Snabba kolorimetriska analyser att kvalitativt Skilj RNA och DNA mot biomolekylär Prover

Summary

En svit av kolorimetriska analyser beskrivs för att snabbt skilja protein, RNA, DNA, och åter-rande socker i potentiellt heterogena biomolekylära prover.

Abstract

Biokemisk experiment kräver i allmänhet exakt kunskap, på ett tidigt stadium, av nukleinsyran, protein och andra komponenter biomolekylära i potentiellt heterogena prover. Nukleinsyror kan detekteras genom flera etablerade metoder, inkluderande analytiska metoder som är spektrofotometrisk (t.ex. A _260), fluorometrisk (t.ex. bindning av fluorescerande färgämnen), eller kolorimetriska (nukleosid-specifika kromogena kemiska reaktioner). ¹ Även om det inte kan lätt skilja RNA från DNA, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ förhållande används vanligen, eftersom den erbjuder ett enkelt och snabbt ² bedömning av den relativa halten av nukleinsyra, som absorberar övervägande nära 260 nm och protein, som absorberar huvudsakligen nära 280 nm. Förhållanden <0,8 tas som indikation på "rena" protein prover, medan ren nukleinsyra (NA) kännetecknas av förhållanden> 1,5 ^3.

HoWever finns scenarier där protein / NA innehåll inte kan vara lika tydligt eller tillförlitligt härledas från enkla UV-Vis spektrofotometriska mätningar. Till exempel, (i) Prover kan innehålla ett eller flera proteiner som är relativt saknar de aromatiska aminosyrorna ansvarar för absorption vid ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), såsom är fallet med några små RNA-bindande proteiner, och (ii) prov kan uppvisa mellanliggande A ₂₆₀ / A ₂₈₀ nyckeltal (~ 0,8 <~ 1,5), där proteinet / NA innehåll är långt mindre klart och kan även spegla en viss hög affinitet association mellan protein och NA-komponenter. För sådana scenarier beskriver vi här en rad kolorimetriska analyser att snabbt skilja RNA, DNA och reducerande sockerarter i en potentiellt blandat urval av biomolekyler. Metoderna är beroende av differentiella känslighet pentoser och andra kolhydrater till Benedictus, Bial s (orcinol) och Dische s (difenylamin) reagenser, de strömlinjeformade protokollen kan jämförasslutfördes under några minuter, utan några ytterligare steg för att behöva isolera komponenterna. Analyserna kan utföras parallellt för att skilja mellan RNA och DNA, samt indikera närvaron av fria reducerande sockerarter såsom glukos, fruktos, och ribos (Figur 1).

Introduction

Mycket av cellbiologi sker via molekylära interaktioner mellan DNA och RNA. ⁴ Dessa naturligt förekommande nukleinsyror (NAS) samverkar med varandra, ⁵ med proteiner, ⁶ och med en mängd små molekylföreningar och ligander in vivo (t.ex., tvåvärda katjoner ^7). De interaktioner kan vara kort-eller långlivat (kinetiskt) kan variera från hög till måttlig till låg affinitet (termodynamisk styrka), och kan också uppvisa betydande variation i kemiska egenskaper och specificitet - vissa sammanslutningar är ganska specifika (t.ex. DNA · · · transkriptionsfaktorer, RNA · · · skarvning faktorer), medan andra interaktioner med nödvändighet mycket mer generisk (t.ex. DNA · · · bakteriella histon-liknande HU proteiner ^8). Icke-specifika interaktioner med Nas kan få praktiska konsekvenser för in vitro försök med blandningar av biomolecules, eftersom det är möjligt, och med troligt, att vissa nationella programkontoren kommer att associera med biomolekylerna av intresse, åtminstone under någon del av de experimentella betingelser som används (jonstyrka, pH, osv).

Tänk till exempel produktion av ett protein av intresse (POI) genom heterolog överuttryck av det rekombinanta proteinet i Escherichia coli cellodling, ett sådant förfarande rutinmässigt i praktiskt taget alla strukturbiologi labb ⁹ I förberedelserna för ytterligare experiment, så. som biokemisk / biofysikalisk karaktärisering, kristallisering osv., inledande insatser generellt inriktas på att få en tillräcklig mängd av POI i så ren form som möjligt, helst som en kemiskt homogen och biofysiskt monodispersa exemplar. Efter avbrott av värdceller, de tidiga stadierna av en typisk rening arbetsflöde syftar till att isolera POI från E. coli-proteiner, nukleinsyror, cellvägg skräp,och andra komponenter i det cellulära lysatet. Dock kan värd nationella programkontoren tillsammans rena med POI flera fysikalisk-kemiska skäl - en mycket grundläggande POI kan ospecifikt rullgardinsmenyn värd DNA / RNA, POI kan ha en allmän NA-bindande aktivitet (t.ex. den tidigare nämnda HU); intressepunkten kan vara en ganska specifik NA-bindande protein men uppvisar korsreaktivitet med värd RNA eller DNA, värd nationella programkontoren kan interagera med en kromatografimatris och därigenom enkelt sam-eluera med intressepunkten, och så vidare. Godtycklig, högaffinitetsbindning av värd NAS till en IP kan utgöra ett förargliga problem eftersom NA föroreningar sannolikt störa nedströms experiment (t.ex. fluorescensanisotropi analyser av POI • RNA-bindning ^10). Alternativt · oväntad POI · · NA föreningar också kan ses slump, eftersom sådana interaktioner belyser POI nukleinsyrabindande kapacitet. Hursomhelst, om nationella programkontoren är viktiga komponenter eller föroreningar, måste en kvantifiera först ochidentifiera typen (DNA, RNA) i sam-renande nationella programkontoren inför nedströms experiment.

Flera analytiska metoder finns för att detektera och kvantifiera nas i ett prov. De flesta av de tillgängliga metoderna är i grunden antingen spektrofotometrisk (t.ex. en ₂₆₀ absorbansvärden och A ₂₆₀ / A ₂₈₀ nyckeltal), fluorometrisk (t.ex. bindning av tiazolorange eller andra fluorescerande färgämnen Na) eller kolorimetrisk (mottaglighet nukleosider till kemiska reaktioner att avkastningen kromoforer absorberar i UV-VIS området av det elektromagnetiska spektrumet), såsom nyligen beskrivits av De Mey et al. ¹ är emellertid avgörande steget att identifiera den typ av polynukleotid som RNA eller DNA utanför ramen för många av dessa kvantifiering tillvägagångssätt. Här erbjuder vi en uppsättning kolorimetriska analyser för att snabbt identifiera vilka typer av NA komponenter i en proteinhaltig prov.

Protokollen som beskrivs här cen effektivt utföras utan ytterligare steg att isolera de potentiella föroreningarna NA, och förlita sig på Benedictus analys för reducerande sockerarter ^11, den orcinol analys för pentoser ^12,13, och difenylamin reaktioner ^14,15 av 2'-deoxypentoses (figurerna 1 och 2) . Benedict test (figur 2a) utnyttjar förmågan hos linjära, öppen kedja (aldehyd) formen av en aldos socker för att minska Cu ^{2 +,} med samtidig oxidation av sockrets karbonyl till en karboxylat-grupp och produktion av Cu ₂ O som en olöslig röd fällning. Denna reaktion kommer att testa positivt med fria reducerande sockerarter såsom aldoser och ketoser (som omvandlas till motsvarande aldoser via endiol intermediärer), men inte med pentos socker som är låsta i cyklisk form som en del av den kovalenta ryggraden i en DNA-eller RNA-polynukleotid. På grund av den minimalistiska kravet på en fri hemiacetal funktionalitet, andra compounds som kan testa positivt i denna analys - och därmed fungera som potentiella störande - inkluderar α-hydroxi-ketoner och korta oligosackarider (t.ex. disackarid maltos). Både Bial s orcinol (figur 2b) och Dische s difenylamin (Figur 2c) reaktioner baserat på initial förstörelse av polynukleotiden ryggraden via depurinering av nukleosiden och ytterligare syra-eller bas-katalyserad hydrolys av de överordnade nukleotider, för att ge furan-2 -karbaldehyd (furfural) derivat, dessa derivat reagerar sedan med antingen en polyhydroxi fenol, såsom orcinol (Bial s) eller difenylamin (Dische s) reagens för att bilda färgade kondensationsprodukter av i stort sett okända kemiska struktur. DNA: t mot RNA-specificiteten hos Dische s analysen beror på det faktum att den pentossockret måste vara 2'-deoxiderad för att vara mottagliga för oxidation till ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som reagerar vidare med difenylaminunder sura betingelser för att ge en klarblå kondensat (figur 2c). Använda strömlinjeformade protokollen här har vi funnit att dessa socker-specifika kolorimetriska reaktioner kan skilja mellan RNA och DNA, och kommer också att visa på närvaron av fria reducerande socker, såsom glukos, fruktos, eller ribos i ett biomolekylär prov.

Protocol

1. Benedictus Analys för reducerande socker

1. Förbered en lämplig mängd Benedicts reagens - 940 mm vattenfritt natriumkarbonat, 588 mM natriumcitrat torkar, 68 mM koppar (II) sulfat pentahydrat. Denna reagens kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under minst sex månader med ingen märkbar förändring i reaktivitet.
2. Ovanstående reagenset är 6x. Sålunda, för 600 pl reaktioner, tillsätt 100 pl Benedicts reagens till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör (t.ex. Eppendorf varumärke) per prov som skall analyseras.
3. Lägg någonstans från 10 pl till 500 pl prov till detta rör, den optimala volymen kan bestämmas baserat på intensiteten av färgbildning i en initial provkörning. Om tillräckligt provet finns sedan börja sådana försök vid den maximala möjliga provvolymen (dvs fem sjättedelar av den totala reaktionsvolymen, 500 pl av provet i detta fall), och sedan späd i efterföljande analyser.
4. Lägg DDH ₂ O till TUvara att bringa den slutliga volymen till 600 pl, blanda lösningen genom vortexning eller pipettering.
5. Inkubera proverna under 20 min i ett kokande vattenbad.
6. Avlägsna den uppvärmda provet från badet och låt den svalna till RT under 10 minuter.
7. Centrifugera provröret vid> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min för att sedimentera något partikulärt material, detta steg är viktigare för kvantitativa snarare än kvalitativa studier.
8. Alikvotera supernatanten från detta rör till en ren kyvett.
9. Släcka UV-VIS spektrofotometer med vatten.
10. Mät absorbansen hos detta prov vid 475 nm.

2. Bial s orcinol analys för pentos Socker

1. Förbered en lämplig mängd färsk Bial reagens - 24,2 mM orcinol monohydrat (se figur 2b för strukturen av denna förening), 6 M HCl, 0,025% vikt / volym järnklorid hexahydrat Anm.:För förlängd lagring, kan Bial reagens framställas som två separata stamlösningar: (i) Reagens A [0,05% vikt / volym FeCl3 • 6H ₂ O i koncentrerad HCl] och (ii) Reagens B [422 mM orcinol-monohydrat framställdes i 95 % etanol]. Reagens A kan lagras vid rumstemperatur under sex månader, Reagens B kan lagras vid 4 ° C under en månad, täckt med folie för att begränsa ljusexponering. Dessa förrådslösningar blandas i en 15 (A): 1 (B) volym / volym-förhållande före användning.
2. Ovanstående reagenset är 2x. Sålunda, för 1,0 ml reaktioner, tillsätt 500 pl Bial reagens till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör, per prov som skall analyseras.
3. Lägg någonstans från 10 pl till 500 pl prov till detta rör. Enligt anmärkning 1,3 (ovan), om tillräcklig provet finns sedan börja rättegång reaktioner med hjälp av största möjliga provvolym (dvs. en halv totala reaktionsvolymen, 500 ul prov i det här fallet) och späd därifrån.
4. Lägg DDH ₂ O till röret för att bringa fInal volym till 1,0 ml, blanda lösningen genom vortexning eller pipettering.
5. Inkubera proverna under 20 min i ett kokande vattenbad.
6. Avlägsna den uppvärmda provet från badet och låt den svalna till RT under 10 minuter.
7. Centrifugera provröret vid> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min för att sedimentera något partikulärt material, detta steg är viktigare för kvantitativa snarare än kvalitativa studier.
8. Alikvotera supernatanten från detta rör till en ren kyvett för visuell inspektion.
9. För semikvantitativ analys, tom den UV-VIS spektrofotometer med vatten och mät absorbansen hos kyvettens provet vid 660 nm.

3. Dische s Difenylamin analys för 2'-deoxypentose Socker

1. Förbered en lämplig mängd Dische s difenylamin reagens - 60 mm difenylamin, 11 M isättika, 179 mM svavelsyra, 62% v / v etanol. Denna reagens kan preupprättats i förväg och lagrades vid rumstemperatur i en mörk behållare, eller täckt med folie, för att begränsa ljusexponering. På grund av ljuskänsligheten reagenset inte bör lagras på obestämd tid, men i praktiken kan det framställas varje två till tre månader utan någon märkbar förändring i reaktivitet.
2. Ovanstående reagenset är 2x. Sålunda, för 1,0 ml reaktioner, tillsätt 500 pl Dische reagens till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör, per prov som skall analyseras.
3. Lägg någonstans från 10 pl till 500 pl prov till detta rör. Enligt anmärkning 1,3 (ovan), om tillräcklig provet finns sedan börja rättegång reaktioner med hjälp av största möjliga provvolym (dvs. en halv totala reaktionsvolymen, 500 ul prov i det här fallet) och späd därifrån.
4. Lägg DDH ₂ O till röret för att bringa den slutliga volymen till 1,0 ml, blanda lösningen genom vortexning eller pipettering.
5. Inkubera proverna under 20 min i ett kokande vattenbad.
6. Avlägsna den uppvärmda provet från badet och allow den svalna vid RT under 10 min.
7. Centrifugera provröret vid> 9.300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min för att sedimentera något partikulärt material, detta steg är viktigare för kvantitativa snarare än kvalitativa studier.
8. Alikvotera supernatanten från detta rör till en ren kyvett för visuell inspektion.
9. För semikvantitativ analys, tom den UV-VIS spektrofotometer med vatten och mät absorbansen hos kyvettens provet vid 600 nm.

4. Ytterligare Användning Anmärkningar

1. Följande klasser av molekyler är lämpliga referens föreningar för positiva och negativa kontrollreaktioner för varje analys:
   • Benedictus - Positiv = fri ribos, fruktos, glukos, Negativ = RNA, DNA, ATP, osv. (Varje sackarid saknar en fri reducerande socker funktionalitet)
   • Bial s - Positiv = RNA (t.ex. bagerijäst extrakt), ribos, ATP, UMP, Negativ = bovint Serum serumalbumin (BSA) eller något annat protein
   • Dische s - Positiv = DNA (t.ex. kalvtymus), Negativ = RNA, ATP, osv. (Icke-2'-deoxygenerat nukleotid)
2. Dessa analyser har visat sig vara ganska motståndskraftig mot föreningar som ofta används vid proteinrening, t.ex., vanliga salter såsom NaCl, (NH _{4) 2} SO ₄ och K ₂ SO ₄ interfererade inte, och reaktionerna visas generellt opåverkade av innehållet i utspädningsmedlet. Detergenter eller kaotropa medel såsom urea kan påverka reaktiviteten av analyserna om pH är mycket basiskt, ett neutralt till surt pH-intervall är i allmänhet mest optimalt för Bial s och Dische s analyser på grund av den underliggande reaktionskemin (se texten och protonerna i fig. 2b, c). Potentiellt suboptimala reaktionsbetingelser, misstänkta störande osv. ska testas från fall till fall, med hjälp av positiv och negativ kontroll experiment wed referensföreningar.

Representative Results

Resultat visas i figur 3 för applicering av dessa kolorimetriska analyser med kända referensföreningar. Representativa kvalitativa data visas för Benedicts (a), Bial s orcinol (b), och Dische s Difenylamin (c) analyser, och standardkurvor för dessa tre analyser visas i figur 4. I paneler 3 (ac), de vänstra fälten visar positiva / negativa kontrollexperiment med användning lämpligen reaktiva / oreaktiva analyter, dessa visuella resultat visas in situ, i kyvetterna som beskrivs i protokoll 1-3 (ovan). Den högra delpaneler visar en titrering serie för respektive analyt. I Benedikts analysen (a), är den positiva kontrollen ribos (0,42 mg / ml), medan negativa kontroller är vatten, en generisk protein (0,75 mg / ml BSA), och två icke-reducerande sockerarter (DNA vid 0,75 mg / ml och RNA vid 12,5 mg / ml). I orcinol analysen (b), de positiva kontrollerna är ribos (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml), och DNA (0,45 mg / ml), medan vatten och BSEtt protein (0,45 mg / ml) är negativa kontroller. I difenylamin analysen (c), är kalvtymus-DNA (0,45 mg / ml) visas som en positiv kontroll, och vatten, jästextrakt-RNA (7,5 mg / ml), ribos (0,15 mg / ml), och BSA (0,45 mg / ml) fungerar som negativa kontroller. Slutligen visar panelen (d) robusthet analyserna genom att visa Dische reaktion med prover av varierande heterogenitet: två koncentrationer av DNA visas som en positiv kontroll i de vänstra två proverna (kyvetter 1-2), DNA-RNA + blandningar ( vid olika förhållanden) visas i de följande tre prover (3-5), och de tre sista proven visar DNA i frånvaro (prov 6) eller närvaro (prov 7-8) av den nukleinsyra-bindande protein Hfq '. ¹⁶ Observera att det positiva resultatet av Dische s analys bevaras för DNA-innehållande prover även i närvaro av "kontaminerande" RNA eller protein.

Kvantitativ analys: Utspädningen intervallen i figur 3 (ac) paneler varierar eftersom varjereaktion har en distinkt visuell detektionsgräns, beroende på vilken typ av socker som analyseras. Spektrofotometrisk, snarare än visuell, kan detektion kan användas för att förbättra mätområden, till exempel som visas i figur 4 för (a) Benedictus, (b) Bial-talet, och (c) Dische s analyser. Även om protokollen beskrivs här är avsedda primärt kvalitativa analyser, möjliggör Beer-Lambert förhållande mellan absorbans och koncentration åtminstone semikvantitativ uppskattning av socker eller nukleinsyra innehåll. Som ett exempel på en standardkurva för kalibrering av Benedict test, är en linjär regression passning av absorbans (475 nm) mot ribos koncentration visas i fig 4 (a), felstaplar indikerar standardavvikelsen av n = 3 replikat, och kvadrerade korrelationskoefficienten tillhandahålls. Avvikelsen från linearitet vid mycket låga ribos koncentrationer (t.ex. 0,28 mM nollpunkt) speglar den begränsade känsligheten för denna analys. Även om somsäger främst är avsedda för kvalitativa studier har följande riktlinjer föreslås för semi-kvantitativ analys:

• För Benedictus analysen (Figur 4a): Reaktionen avläsning (A _475nm) visade sig vara linjär åtminstone över området 0,04 → 0,5 mg / ml analyt, som utförts i tre exemplar.
• För Bial s analysen (Figur 4b): Absorbansvärdena data (A _{660 nm)} var linjär åtminstone över intervallet 0 → 0,5 mg / ml analyt (bagerijäst-RNA), har analysen utförts i tre exemplar ^(R2 = 0,99 linjär regression koefficient). Även om proverna centrifugerades för förtydligande före absorbansmätningar, ingen fällningsmedel finns vid dessa låga koncentrationer av analyt och därför centrifugeringssteget var inte absolut nödvändigt. Analysen avviker från linjäritet vid analytkoncentrationer utanför detta område.
• För Dische s analys (Figur 4c): A _{600 nm} (R2 = 0,99). Handlingen i absorbans mot [analyt] började plana ut vid 0,90 mg / ml DNA, vilket indikerar gränsen för linjär respons regionen.
• Praktiska överväganden för kvantitativ eller semi-kvantitativ analys: Ta bort utfällt material som annars skulle störa absorbansavläsningar, alla tre analyser kräver centrifugering vid maximal hastighet (25.000 xg, eller vad gräns kan stå emot de mikrofugrör) för rimligt lång tid (t.ex. 20 minuter), vilket är särskilt viktigt vid högre analytkoncentrationer. Efter centrifugering kan klargjorda prover överföras till en kyvett eller mikroplatta (t.ex. 96-brunnars mikrotiterplattor) för bekväm absorbansmätningar.

Figur 1. Beslut träd för tillämpningen av analyserna. Börjar med en potentiellt heterogen urval av biomolekyler (t.ex., från hel-cellysat), kan de kolorimetriska analyser som beskrivs här användas för att bestämma om blandningen innehåller icke-reducerande sockerarter (Benedict test). Om så, Bial s orcinol test avslöjar vidare huruvida populationen av icke-reducerande sockerarter innehåller pentos ringar (såsom i DNA eller RNA), jämfört hexoser (t ex glukos, andra pyranoser) och eventuellt ytterligare andra aldoser. Slutligen, om provet innehåller åtminstone en måttlig fraktion av DNA då den 2'-deoxiribos ringen kommer att reagera (vid surgöring och uppvärmning) med Dische s difenylamin reagens, vilket ger en synbart blå kondensationsprodukt. Observera att detta diagram är ett beslut träd, inte ett flödesschema: logiken i analysresultaten visas serially, men analyserna kan utföras parallellt.

Figur 2. Underliggande kemiska reaktioner visas för de kolorimetriska analyser, med den detekterbara färgade produkten visade tillsammans med motsvarande reaktioner. (A) En olöslig, röd fällning av Cu ₂ O är det positiva resultatet av Benedictus analys för att minska socker. (B) Vid värmning och försurning, kommer sockerarter innehållande pentos ringar sönderdelas till furfural, vilket sedan reagerar med orcinol (Bial reagens) för att ge en löslig blågrön addukt. I Dische s analys avsaknad av en hydroxylsubstituent vid 2-positionen möjliggör en ringöppnande oxidationsreaktion, aldehydprodukten som ytterligare reagerar med difenylamin [(Ph) ₂ NH] för att ge en klarblå produkt. Kemisk structures fortfarande okända för de stora, multi-ring kondensationsprodukter av orcinol (b) och difenylamin (c) reaktioner.

Figur 3. Tillämpning av kolorimetriska analyser för referensföreningar och heterogena prover. Provresultaten visas för Benedictus (a), Bial s (b), och Dische s (c) kolorimetriska analyser. I (a) → (c), de vänstra delpaneler visar positiva / negativa kontroller med användning av lämpligt reaktiva / oreaktiva analyter och rätten delpaneler visar en titrering serie för varje analyt. Också visat är en illustrativ panel Dische reaktioner (d), vari analyten varierar i heterogenitet - antingen DNA enbart (vänster), DNA / RNA-blandningar av olika förhållanden (mitten) eller DNA i närvaro av en nukleinsyra-associerat protein ( 'Hfq'). Dessa panelerbeskrivs vidare i representativa resultat delen av texten.

Figur 4. Standardkurvor från analyser med referensföreningarna. Kalibreringskurvor visas för Benedictus (a), Bial s (b), och Dische s (c) analyser, som visar en representativ del av den linjära responsen regionen för varje analys. Den linjära regressionen passar och motsvarande korrelationskoefficienterna anges för varje analys. Standard bagerijäst-RNA (b) och kalvtymus DNA (c) var analyterna i dessa titrering serien. Klicka här för att se större bild .

Discussion

De kolorimetriska analyser som presenteras här erbjuder en enkel metod för att snabbt utvärdera den kemiska naturen av biomolekylära blandningar, såsom påträffas vid rening av proteiner, RNA eller komplex från hel-cellysat som förberedelse för vidare studier. Som strukturbiologi bedriver fler infödda-liknande församlingar, progressivt större utmaningar, såsom prov heterogenitet, kommer orsakas av de invecklade och flera komponenter komplex. Supramolekylära församlingar ofta endast marginellt stabila, och deras framgångsrika isolering kan kräva mindre stränga rening förhållanden (t.ex. som konstaterats för spliceosomal snRNP komplex ^17,18). Under sådana mildare förhållanden både äkta och oäkta POI · · · NA interaktioner är mer sannolikt att bestå och därmed störa efterföljande analyser med ett målprotein eller nukleinsyra. Ett nödvändigt första steg är att identifiera de typer av kemiska komponenter i dessa prover.

ve_content "> Metoder för att upptäcka RNA, DNA och protein varierar beroende på mängd och koncentration av analyter, tillgängliga resurser och tidsbegränsningar och kanske viktigast av allt, kan en i förväg kunskap om den troliga kemiska sammansättning analyterna. proteinhaltigt material detekteras med många väletablerade metoder, inklusive sådana som är spektroskopiska (A _280), hydrodynamiska (gelelektrofores), kemisk / kolorimetrisk ¹⁹ (t.ex. biuret test för peptidbindningar) och med stor känslighet och noggrannhet, via masspektrometri. Likaså, NAS kan upptäckas av spektroskopiska (A _260), fluorometrisk eller kemiska analyser (som beskrivs här). Varje typ av metod är kännetecknande styrkor och svagheter. Exempelvis PicoGreen, SYBR-guld och andra cyanin-baserade fluorescerande färger är ganska känsliga för nukleinsyra (många storleksordningar utanför kolorimetriska analyser), uppvisar olika grader av selektivitet (t.ex. PicoGreen för dubbelsträngat DNA binder SYBR-Guld mest NAS), och har även breda dynamiska intervall för kvantifiering syften. Men dessa metoder är inte utan gränser: färgämnena kräver mer avancerad utrustning för detektering (transilluminators för geler, spectrofluorometers för batch prover), jämfört med enkel visuell avläsning av kolorimetriska analyser, färgämnena behandlas som mutagena, besläktad med etidiumbromid, och det finns begränsningar för analysbetingelserna (t.ex. ett rekommenderat pH-intervall av 7-8,5 för SYBR-guld, en 30% minskning av PicoGreen signalintensiteten vid> 200 mM NaCl). Sålunda, kolorimetriska och fluorescens-baserade analyser är komplementära: nukleinsyra färgämnen kan vara särskilt användbart i fall av negativa resultat med de snabba kolorimetriska analyser, eller som ett sätt att mer noggrant (kvantitativt) expandera på de första resultaten från kolorimetriska analyser. En grundläggande fördel med de kolorimetriska NA protokollen, förutom enkel användning, är att de enbart förlita sig på den inneboende samarbetevalent struktur av NAS stället fold/3D strukturer, reaktiviteter, eller andra egenskaper hos biopolymeren som kan variera med sekvens.

Protokollen som beskrivs här är robusta mot de flesta svårigheter, särskilt när den utförs med enkel visuell inspektion av reaktionsprodukterna, särskild försiktighet måste iakttas för mer kvantitativa (spektrofotometriska) analyser. Till exempel i Benedikts analysen röda fällningsmedel (ppt) som bildas i närvaro av höga koncentrationer av ribos måste avlägsnas före spektrofotometrisk analys, detta uppnås lätt genom centrifugering. För Dische s analysen, är tillsats av difenylamin reagens åtföljd av bildning av en vit ppt som kan solubiliseras genom upphettning, en grön ppt som bildas i närvaro av DNA kan störa spektrofotometriska mätningar och måste avlägsnas före kvantitativ analys. Dessutom är varje analys baserad på kemiska reaktioner som är mottagligatill potentiella störande, som nämnts i inledningen, och mer detaljerad nedan. Slutligen kan vi konstatera att en hög relativ koncentration av RNA i en DNA / RNA-blandning kan maskera det förväntade positiva resultatet av Dische s analys, detta falska negativa för DNA härrör från det faktum att en hög molfraktion av RNA också reagerar via furfural mellanprodukter, med Dische s reagens, ger men en färglös produkt snarare än den blå addukten framställts genom reaktion med 2'-deoxypentose socker av DNA.

Potentiella störande: bortom det uppenbara fall av socker, lipider och proteiner är två andra biomolekyler som hypotetiskt skulle kunna orsaka problem med dessa kolorimetriska analyser på grund av korsreaktivitet (falska positiva) eller maskerade reaktivitet (falska negativa). I princip kan flera typer av cellulära lipider interfererar tänkas, inklusive glycosylglycerols och andra glycerolipider konjugerade till sockerarter, glykosfingolipider (t.ex. cerebrosides), saccharolipids (t.ex. glukosamin-derivat), lipopolysackarider, och så vidare. I praktiken är dessa klasser av lipider är osannolikt att ett problem i arbetet med lipofila proteiner eftersom de är relativt sällsynta, jämfört med de mycket rikligare fosfolipider och därför under detektionsgränser våra analyser. Eftersom de flesta av de ovannämnda cellulära lipider är uppbyggda hexoser (galaktos, glukos) snarare än pentoser, bör de inte inkräkta på falsk-positiva i Bial s eller Dische s analyser. Gratis monosackarider som kan ge falskt positiva inkluderar fruktos, galactofuranose eller andra furanoser. I en liknande anteckning, kan störningar från oönskade socker bli en fråga för rekombinanta proteiner som uttrycks med maltosbindande protein (MBP) taggar. I affinitetskromatografisteg används för att rena sådana fusionskonstruktioner, är maltos användes för att eluera proteinet, och det är tänkbart att kvarvarande maltos i nedströms preparat kan störa the Benedikts analys (det är den mest generella / ospecifik av analyserna, glukosenheterna av maltos bör inte reagera under Bial s eller Dische s). Således skulle en behöva vara försiktig i de post-kromatografiska steg för att säkerställa att kvarvarande maltos inte gav falska resultat. Vi har inte testat glukosylerade proteiner eller andra glykoproteiner, men vi misstänker att det skulle vara svårt att få en klar positivt resultat för förekomst av socker på sådana proteiner (eller glykolipid, proteoglykan eller andra glykokonjugat) eftersom vi förväntar oss att de glykan delarna skulle ligga under känslighetsgränsen för våra analyser. I princip, en lösning innehållande en fri aldohexos såsom glukos, frigöres från en glukosylerade protein via syrahydrolys, skulle testar positivt genom Benedikts analysen; liknande, bör en glykoprotein-härledd pentos, såsom xylos, ger ett positivt resultat i Bial s analys. Men i praktiken ett positivt resultat för glykoproteiner skulle kräva extremt h IGH proteinkoncentrationer, även för flerfaldigt glykosylerade polypeptider, på grund av den låga socker / protein-molförhållande.

De analysprotokoll som beskrivs här kan utökas och anpassas för att hantera gränserna för urvalet är litet - dvs små volymer eller låga koncentrationer av analyter. För begränsade urvalet mängder har vi funnit att reaktionerna kan skalas ner till 100-xl räckvidden (t.ex. med användning av PCR-rör och en termocykler för inkubationssteg). För små volymer prover vid låga koncentrationer (nära detektionsgränsen), en spektrofotometer utrustad med en platt-läsare kan användas, i sådana scenarier, skulle den enda förväntade svårigheten att avlägsna oönskade fällningsmedel före absorbansmätningar. Trots den begränsade detektionsområde av enkel visuell inspektion, är en fördel med det tillvägagångssätt som beskrivs här dess effektivitet och snabbhet, med prover som kan analyseras omedelbart vid upphettning.

"> Tillämpningar av protokollen presenteras här ingår att identifiera sam-renande föreningar, bedömning av RNA eller DNA renhet, och detektering av kvarvarande NA eller socker kontaminering i proteinprover. Exempelvis kan oönskade NA upptäckt av våra analyser tas bort från ett protein prep via kemiska medel (t.ex. alkalisk hydrolys av RNA) eller enzymatisk nedbrytning (t.ex. nukleasbehandling). Även om det finns alternativa metoder för sådana ansökningar, de metoder som beskrivs här är mycket effektiva när det gäller både tid och pengar, och kan därför lätt integreras i en experimentell arbetsflöde. tidig identifiering av sam-renande föreningar som fri reducerande socker, RNA, DNA eller protein kan vägleda utformningen av nedströms reningssteg, jämfört mödosam försök och studier error. En vanlig steg följa våra protokoll kan vara isolering av RNA från DNA och protein, genom tiocyanat-fenol-kloroform-extraktion, eller återvinning av DNA Alone (genom att utesluta tiocyanat). ²⁰ För att bedöma renheten av kontoren följer fenol-kloroformextraktioner, kan dessa kolorimetriska analyser användas som ett enkelt alternativ till elektrofores eller DNas-behandling. I detta och andra sätt kan de kolorimetriska analyser beskrivs här kombineras med väletablerade metoder för protein och NA beslutsamhet att uppnå en snabb och robust system för att klarlägga RNA, DNA och komponenter protein i heterogena biomolekylära prover.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.