RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.
Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de 1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año 2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante 3.
Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica 4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales 5,6, así como otros tumores sólidos 7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico.
El análisis de proteínas basado en 8 de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos 9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.
El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aume…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo de los autores FCO, DF, JN, DJH y GDS se ha mencionado anteriormente es financiado por la Oficina de Director Científico, el número de concesión: ETM37 y apoyado por el Centro de Cáncer Research UK Medicina Experimental del Cáncer. La obra de AL es financiado por el Colegio Real de Cirujanos de Edimburgo Robertson Trust, el Fideicomiso de Melville para el cuidado y la cura del cáncer y el Consejo de Investigación Médica. IO es apoyado por una beca de la Royal Society de Edimburgo Gobierno escocés cofinanciado por las acciones Marie Curie y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido. Los autores desean agradecer a SCOTRRCC cosolicitantes y colaboradores por sus útiles debates sobre algunos de los temas tratados en este documento.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
aprotinin | Sigma | A6279 |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
TissueLyser | Qiagen | 85600 |
MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |