Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Summary

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Abstract

Sperimentazione biochimica generalmente richiede una conoscenza accurata, in una fase iniziale, l'acido nucleico, proteine ​​e altri componenti biomolecolari in campioni potenzialmente eterogenei. Gli acidi nucleici possono essere rilevati tramite diversi approcci stabiliti, compresi metodi analitici spettrofotometrico (ad esempio, A _260), fluorometrico (ad esempio, il legame di coloranti fluorescenti), o colorimetrica (nucleoside-specifiche reazioni chimiche cromogeni). ¹ Anche se non può facilmente distinguere RNA da DNA, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporto è comunemente impiegato, in quanto offre un semplice e rapido ² valutazione del contenuto relativo di acido nucleico, che assorbe prevalentemente vicino 260 nm e proteine, che assorbe principalmente vicino 280 nm. Rapporti <0,8 sono presi come indicativo di "puri" i campioni di proteine, mentre il puro acido nucleico (NA) è caratterizzata da rapporti di> 1,5 ^3.

HoWever, ci sono scenari in cui la proteina / NA contenuto non può essere nel modo più chiaro e affidabile dedurre da semplici misure spettrofotometriche UV-VIS. Per esempio, (i) i campioni possono contenere una o più proteine ​​che sono relativamente privo degli amminoacidi aromatici responsabili di assorbimento a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), come è il caso con alcuni piccoli RNA-binding proteins, e (ii) i campioni possono presentare intermedi A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti (~ 0.8 <~ 1.5), dove la proteina / NA contenuto è molto meno chiara e può anche riflettere un po 'alta affinità associazione tra la proteina e componenti NA. Per tali scenari, si descrive qui una suite di test colorimetrici per distinguere rapidamente RNA, DNA, e zuccheri riduttori in un campione potenzialmente misto di biomolecole. I metodi si basano sulla sensibilità differenziale di pentosi e altri carboidrati a Benedetto, Bial di (orcinol), e di Dische (difenilammina) reagenti; protocolli ottimizzati possono essere comcompletato in pochi minuti, senza ulteriori passaggi di dover isolare i componenti. I saggi possono essere eseguiti in parallelo per distinguere tra RNA e DNA, così come indica la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio e (Figura 1).

Introduction

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. ⁴ Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, ^{5, 6} con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti ^7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità - alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fattori di splicing), mentre le altre interazioni sono necessariamente molto più generico (ad esempio, il DNA · · · batteriche come le proteine ​​istone-HU ^8). Non specifiche interazioni con agenzie nazionali possono avere conseguenze pratiche per gli esperimenti in vitro che coinvolgono miscele di biomolecules, in quanto è possibile, e anche probabile, che qualche AN assocerà con le biomolecole di interesse, almeno in alcuni sottoinsieme delle condizioni sperimentali impiegate (forza ionica, pH soluzione, ecc).

Si consideri, ad esempio, la produzione di una proteina di interesse (POI) eterologa tramite sovra-espressione della proteina ricombinante in coltura di cellule di Escherichia coli, tale procedura viene eseguita di routine in qualsiasi laboratorio di biologia strutturale ⁹ Nella preparazione per ulteriori esperimenti, quali. come caratterizzazione biochimica / biofisica, cristallizzazione, ecc., sforzi iniziali in genere in modo di ottenere una sufficiente quantità di POI come pura forma possibile, idealmente come un campione chimicamente omogenea e biofisico, monodisperse. Dopo la rottura di cellule ospiti, le prime fasi di un flusso di lavoro tipico purificazione lo scopo di isolare il POI da E. coli proteine, acidi nucleici, parete detriti cellulari,e altri componenti del lisato cellulare. Tuttavia, AN ospite può co-purificare con il POI per diversi motivi fisico - un POI fortemente basico può non specificamente tendina ospitante DNA / RNA, il POI può avere un generico NA attività di legame (ad esempio, il già citato HU); il POI può essere abbastanza specifico NA-binding protein ma mostra reattività crociata con RNA host o DNAs; ospitante AN può interagire con una matrice di cromatografia e quindi semplicemente co-eluire con il POI, e così via. Indiscriminato, ad alta affinità di legame di host AN verso un PDI può rappresentare un problema fastidioso in quanto le impurità NA probabilmente interferire con gli esperimenti a valle (ad esempio, analisi di anisotropia di fluorescenza di POI • RNA binding ^10). In alternativa, POI imprevisto · · · associazioni NA può essere visto anche fortuitamente, come tali interazioni illuminare il POI acido nucleico capacità di legame. In entrambi i casi, se AN sono componenti chiave o contaminanti, si deve prima quantificare eidentificare il tipo (DNA, RNA) di co-purificazione AN in preparazione per esperimenti a valle.

Esistono diversi metodi analitici per rilevare e quantificare AN in un campione. La maggior parte dei metodi disponibili sono fondamentalmente o spettrofotometrica (ad esempio, A ₂₆₀ valori di assorbanza e A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti), fluorimetrica (ad esempio, il legame di tiazolo arancione o altri coloranti fluorescenti a NA), o colorimetrico (suscettibilità di nucleosidi a reazioni chimiche rendimento che cromofori assorbenti in UV-VIS regione dello spettro elettromagnetico), come recentemente descritto da De Mey et al. ¹ Tuttavia, il passo cruciale di identificare il tipo di polinucleotide come RNA o DNA è oltre la portata di molti di questi quantificazione approcci. Qui forniamo una serie di test colorimetrici di individuare rapidamente i tipi di componenti NA in un campione proteico.

I protocolli descritti qui cun essere efficacemente eseguito senza ulteriori fasi di isolare le impurità potenziali NA, e si basano su test Benedetto per zuccheri riducenti ^11, il saggio di orcinol pentosi ^{12,13, 14,15} e reazioni difenilammina di 2'-deoxypentoses (figure 1 e 2) . Test del Benedetto (Figura 2a) utilizza la capacità del lineare, forma a catena aperta (aldeide) di zucchero aldosio ridurre Cu ^{2 +,} con concomitante ossidazione del carbonile zucchero di una porzione carbossilato e produzione di Cu ₂ O come insolubile precipitato rosso. Questa reazione test positivo con libero zuccheri riducenti come aldosi e chetosi (che convertono le aldosi corrispondenti attraverso intermedi enediol), ma non con zuccheri pentosi che sono bloccati in forma ciclica come parte della spina dorsale covalente di un DNA o RNA polinucleotide. A causa del requisito minimalista di una funzionalità senza emiacetale, altri compounds che potrebbero test positivo in questo saggio - e quindi agiscono come potenziali interferenti - sono α-idrossi-chetoni e oligosaccaridi brevi (ad esempio il maltosio disaccaride). Sia il Bial di orcinol (Figura 2b) e Dische di difenilammina (figura 2c) reazioni sono basate sulla distruzione iniziale del backbone polinucleotide, tramite depurination del nucleoside e acido o ulteriore base-catalizzata idrolisi dei nucleotidi madri, per ottenere furan-2 -carbaldehyde (furfurolo) derivati; questi derivati ​​poi reagire sia con un poliidrossi fenolo come orcinol (Bial) o difenilammina (Dische di) reagenti per formare prodotti di condensazione colorate di struttura chimica in gran parte sconosciute. Il DNA RNA rispetto specificità del test del Dische deriva dal fatto che lo zucchero pentoso deve essere 2'-deossigenata per essere suscettibili di ossidazione per ω-hydroxylevulinyl aldeide, che reagisce ulteriormente con difenilamminain condizioni acide per ottenere un blu brillante condensa (figura 2c). Utilizzando i protocolli semplificati descritti qui, abbiamo trovato che queste reazioni colorimetriche zucchero-specifici può distinguere tra RNA e DNA, e indicherà la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio o in un campione biomolecolare.

Protocol

1. Saggio di Benedetto per la riduzione degli Zuccheri

1. Preparare una quantità adeguata di reattivo di Benedict - 940 carbonato di sodio anidro mM, 588 mM di citrato di sodio diidrato, 68 mM di rame (II) pentaidrato solfato. Questo reagente può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per almeno sei mesi senza alcun cambiamento visibile della reattività.
2. Il reagente sopra è 6x. Così, per 600 reazioni ul, aggiungere 100 ml di reattivo di Benedict per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo (ad esempio, Eppendorf marca), per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione di questo tubo, la quantità ottimale può essere determinata in base all'intensità della formazione di colore in un periodo di prova iniziale. Se il campione disponibile è sufficiente quindi iniziare tali prove al massimo volume del campione possibile (cioè, i cinque sesti del volume di reazione totale, 500 ml di campione in questo caso), e poi diluire in saggi successivi.
4. Aggiungi DDH ₂ O al tuessere quello di portare il volume finale a 600 microlitri, miscelare la soluzione nel vortex o pipettaggio.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita.
9. Azzerare il Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua.
10. Misurare l'assorbanza di questo campione a 475 nm.

2. Assay orcinol Bial per Zuccheri pentosi

1. Preparare una quantità adeguata di reagente Bial fresco - 24,2 mM orcinol monoidrato (vedere la Figura 2b per la struttura di questo composto), HCl 6 M, 0,025% w / v di cloruro ferrico esaidrato Nota.:Per la conservazione prolungata, reagente di Bial possono essere preparate come due soluzioni separate fotografici: (i) reagenti A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O in HCl concentrato] e (ii) Reagente B [422 mM monoidrato orcinol preparata in 95 % etanolo]. Un reagente può essere conservato a temperatura ambiente per sei mesi; B reagente può essere conservato a 4 ° C per un mese, coperto con un foglio di limitare l'esposizione alla luce. Queste soluzioni madri sono miscelate in un 15 (A): 1 (B) v / v rapporto prima dell'uso.
2. Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Bial per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì.
4. Aggiungere DDH ₂ O al tubo per portare il finale del volume a 1,0 ml, mescolare la soluzione nel vortex o pipettaggio.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l'ispezione visiva.
9. Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua e misurare l'assorbanza del campione a 660 nm cuvetta.

3. Dische di test Difenilammina per 2'-deoxypentose Zuccheri

1. Preparare una opportuna quantità di reagente di difenilammina Dische - 60 mM difenilammina, 11 M di acido acetico glaciale, 179 mM di acido solforico, 62% v / v di etanolo. Questo reagente può essere prerispetto in anticipo e conservato a temperatura ambiente in un contenitore scuro, o ricoperto di un foglio, per limitare l'esposizione alla luce. A causa della sensibilità alla luce il reagente non deve essere conservata indefinitamente, anche se in pratica può essere preparato ogni due-tre mesi con nessun cambiamento apparente reattività.
2. Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Dische di un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì.
4. Aggiungere DDH ₂ O al tubo per portare il volume finale di 1,0 ml, miscelare la soluzione con vortex o pipettamento.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Togliere il campione riscaldato dal bagno e allow raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l'ispezione visiva.
9. Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua e misurare l'assorbanza del campione a 600 nm cuvetta.

4. Note sull'utilizzo Ulteriori

1. Le seguenti classi di molecole sono composti di riferimento adatti per reazioni di controllo positivi e negativi per ogni saggio:
   • Benedetto - Positivo = libero ribosio, fruttosio, glucosio, negativo = RNA, DNA, ATP, ecc. (Qualsiasi saccaride manca una funzionalità senza zucchero riducente)
   • Bial I - Positivo = RNA (ad esempio estratto di lievito del panettiere), ribosio, ATP, UMP, negativo = bovina serum (BSA) o qualsiasi altra proteina
   • Dische I - Positivo = DNA (ad esempio timo di vitello); Negativo = RNA, ATP, ecc. (Qualsiasi non-2'-deossigenata nucleotide)
2. Questi saggi sono stati trovati per essere abbastanza resistente ai composti spesso utilizzati nella purificazione della proteina, per esempio, sali comuni come NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, e K ₂ SO ₄ non interferiscono, e le reazioni sembrano generalmente insensibile il contenuto del diluente. Detergenti o agenti caotropici come urea può influenzare la reattività dei saggi se il pH è altamente base; un neutro a pH acido è generalmente più ottimale per la Bial e Dische di saggi a causa della reazione chimica di base (vedi il testo ed i protoni in figura 2b, c). Condizioni di reazione potenzialmente interferenti non ottimali, sospetti, ecc. dovrebbe essere esaminato caso per caso, mediante il controllo positivo e negativo esperimenti wcomposti di riferimento esimo.

Representative Results

Risultati sono mostrati in Figura 3 per l'applicazione di tali saggi colorimetrici ai composti di riferimento noti. Rappresentativi dati qualitativi sono indicati per il Benedetto (a), orcinol Bial di (b), e Dische di difenilammina (c) saggi, e le curve standard per questi tre saggi sono illustrati nella Figura 4. In pannelli 3 (ac), i pannelli di sinistra mostra positive / negative esperimenti di controllo utilizzando analiti opportunamente reattivi / non reattivi; questi risultati visivi sono mostrati in situ, nelle cuvette come descritto nei protocolli 1-3 (sopra). Il diritto di sotto-pannelli mostrano una serie di titolazione per ciascun analita corrispondente. Nel saggio del Benedetto (a), il controllo positivo è ribosio (0,42 mg / ml), mentre i controlli negativi sono l'acqua, una proteina generica (0,75 mg / ml BSA), e due non riducenti zuccheri (DNA a 0,75 mg / ml e RNA a 12,5 mg / ml). Nel saggio orcinol (b), i controlli positivi sono ribosio (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml), e DNA (0,45 mg / ml), mentre l'acqua e BSUna proteina (0,45 mg / ml) sono controlli negativi. Nel saggio difenilammina (c), DNA di timo di vitello (0,45 mg / ml) viene mostrata come controllo positivo, e acqua, estratto di lievito RNA (7,5 mg / ml), ribosio (0,15 mg / ml), e BSA (0,45 mg / ml) servono come controlli negativi. Infine, il pannello (d) illustra la robustezza dei saggi mostrando reazione Dische con campioni di varia eterogeneità: due concentrazioni di DNA vengono visualizzati come controllo positivo in sinistra due campioni (cuvette 1-2), miscele DNA + RNA ( a rapporti diversi) sono indicati nei successivi tre campioni (3-5), e gli ultimi tre campioni mostrano DNA in assenza (esempio 6) o presenza (campioni 7-8) di acido nucleico-proteina legante 'HFQ'. ¹⁶ Si noti che il risultato positivo del test del Dische è conservata per campioni contenenti DNA-anche in presenza di "contaminanti" RNA o proteine.

Analisi quantitativa: Le gamme diluizione nella figura 3 (ac) pannelli variare perché ognireazione ha un chiaro limite di rilevazione visiva, a seconda del tipo di zucchero viene saggiato. Spettrofotometrica, piuttosto che visiva, il rilevamento può essere usato per migliorare i campi di misura, ad esempio, come mostrato in Figura 4 per il (a) Benedetto, (b) Bial, e (c) Dische di saggi. Se i protocolli descritti qui sono intesi come saggi principalmente qualitativi, il Beer-Lambert relazione tra assorbanza e concentrazione permette almeno semi-quantitativa stima del contenuto di zucchero o acido nucleico. Come esempio di una curva standard per la calibrazione del test del Benedetto, un adattamento di regressione lineare di assorbanza (475 nm) contro la concentrazione di ribosio è illustrato nella Figura 4 (a); barre di errore indicano la deviazione standard di n = 3 repliche, e la coefficiente di correlazione al quadrato è fornito. La deviazione dalla linearità ribosio a concentrazioni molto basse (ad esempio il datum 0,28 mM) riflette la limitata sensibilità di questo test. Sebbene il qualedice che sono destinati principalmente per gli studi qualitativi, le seguenti linee guida sono suggeriti per analisi semi-quantitativa:

• Per il saggio Benedetto (Figura 4a): La lettura di reazione (A _475nm) è risultato essere lineare almeno nel range 0,04 → 0,5 mg / ml di analita, come eseguito in triplicato.
• Per saggiare la Bial (Figura 4b): I dati di assorbanza (A _660nm) è lineare almeno nell'intervallo da 0 → 0,5 mg / analita ml (lievito di birra RNA), il dosaggio essendo stata effettuata in triplicato (R ² = 0,99 regressione lineare coefficiente). Anche se i campioni sono stati centrifugati per chiarimenti prima di misure di assorbanza, La precipitazione è stata trovata a queste basse concentrazioni di analita e quindi la fase di centrifugazione non era strettamente necessario. Il saggio si discosta dalla linearità alle concentrazioni di analiti oltre questo intervallo.
• Per il saggio Dische (Figura 4c): The A _600nm 2 = 0,99). La trama di assorbanza ottenuti [analita] cominciò a plateau a 0,90 mg / ml DNA, indicando il confine della regione risposta lineare.
• Considerazioni pratiche per l'analisi quantitativa o semi-quantitativa: per rimuovere il materiale precipitato che altrimenti interferire con la lettura di assorbanza, tutti e tre i saggi richiedono centrifugazione a velocità massime (25.000 xg, o altro limite può essere sopportato dai tubi microcentrifuga) per lunghezze di tempo ragionevoli (ad esempio, 20 minuti), questo è particolarmente importante in elevate concentrazioni di analiti. Dopo centrifugazione, i campioni possono essere chiarificati trasferito ad una cuvetta o micropiastre (ad esempio, piastre da 96 pozzetti di microtitolazione) per misure di assorbanza convenienti.

Figura 1. Albero decisionale per l'applicazione dei saggi. Partendo da un campione potenzialmente eterogenea di biomolecole (ad esempio, da lisati di cellule intere), i test colorimetrici qui descritti possono essere utilizzati per determinare se la miscela contiene zuccheri non riducenti (test di Benedict). Se è così, allora prova orcinol Bial rivela ulteriormente se la popolazione di non riducenti contiene zuccheri pentosi anelli (come nel DNA o RNA), rispetto esosi (ad esempio, glucosio, pyranoses altri) e forse ancora aldosi altri. Infine, se il campione contiene almeno una frazione del DNA moderata allora il 2'-deossiribosio anello reagirà (previa acidificazione e riscaldamento) con il reagente di difenilammina Dische, ottenendo un prodotto di condensazione visibilmente blu. Si noti che questo schema è un albero di decisione, non un diagramma di flusso: la logica dei risultati del test viene visualizzato serially, ma i saggi possono essere eseguiti in parallelo.

Figura 2. Reazioni chimiche sottostanti sono indicati per i saggi colorimetrici, con il prodotto rivelabile colorato indicato a fianco le reazioni corrispondenti. (A) Un insolubile, precipitato rosso di Cu ₂ O è il risultato positivo del test Benedetto per zuccheri riducenti. (B) per riscaldamento e acidificazione, zuccheri contenenti anelli pentosi si decompone in furfurolo, che reagisce poi con orcinol (reagente di Bial) ottenendo un solubile blu-verde addotto. Nel saggio Dische, la mancanza di un sostituente ossidrile in posizione 2 'consente una apertura di anello reazione di ossidazione, il prodotto di aldeide che reagisce ulteriormente con difenilammina [(Ph) ₂ NH] per dare un prodotto blu brillante. Chemical structures restano sconosciuti per i grandi, multi-anello prodotti di condensazione di orcinol (b) e (c difenilammina) reazioni.

Figura 3. Applicazione dei test colorimetrici a composti di riferimento e campioni eterogenei. Risultati dei campioni sono esposti per la Benedetto (a), Bial di (b), e di Dische (c) test colorimetrici. In (a) → (c), sinistra sotto-pannelli mostrano i controlli positivi / negativi usando opportunamente analiti reattivi / non reattivo e il diritto sotto-pannelli mostrano una serie di titolazione per ciascun analita. Viene anche mostrato un pannello illustrativo delle reazioni Dische (d) in cui l'analita varia in eterogeneità - o solo DNA (sinistra), DNA / RNA miscele di differenti rapporti (centrale), o DNA in presenza di un acido nucleico-proteina associata ( 'HFQ'). Questi pannellisono ulteriormente descritti nella sezione rappresentativa Risultati del testo.

Figura 4. Le curve standard di test con composti di riferimento. Curve di calibrazione sono esposte per la Benedetto (a), Bial di (b), e di Dische (c) saggi, raffigurante una porzione rappresentativa della regione di risposta lineare per ciascun test. La regressione lineare si adatta e coefficienti di correlazione corrispondenti sono indicati per ciascun test. Standard lievito di birra RNA (b) e timo di vitello DNA (c) sono stati gli analiti di questa serie di titolazione. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

I saggi colorimetrici presentati qui offrono un approccio semplice per valutare rapidamente la natura chimica di miscele biomolecolari, come si incontrano quando purificare proteine, RNA o complessi di cellule intere lisato in preparazione per ulteriori studi. Come biologia strutturale persegue assemblee più nativa, come le sfide progressivamente più grandi, come ad esempio l'eterogeneità del campione, sarà posta dai complessi complesse e multi-componente. Supramolecolari sono spesso solo marginalmente stabile, e il loro isolamento di successo può richiedere condizioni di depurazione meno rigorosi (ad esempio, come si trova per i complessi snRNP spliceosomali ^17,18). Sotto tali condizioni più blande sia POI autentica e spurie · · · NA interazioni sono più probabilità di persistere e quindi interferire in saggi a valle con una proteina bersaglio o dell'acido nucleico. Un primo passo necessario è l'identificazione dei tipi di componenti chimici in questi campioni.

ve_content "> Metodi per rilevare RNA, DNA e proteine ​​variano a seconda della quantità e concentrazione di analiti, delle risorse disponibili e dei vincoli di tempo e, forse più importante, la propria conoscenza circa la composizione chimica probabile degli analiti. materiale proteico può essere rilevato dal molti metodi ben affermati, compresi quelli che sono spettroscopica (A _280), idrodinamica (elettroforesi su gel), chimico / colorimetrico ¹⁹ (ad esempio, test di biureto per i legami peptidici) e, con grande sensibilità e precisione, tramite spettrometria di massa. Allo stesso modo, AN possono essere rilevate mediante saggi spettroscopici (A _260), fluorometrico, o chimici (qui descritto). Ogni tipo di metodo presenta punti di forza e di debolezza caratteristici. Ad esempio, PicoGreen, SYBR-Gold, ed altri coloranti fluorescenti cianina-based sono molto sensibili ai acido nucleico (molti ordini di grandezza al di là dei test colorimetrici), con vari gradi di selettività (es. PicoGreen di DNA a doppia elica, SYBR-oro si lega più AN), e dispongono anche di ampie gamme dinamiche a fini di quantificazione. Tuttavia, questi approcci non sono senza limiti: i coloranti richiedono attrezzature più avanzate per il rilevamento (transilluminatore per gel, spettrofluorimetri per campioni in batch), rispetto al semplice lettura visiva dei test colorimetrici, i coloranti vengono trattati come mutageni, simili a bromuro di etidio, e ci sono delle restrizioni sulle condizioni di test (ad esempio, un intervallo di pH consigliato di 7-8,5 per SYBR-Gold, una riduzione del 30% dell'intensità del segnale PicoGreen a> 200 mM di NaCl). Così, saggi colorimetrici e basato sulla fluorescenza sono complementari: coloranti acidi nucleici può essere particolarmente utile nel caso di risultati negativi con i test colorimetrici rapidi, o come un modo per più attentamente (quantitativamente) espandere risultati iniziali di test colorimetrici. Un vantaggio fondamentale dei protocolli colorimetriche NA, oltre alla semplicità di utilizzo, è che si basano esclusivamente sulla co intrinsecastruttura valente delle AN, piuttosto che strutture fold/3D, reattività, o qualsiasi altre proprietà del biopolimero che potrebbero variare con la sequenza.

I protocolli descritti qui sono robusti contro la maggior parte delle difficoltà, soprattutto se eseguito con una semplice ispezione visiva dei prodotti di reazione, particolare cura deve essere presa per più quantitativa (analisi spettrofotometriche). Per esempio, nel dosaggio del Benedetto il precipitante rosso (ppt) che forma in presenza di elevate concentrazioni di ribosio devono essere rimossi prima analisi spettrofotometrica, questo è facilmente ottenuto mediante centrifugazione. Per il saggio Dische, l'aggiunta del reagente difenilammina è accompagnata dalla formazione di un ppt bianca che può essere solubilizzato mediante riscaldamento; una ppt verde che si forma in presenza di DNA può interferire con misure spettrofotometriche e devono essere rimossi prima dell'analisi quantitativa. Inoltre, ogni saggio è basato su reazioni chimiche che sono suscettibilidi potenziali interferenti, come indicato nella Introduzione e di seguito indicato. Infine, si nota che una elevata concentrazione relativa di RNA in un DNA / RNA miscela può mascherare il risultato positivo atteso di dosaggio Dische I; questo falso negativo per DNA deriva dal fatto che una frazione molare elevato di RNA reagisce inoltre, tramite intermedi furfurale, con reagenti del Dische, ma produce un prodotto incolore piuttosto che l'addotto blu prodotto dalla reazione con il 2'-deoxypentose zucchero del DNA.

Potenziali interferenti: Al di là del caso evidente di zuccheri, lipidi e proteine ​​sono due altre biomolecole che potrebbero ipoteticamente causare problemi con i test colorimetrici a causa di cross-reattività (falsi positivi) o reattività mascherato (falsi negativi). In linea di principio, diversi tipi di lipidi cellulari, concettualmente, potrebbe interferire, compresi glycosylglycerols glicerolipidi e altri coniugati a zuccheri, glicosfingolipidi (ad esempio, cerebrosides), saccharolipids (ad esempio, glucosamina derivati), lipopolisaccaridi, e così via. In pratica, queste classi di lipidi non dovrebbero costituire un problema nel lavorare con le proteine ​​lipofili, perché sono relativamente rare, contro i fosfolipidi molto più abbondanti, e quindi al di sotto dei limiti di rilevazione dei nostri saggi. Poiché la maggior parte dei suddetti lipidi cellulari sono costruiti su esosi (galattosio, glucosio) piuttosto che pentosi, non dovrebbe interferire come falsi positivi nella Bial o Dische di saggi. Monosaccaridi gratuiti che possono dare falsi positivi sono il fruttosio, galactofuranose o furanoses altri. In una nota correlata, l'interferenza da zuccheri indesiderati potrebbero diventare un problema per proteine ​​ricombinanti espresse con il maltosio, il legame alle proteine ​​(MBP) tags. Nella cromatografia di affinità passaggi utilizzati per purificare tali costrutti di fusione, maltosio è usato per eluire la proteina, ed è concepibile che maltosio residua in preparazioni a valle potrebbe interferire con thsaggio e Benedetto (è il più generale / aspecifica dei saggi, le unità di glucosio di maltosio non deve reagire con il Bial o Dische di). Pertanto, si dovrebbe prestare particolare cautela nel post-cromatografiche passi per assicurare che maltosio residua non ha dato risultati spuri. Non abbiamo testato glucosylated proteine ​​o glicoproteine ​​altri, ma abbiamo il sospetto che sarebbe stato difficile ottenere i risultati chiaramente positivi per la presenza di zuccheri su tali proteine ​​(o glicolipidi, proteoglicani, glicoconiugati o altro) perché ci aspettiamo che le porzioni glycan sarebbe si trovano al di sotto del limite di sensibilità dei nostri test. In linea di principio, una soluzione contenente un aldoesoso libero come glucosio, liberato da una proteina glucosylated tramite idrolisi acida, dà positivo mediante saggio del Benedetto, analogamente, una glicoproteina-derivato pentosi, come xilosio, dovrebbe produrre un risultato positivo del Bial l' dosaggio. Tuttavia, in pratica, un risultato positivo per glicoproteine ​​richiederebbe estremamente h concentrazioni di proteine ​​IGH, anche per polipeptidi moltiplicano glicosilate, a causa del basso livello di zucchero / proteina rapporto molare.

I protocolli di saggio qui descritti possono essere esteso e adattato per gestire i limiti di dimensione del campione - Per esempio, piccoli volumi o basse concentrazioni di analiti. Per quantità campione limitato abbiamo trovato che le reazioni possono essere ridotta al 100 microlitri gamma (ad esempio, utilizzando PCR e un termociclatore per i passaggi di incubazione). Di piccole quantità di campioni a basse concentrazioni (vicino al limite di rivelazione), uno spettrofotometro dotato di una piastra-lettore può essere utilizzato, in tali scenari, l'unica difficoltà anticipato sarebbe rimozione di qualsiasi precipitante indesiderato prima delle misurazioni di assorbanza. Nonostante il limitato campo di rilevamento di una semplice ispezione visiva, un vantaggio del metodo qui descritto è la sua efficienza e rapidità, con campioni che possono essere analizzati immediatamente dopo riscaldamento.

"> Applicazioni dei protocolli indicati comprendono l'identificazione di composti co-purificazione, valutazione di RNA o DNA, la purezza e la rilevazione di contaminazione residua NA o zucchero in campioni di proteine. Ad esempio, NA indesiderato trovato che i saggi possono essere rimossi dal una preparazione proteina tramite mezzi chimici (ad esempio, idrolisi alcalina di RNA) o digestione enzimatica (ad esempio, trattamento nucleasi). Anche se ci sono approcci alternativi per tali applicazioni, i metodi descritti qui sono altamente efficiente in termini di tempo e costi, e può quindi essere facilmente integrato in un flusso di lavoro sperimentale. L'identificazione precoce di co-purificazione composti come libero di zuccheri riduttori, RNA, DNA, o proteine ​​in grado di guidare la progettazione di misure di depurazione a valle, rispetto al laborioso processo e studi di errore. Un passo comune, secondo i nostri protocolli di potrebbe essere l'isolamento di RNA da DNA e proteine, tramite tiocianato-fenolo-cloroformio estrazione, o il recupero del DNA alone (escludendo tiocianato). ²⁰ Per valutare la purezza delle AN risultante da estrazioni di fenolo-cloroformio, questi saggi colorimetrici può essere usato come una semplice alternativa a elettroforesi o trattamento DNasi. In questo e in altri modi, i saggi colorimetrici qui descritte possono essere combinate con metodi ben affermati per le proteine ​​e determinazione NA per realizzare un sistema rapido e robusto per chiarire l'RNA, DNA, proteine ​​e componenti in campioni biomolecolari eterogenei.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.