Hurtige kolorimetriske analyser til kvalitativ Skelne RNA og DNA i Biomolekylær Samples

Summary

En suite af kolorimetriske assays er beskrevet for hurtigt skelne protein, RNA, DNA, og re-duktion sukker i potentielt heterogene biomolekylære prøver.

Abstract

Biochemical eksperimenter kræver sædvanligvis præcis viden, på et tidligt stadium, af nukleinsyre, protein og andre biomolekylære komponenter i potentielt heterogene prøver. Nukleinsyrer kan detekteres via adskillige etablerede metoder, herunder analytiske metoder, som er spektrofotometrisk (f.eks A _260), fluorometriske (fx binding af fluorescerende farvestoffer) eller kolorimetriske (nukleosid-specifikke chromogene kemiske reaktioner). ^En Selv om det ikke kan let at skelne RNA fra DNA, A ₂₆₀ / _A280-forhold er almindeligt anvendt, da det giver en enkel og hurtig ^to vurdering af den relative indhold af nukleinsyre, der absorberer overvejende i nærheden af 260 nm og protein, der absorberer hovedsagelig nær 280 nm. Forhold <0,8 tages som indikation af "rene" protein prøver, medens ren nukleinsyre (NA) er kendetegnet ved forhold> 1,5 ^3.

However, der situationer, hvor protein / NA indhold kan ikke så klart eller pålideligt udledes simple UV-vis spektrofotometriske målinger. For eksempel prøver (i) kan indeholde et eller flere proteiner, som er relativt fri for de aromatiske aminosyrer er ansvarlige for absorption ved ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), som det er tilfældet med nogle små RNA-bindende proteiner, og (ii) prøver kan udvise mellemliggende A ₂₆₀ / _A280-forhold (~ 0,8 <~ 1.5), hvor protein / NA indhold er langt mindre klar og kan endog afspejle en høj affinitet associering mellem proteinet og NA komponenter. Til sådanne scenarier, beskriver vi heri en suite af kolorimetriske analyser til hurtigt at skelne RNA, DNA og reducerende sukkerarter i en potentielt blandede prøve af biomolekyler. Metoderne er afhængige af forskellig sensitivitet af pentoser og andre kulhydrater til Benedikts, Bial s (orcinol), og Dische s (diphenylamin) reagenser, de strømlinede protokoller kan være comafsluttet i løbet af få minutter, uden nogen yderligere trin der til isolering af bestanddelene. Assayene kan udføres parallelt for at skelne mellem RNA og DNA, samt angive tilstedeværelsen af frie reducerende sukkerarter, såsom glucose, fructose og ribose (Figur 1).

Introduction

Meget af cellebiologi sker via molekylære interaktioner, der involverer DNA og RNA. ^Fire Disse naturligt forekommende nukleinsyrer (NK) interagerer med hinanden, ⁵ med proteiner, ⁶ og med en række små molekyler og ligander in vivo (f.eks divalente kationer ^7). Samspillet kan være kort eller lang levetid (kinetisk), kan variere fra høj til moderat til lav affinitet (termodynamisk styrke), og kan også udvise betydelig variation i kemiske egenskaber og specificitet - nogle foreninger er meget specifikke (f.eks DNA · · · transkriptionsfaktorer, RNA · · · splejsningsfaktorer), mens andre interaktioner er nødvendigvis langt mere generisk (f.eks DNA · · · bakterielle histon-lignende HU-proteiner ^8). Ikke-specifikke interaktioner med NAS kan få praktiske konsekvenser for in vitro forsøg med blandinger af biomolecules, da det er muligt, og endda sandsynligt, at nogle kontorer vil associere med de biomolekyler af interesse, i det mindste under en vis delmængde af de eksperimentelle betingelser, som anvendes (ionstyrke, pH, osv.).

