muskelkontraktion.

Figur 1
Figur 1. Kirurgisk område reflekterat spinotrapezius muskler och foder artär. Inmatningen artären ligeras vid de två platser som angivits av A0. Mellan dessa ligaturer och efter obstruktion av blodflödet är artären transekterades på platsen som anges av A. riktade segmentet av artären övergångar från den ventrala fettkudden, beskrivs av C i spinotrapezius muskeln, beskrivs av D på platsen visade med pil B. Flow riktning anges med streckade pilen E.

ghres.jpg "/>
Figur 2. Konfokal bild av spinotrapezius muskel mikrovaskulära nätverk för pilotstudie av slingrighet. (A) skördades och hel-monterade muskeln immunfärgades för glatt muskulatur alfa-aktin och avbildas med konfokalmikroskopi. Synfältet visar området av muskel belägen direkt nedströms ligerade arteriolen 1 vecka efter ligering. Slingriga kärl är uppenbara i muskeln som följd av ligeringen (B) Förstudie Resultaten visar signifikant ökad (p = 0,035, 1 svansad Students t-test). Slingrighet uppvisas av mikrokärl i den ligerade muskeln mätt genom fartygets banlängd till sladd avstånd förhållandet för en prövning av C57BL / 6 möss (n = 8) jämfört med kontralaterala kontroll.

Figur 3
Figure 3. Intravital mikroskopi avbildning av funktionell vasodilatation i spinotrapezius arterioler, in vivo. (A) Representativa mikrofoton av spinotrapezius terminal arterioler i vila (till vänster) och omedelbart efter upphörandet av 8 Hz muskelkontraktion (höger). (B) terminal arteriole diameter vid vila ( 8,5 ± 0,5 nm, vänster) och omedelbart efter (11 ± 1 um, mitt) 90 sek av muskelkontraktion, som ökade arteriolär diameter (p = 0,032, 1-tailed parat t-test) i Balb / C-möss (n = 6). Procentuell förändring anges (till höger).

Discussion

Den murina spinotrapezius ligering modell som presenteras här är ett effektivt liten djurmodell för att studera de funktionella och strukturella anpassningar som följer av en arteriell ocklusion. Denna modell är komplementär till utbredd bakben ischemi modell 4, genom att det ger en hel-muskel vy av intakta mikrovaskulära nät med hög rumslig upplösning. Dessutom, eftersom denna muskel ligger precis under den dorsala huden, är det tillgängligt för seriell avbildning med intravital mikroskopi, och till lokal läkemedelstillförsel genom superfusion eller tunn film implantation 2. Dessa funktioner gör det till en tilltalande liten djurmodell för att studera effekterna av nya terapeutiska mål för kärlremodellering och funktionell vasodilatation efter arteriell ocklusion.

Observera att försiktighet bör användas när man jämför data som förvärvats i spinotrapezius lige-modellen till data som förvärvats i bakben lige-modellen på grund av flera viktiga differences. Först är de spinotrapezius musklerna stabiliserande muskler, och de skiljer sig från benmusklerna när det gäller funktion och fibertyp distributionen. Vår grupp har tidigare visat att arteriolär ligering i spinotrapezius muskeln skapar mindre eller försumbar hypoxi i stammar med välutvecklade nätverk säkerheter arteriolära, jämfört med syrebrist observerades i baktassen efter femoralartären ligering i bakben modell 1,8 - 10. Vi har också visat att den spinotrapezius ligering modellen producerar en annan ombyggnad svar i Balb / c-möss jämfört med C57BL / 6 möss, med Balb / c-möss nätverk remodellering genom kapillärverkan collateralization och C57BL / 6 remodellering av utvidgningen av befintliga arteriolära förbindelser 3. Det finns en intressant parallell mellan dessa iakttagelser och de görs i bakbenen ligering modeller, där Balb / c-möss upplever en förlängd perfusion återhämtning efter ligering jämfört med C57BL / 6 möss 9,11,12 </ Sup>. I andra modeller av vävnadsischemi, mus ålder 13 kön 14 och närvaron av sjukdomen 15 också att påverka vävnader svar på arteriolär ocklusion, även om vi ännu inte har testat dessa prediktorer i spinotrapezius ligering modellen.

Det andra är storleken på artären som ligeras i spinotrapezius modellen väsentligt mindre än den femorala artären, och därför påverkar ligeringen en mindre vävnadsvolym som är längre nedströms, dvs en lägre nivå i cirkulationssystemet trädet, i spinotrapezius jämfört med bakbenet 3. Därför bör den anatomiska skillnaden i placeringen av ligering i dessa två modeller beaktas när man jämför respektive fysiologiska responser (t ex vaskulär remodellering) till detta ingripande.

