L'utilisation des puces à protéines de phase inversée (RPPA) Variation à explorer l'expression des protéines dans les cancers à cellules rénales individuels
Summary
APPR permet l'expression de la protéine de centaines d'échantillons, imprimés sur des lames de nitrocellulose pour être interrogé simultanément, en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. Cette technique a été appliquée pour étudier l'effet de l'hétérogénéité traitement de la toxicomanie au sein de cellules de carcinome rénal clair.
Abstract
Actuellement, il n'existe pas de traitement curatif pour le cancer métastatique rénal à cellules claires, la plus fréquente variante de la maladie. Un élément clé de cette résistance au traitement est pensé pour être la complexité moléculaire de la maladie 1. Thérapie ciblée telle que l'inhibiteur de tyrosine kinase (TKI)-sunitinib ont été utilisés, mais seulement 40% des patients répondent, avec l'écrasante majorité de ces patients rechutent dans les 1 an 2. En tant que tel la question de la résistance intrinsèque et acquise en rénaux de cellules de cancer est très pertinente 3.
Afin d'étudier la résistance aux TKI, avec l'objectif ultime de développer des traitements efficaces et personnalisés, les tissus séquentielle après une période spécifique de la thérapie ciblée est nécessaire, une approche qui a fait ses preuves dans la leucémie myéloïde chronique 4. Toutefois, l'application d'une telle stratégie dans le carcinome rénal est compliquée par le niveau élevé de both hétérogénéité inter-et intra-tumorale, ce qui est une caractéristique de carcinome à cellules rénales 5,6 ainsi que d'autres tumeurs solides 7. Intertumoral hétérogénéité due à des différences transcriptomiques et génétique est bien établie, même chez les patients avec une présentation similaire, le stade et le grade de la tumeur. En outre, il est clair qu'il ya un grand morphologique (intratumorale) l'hétérogénéité des RCC, qui est susceptible de représenter encore plus grande hétérogénéité moléculaire. La cartographie détaillée et la catégorisation des tumeurs RCC par l'analyse morphologique combiné et le classement Fuhrman permet de sélectionner des zones représentatives pour l'analyse protéomique.
L'analyse des protéines à base de RCC 8 est attrayant en raison de sa grande disponibilité dans les laboratoires de pathologie, mais son application peut être problématique en raison de la disponibilité limitée d'anticorps spécifiques 9. En raison de la nature de dot blot des protéines de phase inversée Arrays (RPPA), la spécificité des anticorps doit be pré-validés, comme le contrôle de qualité strict de tels anticorps utilisés sont d'une importance primordiale. Malgré cette limitation, le format dot blot ne permettent la miniaturisation test, ce qui permet l'impression des centaines d'échantillons sur une lame de nitrocellulose seule. Diapositives imprimées peuvent ensuite être analysées d'une manière similaire à l'analyse de l'Ouest à l'utilisation des cibles des anticorps primaires spécifiques et marquées par fluorescence des anticorps secondaires, ce qui permet de multiplexage. L'expression différentielle des protéines dans tous les échantillons sur une lame peut alors être analysés simultanément en comparant le niveau relatif de la fluorescence d'une manière plus rentable et à haut débit.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici RPPA représente une alternative à haut débit pour la technique de transfert de débit largement utilisé, mais relativement faible ouest de l'analyse des protéines. La méthode permet à des centaines d'échantillons à être semi-quantitativement analysées et comparées simultanément permettant une comparaison directe des protéines clés à travers une large sélection de lignées cellulaires et des échantillons de tissus. Multiplexer avec les espèces différentes d'anti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail des auteurs FCO, DF, JN, DJH et GDS mentionné ci-dessus est financé par le Bureau du scientifique en chef, numéro d'obtention: ETM37 et soutenu par le Centre du Cancer Research UK médecine expérimentale du cancer. Le travail de AL est financé par le Collège royal des chirurgiens d'Edimbourg Robertson fiducie, la Fiducie Melville pour le soin et la guérison du cancer et le Conseil de recherches médicales. IO est pris en charge par la Société royale d'Edimbourg de la bourse du gouvernement écossais cofinancé par les actions Marie Curie et le UK Medical Research Council. Les auteurs tiennent à remercier SCOTRRCC co-candidats et des collaborateurs pour leurs discussions fructueuses sur quelques-uns des sujets abordés dans ce document.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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