Overvej for eksempel produktion af et protein af interesse (POI) via heterolog overekspression af det rekombinante protein i Escherichia coli-cellekultur; sådan procedure udføres rutinemæssigt i stort set alle strukturel biologi lab ⁹ I forberedelse til yderligere eksperimenter, f.eks. som biokemisk / biofysisk karakterisering, krystallisering osv., indledende bestræbelser normalt fokusere på at opnå en tilstrækkelig mængde af POI i så ren en form som muligt, helst som en kemisk homogen og biofysisk monodispers prøve. Efter afbrydelse af værtsceller, sigter de tidlige stadier af en typisk oprensning workflow at isolere POI fra E. coli-proteiner, nukleinsyrer, cell wall debris,og andre komponenter i det cellulære lysat. Imidlertid kan host kontorer co-oprenses med POI flere fysisk-kemiske grunde - et stærkt basisk POI kan ikke-specifikt pull-down host DNA / RNA, POI kan have en generisk NA-bindende aktivitet (f.eks ovennævnte HU); POI kan være temmelig specifikke NA-bindende protein, men udviser krydsreaktivitet med værts-RNA'er eller DNA'er, host NA'er kan reagere med en kromatografi-matrix og derved simpelthen co-elueres med POI, og så videre. Vilkårlig, højaffinitetsbinding af vært NA til et IP kan udgøre et irriterende problem, fordi NA urenheder sandsynligvis vil forstyrre efterfølgende eksperimenter (for eksempel fluorescens-anisotropi assays af POI • RNA-binding ^10). Alternativt uventet POI · · · NA foreninger også kan ses tilfældigt, da sådanne interaktioner belyse POI nukleinsyre-bindende kapacitet. Uanset hvad, uanset om kontorer er centrale elementer eller forurenende stoffer, må man først kvantificere ogidentificere typen (DNA, RNA) af co-oprensning NA'er som forberedelse til efterfølgende eksperimenter.

Adskillige analytiske metoder eksisterer til detektion og kvantificering NA i en prøve. De fleste af de tilgængelige fremgangsmåder er grundlæggende enten spektrofotometrisk (fx en ₂₆₀ absorbansværdier og A ₂₆₀ / A _{280-forhold),} fluorometriske (fx binding af thiazol orange eller andre fluorescerende farvestoffer til NA) eller kolorimetriske (følsomhed af nucleosider til kemiske reaktioner at udbyttet kromoforer absorberer i UV-VIS område af det elektromagnetiske spektrum), som for nylig beskrevet af De Mey et al. ^1. Men det afgørende trin for at identificere, hvilken type polynukleotid som RNA eller DNA er uden for mange af disse kvantificering fremgangsmåder. Her giver vi et sæt kolorimetriske assays til hurtigt at identificere de typer af NA-komponenter i en proteinholdig prøve.

Protokollerne beskrevet her cen være effektivt udføres uden yderligere trin med isolering af de potentielle NA urenheder, og stole på Benedikts assay til reducerende sukker ^11, den orcinol assay for pentoser ^12,13, og diphenylamin reaktioner ^14,15 af 2'-deoxypentoses (figur 1 og 2) . The Benedict test (figur 2a) udnytter evnen af den lineære, åbenkædede (aldehyd) form af en aldose sukker for at reducere Cu ^{2 +,} med ledsagende oxidation af sukkeret er carbonyl en carboxylat-del og produktion af _Cu2 O som en uopløseligt rødt bundfald. Denne reaktion vil teste positive med frie reducerende sukkerarter, såsom aldoser og ketoser (som omdanner til de tilsvarende aldoser via enediol mellemprodukter), men ikke med pentosesukkerstoffer der er låst til cyklisk form som en del af den kovalente rygraden i et DNA-eller RNA-polynukleotid. På grund af den minimalistiske krav om en fri hemiacetal funktionalitet, andre compounds der kunne testes positive i dette assay - og derfor fungere som potentielle interfererende - omfatter α-hydroxy-ketoner og korte oligosaccharider (f.eks disaccharidet maltose). Både Bial s orcinol (figur 2b), Dische s diphenylamin (fig. 2c) reaktioner er baseret på indledende ødelæggelse af polynukleotidet backbone, via depurinering af nucleosidet og yderligere syre-eller basekatalyseret hydrolyse af forældrene nukleotider, til opnåelse af furan-2 -carbaldehyd (furfural) derivater, disse derivater derefter omsættes med enten en polyhydroxy-phenol, såsom orcinol (Bial s) eller diphenylamin (Dische s) reagenser til dannelse af farvede kondensationsprodukter af stort set ukendt kemisk struktur. DNA'et versus RNA specificitet Dische s assayet skyldes, at den pentose sukker skal 2'-deoxygeneret for at være modtagelige for oxidation til ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som yderligere reagerer med diphenylaminunder sure betingelser til opnåelse af en lys blå kondensat (figur 2c). Anvendelse af de strømlinede protokollerne der er beskrevet her, har vi fundet, at disse sukker-specifikke kolorimetriske reaktioner kan skelne mellem RNA og DNA og kan også indikere tilstedeværelsen af ​​frie reducerende sukkerarter, såsom glucose, fructose, ribose eller i en biomolekylær prøve.

Protocol

1. Benedikts Assay for reducerende sukkerarter

1. Der fremstilles en passende mængde Benedicts prøve - 940 mM vandfrit natriumcarbonat, 588 mM natriumcitrat dehydrat, 68 mM kobber (II) sulfate pentahydrate. Dette reagens kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i mindst seks måneder uden synlig ændring i reaktivitet.
2. Ovennævnte reagens er 6x. Således for 600 pi reaktioner, tilsættes 100 pi Benedicts prøve til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør (fx Eppendorf mærke), per prøve, der skal analyseres.
3. Tilsættes hvor som helst fra 10 pi til 500 pi prøve til dette rør, den optimale mængde kan bestemmes baseret på intensiteten af ​​farvedannelse i den første prøvekørsel. Hvis tilstrækkelig prøve er tilgængelig så begynde sådanne forsøg på maksimalt mulige prøvevolumen (dvs. fem sjettedele af det samlede reaktionsvolumen, 500 pi af prøven i dette tilfælde), og fortyndes derefter i efterfølgende assays.
4. Tilføj ddH ₂ O til tuvære at bringe slutvolumenet til 600 pi, blande opløsningen ved hvirvelbehandling eller pipettering.
5. Inkuber prøverne i 20 minutter i et kogende vandbad.
6. Fjern den opvarmede prøve fra badet og lader den afkøle ved stuetemperatur i 10 minutter.
7. Centrifuger prøverøret på> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 minutter, for at sediment helst partikelformet materiale, dette trin er vigtigere for kvantitative snarere end kvalitative undersøgelser.
8. Alikvot af supernatanten fra dette rør i en ren cuvette.
9. Blindprøve for UV-VIS spektrofotometer med vand.
10. Måles absorbansen af ​​denne prøve ved 475 nm.

2. Bial s Orcinol-assay for pentosesukkerstoffer

1. Der fremstilles en passende mængde frisk Bial reagens - 24,2 mM orcinol-monohydrat (se figur 2b for strukturen af denne forbindelse), 6 M HCl, 0,025% vægt / volumen ferrichlorid-hexahydrat Note.:For længere opbevaring kan Bial reagens fremstilles som to separate stamopløsninger: (i) Reagent A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O i koncentreret HCI] og (ii) Reagent B [422 mM orcinol monohydrat fremstillet i 95 % ethanol]. Reagens A kan opbevares ved stuetemperatur i seks måneder Reagens B kan opbevares ved 4 ° C i en måned, dækket med folie for at begrænse udsættelse for lys. Disse stamopløsninger blandes i en 15 (A): 1 (B) v / v-forhold før anvendelse.
2. Ovennævnte reagens er 2x. Således for 1,0 ml reaktioner, tilsættes 500 pi Bial reagens til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, per prøve, der skal analyseres.
3. Tilsættes hvor som helst fra 10 pi til 500 pi prøve til dette rør. Pr. note 1.3 (ovenfor), hvis der er tilstrækkelig prøve er tilgængelig så begynde forsøg reaktioner under anvendelse af den maksimalt mulige prøvevolumen (dvs. halvdelen af den samlede reaktionsvolumen, 500 pi af prøven i dette tilfælde) og fortyndet derfra.
4. Tilføj ddH ₂ O til røret for at bringe fnelle volumen til 1,0 ml, blande opløsningen ved hvirvelbehandling eller pipettering.
5. Inkuber prøverne i 20 minutter i et kogende vandbad.
6. Fjern den opvarmede prøve fra badet og lader den afkøle ved stuetemperatur i 10 minutter.
7. Centrifuger prøverøret på> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 minutter, for at sediment helst partikelformet materiale, dette trin er vigtigere for kvantitative snarere end kvalitative undersøgelser.
8. Alikvot af supernatanten fra dette rør i en ren cuvette til visuel inspektion.
9. Til semikvantitativ analyse, blank UV-VIS spektrofotometer med vand og mål absorbansen af ​​kuvetten prøven ved 660 nm.

3. Dische s Diphenylamin Assay for 2'-deoxypentose Sukkerarter

1. Der fremstilles en passende mængde Dische s diphenylamin reagens - 60 mM diphenylamin, 11 M iseddikesyre, 179 mM svovlsyre, 62% v / v ethanol. Dette reagens kan prætilberedes i forvejen og opbevares ved stuetemperatur i en mørk beholder eller dækket med folie, for at begrænse udsættelse for lys. På grund af lysfølsomhed reagenset må ikke opbevares på ubestemt tid, men i praksis kan det være forberedt hver to til tre måneder uden nogen tilsyneladende ændring i reaktivitet.
2. Ovennævnte reagens er 2x. Således for 1,0 ml reaktioner, tilsættes 500 pi Dische reagens til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, per prøve, der skal analyseres.
3. Tilsættes hvor som helst fra 10 pi til 500 pi prøve til dette rør. Pr. note 1.3 (ovenfor), hvis der er tilstrækkelig prøve er tilgængelig så begynde forsøg reaktioner under anvendelse af den maksimalt mulige prøvevolumen (dvs. halvdelen af den samlede reaktionsvolumen, 500 pi af prøven i dette tilfælde) og fortyndet derfra.
4. Tilføj ddH ₂ O til røret for at bringe det endelige volumen til 1,0 ml, blande opløsningen ved hvirvelbehandling eller pipettering.
5. Inkuber prøverne i 20 minutter i et kogende vandbad.
6. Fjern den opvarmede prøve fra badet og allow den afkøle ved stuetemperatur i 10 minutter.
7. Centrifuger prøverøret på> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 minutter, for at sediment helst partikelformet materiale, dette trin er vigtigere for kvantitative snarere end kvalitative undersøgelser.
8. Alikvot af supernatanten fra dette rør i en ren cuvette til visuel inspektion.
9. Til semikvantitativ analyse, blank UV-VIS spektrofotometer med vand og mål absorbansen af ​​kuvetten prøven ved 600 nm.

4. Yderligere Bemærkninger om anvendelse

1. De følgende klasser af molekyler er egnede referencestoffer for positive og negative kontrolreaktioner for hvert assay:
   • Benedikts - Positiv = fri ribose, fructose, glucose, Negativ = RNA, DNA, ATP mv. (Enhver saccharid mangler et frit reducerende sukker funktionalitet)
   • Bial er - Positiv = RNA (f.eks bagegær ekstrakt), ribose, ATP, UMP, Negativ = bovin serum serumalbumin (BSA) eller ethvert andet protein
   • Dische er - Positiv = DNA (f.eks kalvethymus), Negativ = RNA, ATP mv. (Ikke-2'-deoxygeneret nukleotid)
2. Disse assays har vist sig at være temmelig robuste over for forbindelser, som ofte anvendes i proteinoprensning, for eksempel, salte fælles såsom NaCI, _{(NH4) 2 SO4,} og K ₂ SO ₄ ikke interfererede og reaktionerne forekommer normalt upåvirket af indholdet af fortyndingsmidlet. Detergenter eller chaotrope midler, såsom urinstof kan påvirke reaktiviteten af ​​assayene hvis pH er stærkt basiske, et neutralt til surt pH-område er generelt mest optimal for Bial-og Dische s assays grund af den underliggende reaktionskemi (se teksten og protonerne i figur 2b, c). Potentielt suboptimale reaktionsbetingelser, mistænkte forstyrrende osv. bør afprøves på en sag-til-sag basis, ved hjælp af positiv og negativ kontrol eksperimenter wed referencestoffer.

Representative Results

Resultaterne er vist i figur 3 for anvendelse af disse kolorimetriske assays til kendte referenceforbindelser. Repræsentative kvalitative data er vist for Benedikts (a), BIAL s orcinol (b), og Dische s diphenylamin (c) assays, og standardkurver for disse tre assays er vist i figur 4.. I paneler 3 (ac), viser de venstre paneler positive / negative kontrolforsøg med passende reaktive / ikke-reaktive analytter, disse visuelle resultater er vist in situ, i kuvetterne, der er beskrevet i protokollerne 1-3 (ovenfor). Ret underpaneler viser en titrering serie for hver respektiv analyt. I Benedikts assay (a), er den positive kontrol ribose (0,42 mg / ml), mens negative kontroller er vand, en generisk protein (0,75 mg / ml BSA), og to ikke-reducerende sukkere (DNA på 0,75 mg / ml og RNA ved 12,5 mg / ml). I orcinol assay (b), er de positive kontroller ribose (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml), og DNA (0,45 mg / ml), mens vand og BSEt protein (0,45 mg / ml) er negative kontroller. I diphenylamin-assay (c), er kalvethymus-DNA (0,45 mg / ml) er vist som en positiv kontrol, og vand, gærekstrakt RNA (7,5 mg / ml), ribose (0,15 mg / ml) og BSA (0,45 mg / ml) anvendes som negative kontroller. Endelig panel (d) illustrerer robustheden af ​​assays ved at vise Dische reaktion med prøver af varierende heterogenitet: to koncentrationer af DNA er vist som en positiv kontrol i venstre to prøver (kuvetter 1-2), DNA + RNA blandinger ( i forskellige forhold) er vist i de næste tre prøver (3-5), og de sidste tre prøver viser DNA i fravær (prøve 6) eller nærvær (prøverne 7-8) af nukleinsyren-bindende protein "Hfq«. ¹⁶ Note, at det positive resultat af Dische s assayet er bevaret for DNA-holdige prøver, selv i nærværelse af "forurene" RNA eller protein.

Kvantitativ Analyse: fortynding varierer i figur 3 (ac) paneler varierer, fordi hverReaktionsblandingen har en klar visuel detektionsgrænse, afhængigt af den type sukker, der assayes. Spektrofotometriske og ikke visuelt kan påvisning anvendes til at forbedre de måleområder, fx som vist i figur 4 for (a) Benedikts, (b) Bial s, og (c) Dische s assays. Selvom protokollerne der er beskrevet her, er tænkt som primært kvalitative assays, Lambert-Beers forhold mellem absorbans og koncentration giver mindst semikvantitativ estimering af sukker eller nucleinsyreindhold. Som et eksempel på en standardkurve for kalibrering af Benedict test, er en lineær regression fit af absorbans (475 nm) mod ribosekoncentration vist i figur 4 (a) fejlsøjler viser standardafvigelsen for n = 3 replikater, og kvadreret korrelationskoefficient er tilvejebragt. Afvigelsen fra linearitet ved meget lave ribosekoncentrationer (f.eks 0,28 mM datum) afspejler den begrænsede følsomheden af denne analyse. Selvom somsiger er primært beregnet til kvalitative undersøgelser, er følgende retningslinjer foreslås til semi-kvantitativ analyse:

• For Benedikts assay (figur 4a): Omsætningen udlæsning (A _475nm) viste sig at være lineær i det mindste i området 0,04 → 0,5 mg / ml analyt, som udføres in triplo.
• For Bial s assayet (figur 4b): absorbansen data (A _{660 nm)} var lineær i det mindste i området 0 → 0,5 mg / ml analyt (bagegær RNA), idet assayet er blevet udført tredobbelt ^(R2 = 0,99 lineær regression koefficient). Selvom prøverne blev centrifugeret i afklaring før absorbansmålinger blev der ikke fældningsmiddel fundet ved disse lave koncentrationer af analytten, og derfor centrifugeringstrin var ikke strengt nødvendigt. Analysen afviger fra linearitet ved analytkoncentrationer udover dette område.
• For Dische s assay (figur 4c): A _{600 nm} (R2 = 0,99). Plottet af absorbans versus [analyt] begyndte at plateau på 0,90 mg / ml DNA, der angiver grænsen for den lineære reaktion region.
• Praktiske forhold til kvantitativ eller semi-kvantitativ analyse: For at fjerne udfældet materiale, der ellers ville interferere med absorbansaflæsninger, alle tre assays kræver centrifugering ved maksimal hastighed (25.000 x g, eller hvilken som helst mængde, kan modstås af mikrofugerør) i rimelige tidsperioder (fx 20 minutter), og dette er især vigtigt ved høje analytkoncentrationer. Efter centrifugering kan klarede prøverne overført til en kuvette eller mikroplade (fx 96-brønds mikrotiterplader) for bekvemme absorbansmålinger.

Figur 1. Beslutningstræ til anvendelse af assays. Begyndende med en potentielt heterogen prøve af biomolekyler (fx fra hel-cellelysater), kan de kolorimetriske assays beskrevet her anvendes til at bestemme, hvis blandingen indeholder ikke-reducerende sukkere (Benedicts test). Hvis ja, så Bial s orcinol test yderligere afslører, om populationen af ikke-reducerende sukkere indeholder pentose ringe (som i DNA eller RNA), versus hexoser (f.eks glucose, andre pyranoses) og muligvis endnu andre aldoser. Endelig, hvis prøven indeholder i det mindste en moderat fraktion af DNA derefter 2'-deoxyribose ring vil reagere (ved syrning og opvarmning) med Dische s diphenylamin reagens, hvilket giver et synligt blåt kondensationsprodukt. Bemærk, at dette diagram er et beslutningstræ, ikke et rutediagram: logikken i assayresultaterne er vist serially, men de assays kan udføres parallelt.

Figur 2. Underliggende kemiske reaktioner er vist for de kolorimetriske assays, med det påviselige farvede produkt er angivet siden af ​​de tilsvarende reaktioner. (A) Et uopløseligt, rød bundfald af Cu ₂ O er det positive resultat af Benedikts assay til reducerende sukker. (B) Ved opvarmning og forsuring, vil sukkerarter indeholdende pentose ring sønderdeles til furfural, som derefter reagerer med orcinol (Bial reagens) til opnåelse af et opløseligt blågrøn addukt. I Dische s assay mangel på en hydroxylgruppe substituent i 2-stillingen muliggør en ringåbnende oxidationsreaktion, aldehydet produkt, som yderligere reagerer med diphenylamin [(Ph) ₂ NH] til opnåelse af en lys blå produkt. Kemisk structures forbliver ukendte for de store, multi-ring kondensationsprodukter af de orcinol (b) og diphenylamin (c) reaktioner.

Figur 3. Anvendelse af kolorimetriske analyser til referenceforbindelser og heterogene prøver. Prøveresultater er vist for Benedikts (a), Bial s (b), og Dische s (c) kolorimetriske assays. I (a) → (c), viser de venstre underpaneler positive / negative kontrol ved hjælp af passende reaktive / ikke-reaktive analytter og retten underpaneler viser en titrering serier for hver analyt. Der er også vist en illustrativ panel af Dische reaktioner (d) hvor analytten varierer i heterogenitet - enten DNA alene (venstre), DNA / RNA-blandinger af forskellige forhold (midten) eller DNA i nærvær af en nukleinsyre-associeret protein ( »Hfq«). Disse panelerer yderligere beskrevet i de repræsentative resultater del af teksten.

Figur 4. Standardkurver fra assays med referenceforbindelser. Kalibreringskurver er vist for Benedikts (a), BIAL s (b), og Dische s (c) assays, der viser en repræsentativ del af den lineære reaktion region for hver assay. Den lineære regression passer og tilsvarende korrelationskoefficienterne angivet for hvert assay. Standard bagegær RNA (b) og kalvethymus-DNA (c) var de analytter i disse titrering serien. Klik her for at se større figur .

Discussion

De kolorimetriske assays præsenteret her tilbyde en simpel metode til hurtigt at vurdere den kemiske natur af biomolekylære blandinger, såsom støder ved rensning af proteiner, RNA'er eller komplekser fra helcelle-lysat som forberedelse til yderligere undersøgelser. Som strukturel biologi forfølger flere native-lignende forsamlinger, gradvist større udfordringer, såsom prøve heterogenitet, vil blive stillet af de indviklede og multi-komponent-komplekser. Supramolekylære samlinger er ofte kun marginalt stabil, og deres vellykkede isolation kan kræve mindre strenge oprensningsbetingelser (fx som fundet for spliceosomal snRNP komplekser ^17,18). Under sådanne mildere betingelser både autentisk og falsk POI · · · NA interaktioner er mere tilbøjelige til at fortsætte og dermed blande sig i downstream analyser med et målprotein eller nukleinsyre. Et nødvendigt første skridt er at identificere de typer af kemiske komponenter i disse prøver.

ve_content "> metoder til påvisning af RNA, DNA og protein varierer afhængigt af mængden og koncentrationen af ​​analytter, de forhåndenværende ressourcer og tidsmæssige begrænsninger, og måske vigtigst af alt, kan man forudgående viden om den sandsynlige kemiske sammensætning af analytterne. proteinholdige materiale påvises ved mange veletablerede fremgangsmåder, herunder dem, der spektroskopisk _(A280), hydrodynamiske (gelelektroforese), kemisk / kolorimetriske ¹⁹ (fx biuret test for peptidbindinger) og med stor følsomhed og nøjagtighed, via massespektrometri. Tilsvarende kontorer kan påvises ved spektroskopiske (A _260), fluorometriske eller kemiske assays (beskrevet her). Hver type fremgangsmåde har karakteristiske styrker og svagheder. For eksempel er PicoGreen, SYBR-Gold, og andre cyanin-baserede fluorescerende farvestoffer ganske følsomme over for nukleinsyre (mange størrelsesordener over de kolorimetriske assays), udviser forskellige grader af selektivitet (f.eks PicoGreen for dobbeltstrenget DNA, binder SYBR-Gold mest NAS), og har også brede dynamiske områder for kvantificering formål. Men disse metoder er ikke uden grænser: farvestofferne kræver mere avanceret udstyr til afsløring (transilluminators for geler, spectrofluorometers for batch prøver), versus simpel visuel udlæsning af kolorimetriske assays, farvestofferne behandles som mutagene, beslægtet med ethidiumbromid, og der er restriktioner på assaybetingelser (f.eks en anbefalet pH-område på 7-8,5 for SYBR-Gold, en 30% reduktion af PicoGreen signal intensitet på> 200 mM NaCl). Således kolorimetriske og fluorescens-baserede assays er komplementære nucleinsyre-farvestoffer kan især være nyttig i tilfælde af negative resultater med de hurtige kolorimetriske assays, eller som en måde at mere omhyggeligt (kvantitativt) ekspandere den første resultater af kolorimetriske assays. En grundlæggende fordel ved de kolorimetriske NA protokoller, foruden nemme at anvende, er, at de udelukkende afhængig af iboende covalent struktur NA'er stedet fold/3D strukturer, reaktiviteter eller andre egenskaber af biopolymeren, som kan variere med sekvens.

De protokoller, der er beskrevet her, er robuste over for de fleste vanskeligheder, særlig når de udføres med simpel visuel inspektion af reaktionsprodukterne, særlig forsigtig skal tages for mere kvantitativ (spektrofotometriske) analyser. For eksempel den røde fældningsmiddel (ppt), der danner i nærvær af høje koncentrationer af ribose i Benedikts assayet skal fjernes før spektrofotometrisk analyse, og dette opnås let ved centrifugering. For Dische s assay tilsætning af diphenylamin reagens ledsaget af dannelse af et hvidt bundfald, som kan solubiliseres ved opvarmning, en grøn ppt som dannes i nærvær af DNA kan forstyrre spektrofotometriske målinger og skal fjernes inden den kvantitative analyse. Desuden er hvert assay baseret på kemiske reaktioner, som er modtageligetil potentielle interfererende, nævnt som i indledningen og yderligere beskrevet nedenfor. Endelig bemærker vi, at en høj relativ koncentration af RNA i en DNA / RNA-blandingen kan maskere den forventede positive resultat af Dische s assay; denne falske negative for DNA skyldes, at en høj molbrøken for RNA også reagerer via furfural mellemprodukter, med Dische s reagenser, giver men et farveløst produkt snarere end den blå addukt fremstillet ved omsætning med 2'-deoxypentose sukker af DNA.

Potentielle interfererende: Beyond the oplagt tilfælde af sukker, lipider og proteiner er to andre biomolekyler, der teoretisk kunne forårsage problemer med disse kolorimetriske assays på grund af krydsreaktivitet (falske positiver) eller maskeret reaktivitet (falsk negative). I princippet kan flere typer af cellulære lipider tænkes blande, herunder glycosylglycerols og andre glycerolipider konjugeret til sukkerarter, glycosphingolipider (f.eks vokshudbrosides), saccharolipids (f.eks glucosamin-derivater), lipopolysaccharider, og så videre. I praksis er disse klasser af lipider usandsynligt at udgøre et problem i at arbejde med lipofile proteiner, fordi de er forholdsvis sjældne, versus de langt mere rigelige phospholipider, og derfor under detektionsgrænsen af ​​vores analyser. Fordi de fleste af de førnævnte cellulære lipider er bygget på hexoser (galactose, glucose) i stedet for pentoser, bør de ikke interfererer som falsk-positive i Bial-eller Dische s assays. Gratis monosaccharider, der kan give falsk-positive omfatter fructose, galactofuranose eller andre furanoses. På et beslægtet note, kunne interferens fra uønskede sukkerarter blive et problem for rekombinante proteiner udtrykt med maltose-bindende protein (MBP) tags. I affinitetskromatografitrin anvendes til at oprense sådanne fusionskonstruktioner, der maltose anvendes til eluering af proteinet, og det er tænkeligt, at resterende maltose i downstream præparater kan forstyrre the Benedikts assay (det er den mest almindelige / uspecifik af assayene, de glucoseenheder af maltose bør ikke reagere under Bial-eller Dische s). Således ville man være nødt til at udvise forsigtighed i de post-kromatografiske trin for at sikre, at resterende maltose ikke gav falske resultater. Vi har ikke testet glucosylated proteiner eller andre glycoproteiner, men vi formoder, at det vil være vanskeligt at opnå et klart positivt resultat for tilstedeværelsen af ​​sukker på sådanne proteiner (eller glycolipid, proteoglycan eller andre glycokonjugater), fordi vi forventer, at de glycan dele ville ligger under følsomhedsgrænsen for vore assays. I princippet, en opløsning indeholdende en fri aldohexose såsom glucose frigjort fra en glucosylated protein via sur hydrolyse, ville testes positive ved Benedikts assay; Tilsvarende bør et glycoprotein-afledt pentose såsom xylose, giver et positivt resultat i Bial er assay. Men i praksis et positivt resultat for glycoproteiner ville kræve meget h IGH proteinkoncentrationer, selv for multipelt glycosylerede polypeptider, på grund af det lave sukker / protein molforhold.

De assayprotokoller her beskrevne kan udvides og tilpasses til at håndtere grænserne for små stikprøver - dvs, små mængder eller lave koncentrationer af analytter. For begrænsede prøvemængder har vi fundet, at reaktionerne kan skaleres ned til 100 pi interval (fx under anvendelse af PCR-rør og en thermocycler for inkubationstrin). For små volumina ved lave koncentrationer (nær detektionsgrænsen), et spektrofotometer udstyret med en plade-reader, kan anvendes; i sådanne scenarier, ville den eneste forventede vanskeligheder være fjernelse af enhver uønsket fældningsmiddel før absorbansmålinger. Trods den begrænsede detekteringsområde på simpel visuel inspektion, er en fordel ved den fremgangsmåde, der er beskrevet her dets effektivitet og hurtighed, med prøver, der kan analyseres øjeblikkeligt efter opvarmning.

"> Anvendelser af de protokoller, der præsenteres her omfatte identifikation af co-rensende forbindelser, vurdering af RNA eller DNA renheden, og påvisningen af ​​resterende NA eller sukker forurening i proteinprøver. For eksempel kan uønsket NA opdaget af vores analyser blive fjernet fra et protein prep via kemiske midler (fx alkalisk hydrolyse af RNA) eller enzymatisk fordøjelse (f.eks nuklease behandling). Selv om der findes alternative tilgange til sådanne ansøgninger, de metoder, der er beskrevet her, er meget effektiv med hensyn til både tid og penge, og kan derfor let kan integreres i en eksperimentel arbejdsgang. Den tidlige identifikation af co-rensende forbindelser som frit reducerende sukker, RNA, DNA eller protein kan lede udformningen af ​​downstream oprensningstrin, versus møjsommelige trial and error undersøgelser. En fælles skridt efter vores protokoller kan være isolering af RNA fra DNA og protein, gennem thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion og genanvendelse af DNA alone (ved at udelukke thiocyanat). ^{20 For} at vurdere renheden af NA er resultatet af phenol-chloroform ekstraktioner kan disse kolorimetriske assays kan anvendes som et simpelt alternativ til elektroforese eller DNase-behandling. I denne og andre måder, kan de kolorimetriske assays beskrevet her kombineres med veletablerede metoder til protein-og NA ønsker at opnå en hurtig og robust system til at belyse RNA, DNA, og proteinkomponenter i heterogene biomolekylære prøver.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.