Tredje kan tunnhet av spinotrapezius tillåta syre att nå unperfused delen av vävnaden från angränsandevävnad, jämfört med den kombinerade ischemi och hypoxi i bakben modellen enligt ovan 3. Det fjärde, är återvinningen av flödet till den del av den spinotrapezius nedströms ligeringen snabbare än i bakben ligering. Den spinotrapezius ligering modellen är en unik kronisk modell och bör inte förväxlas med andra modeller av övergående arteriell ocklusion eller modeller av ischemi reperfusionsskada. Vi anser att det är möjligt att anpassa denna modell för att tillgodose dessa typer av förhållanden, men det är utanför omfattningen av arbetet som presenteras här. Slutligen varnar vi mot direkt samband prekliniska observationer i denna modell till kliniska manifestationer av ischemisk sjukdom hos människor, speciellt när man använder unga och i övrigt friska möss och på grund av de inneboende fysiologiska begränsningar såsom högre hjärtfrekvens 5. Ändå ser vi denna nya modell som ett värdefullt verktyg för att avslöja grundläggande mekanismer vävnad svar på ligering och identifiera potentialrapeutic mål i en in vivo-miljö.

Förutom de kirurgiska noter som avses i spinotrapezius foder artär ligation förfarande (anatomisk anmärkning (6a), skilja artären från ven (9a), och användning av en enda ligatur (11a)), några andra aspekter av förfarandet nytta diskussion.

Först den inledande snitt över den dorsala fettkudden gränsen (eller flera mm kaudalt till skulderbladen, om transdermal visualisering inte är möjligt) idealt göras så liten som kirurgen är bekväm med, och expanderade under förfarandet om det behövs. Denna praxis minimerar suturering som krävs för att stänga snittet, vilket är praktiskt för kirurgen, minskar procedur tid och är också mindre irriterande för djuret under återhämtning. Alternativt, kan en större hudsnitt vara lämpligt enligt kirurg önskemål, eftersom muskeln kan vara lättare att lokalisera med en expanderad fält. I detta fall, snittet kandra nytta av en hästsko form med en medial öppet ansikte så att vikning mot ryggraden. Samtidigt göra huden snitt och som sträcker sig genom de sekundära hudskikten, om ett ytfartyg skadas och orsakar blödningar, använd lätt tryck med steril gasväv och ge tid för hemostas.

Också av notera är det viktigt att hantera vävnaden med ett minimum kraft och om möjligt hålla med pincett närmare muskeln i sidled gränsen och bort från den avsedda ischemisk zonen. Denna praxis bidrar till att undvika krosskada, vilket kan leda till ytterligare inflammatoriska-medierade vävnadssvar som kan förbrylla kärlremodellering responsen framkallad av den arteriella ligering.

Sammanfattningsvis har vi visat användning av murina spinotrapezius muskler som en kirurgisk modell för att undersöka vaskulära och vävnader svar på arteriolär ligering. Denna modell är lämplig för intravital bedömning av kärlförändringar (förExempelvis funktionella vasodilatation), och för ex vivo-bedömning av kärlförändringar (t.ex. immunofluorescerande avbildning och kvantifiering av vaskulära nätverk). Både prekliniska och kliniska studier har visat att en individs reaktion på arteriolär obstruktion (t.ex. via ligering hos möss eller aterosklerotiska plack hos människa) är beroende på deras ålder närvaro eller frånvaro av sjukdom (t.ex. diabetes mellitus) diametern på den blockeras artären , den genetiska sammansättningen hos individen, och den metaboliska efterfrågan hos vävnaden 11-15. Musmodeller, såsom en som presenteras här, utnyttja forskaren av stamspecifika anatomiska och genetiska skillnader och sjukdomsspecifika fenotyper, vilket underlättar utredning av dessa komplexa förhållanden.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner Kevin Macleod för användning av hans kreativa allmänningar licensierad musik i den tillhörande video, inklusive (i beställa av utseendemässigt) hans spår "Airport Lounge", "Bakgrund" och "Evening Melodrama." Vi vill också erkänna Ndubisi Okeke och Frederick Torstrick för deras hjälp med operationen videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Murin Spinotrapezius modell för att bedöma effekten av arteriolär Ligering på Microvascular Funktion och Remodeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter