Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Rapid Kolorimetriske Analyser til kvalitativt Skille RNA og DNA i biomolekylære Prøver

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

En pakke med kolorimetriske analyser er beskrevet for raskt skille protein, RNA, DNA, og re-ducing sukker i potensielt heterogene biomolekylære prøver.

Abstract

Biokjemiske eksperimentering krever generelt nøyaktig kunnskap, på et tidlig stadium, av nukleinsyre, protein, og andre komponenter i potensielt biomolekylære heterogene prøver. Nukleinsyrer kan påvises via flere etablerte tilnærminger, inkludert analytiske metoder som er spektrofotometriske (f.eks, en 260), fluorometrisk (f.eks, binding av fluorescerende fargestoffer), eller kolorimetriske (nukleosid-spesifikke kromogene kjemiske reaksjoner). 1 Selv om det ikke kan lett skille RNA fra DNA, A 260 / A 280 forholdet er vanligvis blir anvendt, som det tilbyr en enkel og rask 2 vurdering av den relative innholdet av nukleinsyre, som absorberer hovedsakelig nær 260 nm og protein, som absorberer hovedsakelig nær 280 nm. Prosenter <0,8 tas som en indikasjon på et 'rent' protein prøver, mens ren nukleinsyre (NA) er karakterisert ved forholdstall> 1,5 3.

HoWever, er det scenarier der protein / NA innholdet ikke kan være så tydelig eller pålitelig utledes fra enkle uv-vis spektrofotometriske målinger. For eksempel, (i) prøver kan inneholde ett eller flere proteiner som er relativt blottet for de aromatiske aminosyrer som er ansvarlige for absorpsjon ved 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), som er tilfellet med noen små RNA-bindende proteiner, og (ii) prøver kan fremvise mellomprodukt A 260 / A 280 forholdstall (~ 0,8 <~ 1,5), hvor proteinet / NA innhold er langt mindre klart og kan selv gjenspeile noen høy affinitet assosiasjon mellom proteinet og NA komponenter. For slike scenarier, beskriver vi her en pakke med kolorimetriske analyser for å raskt skille RNA, DNA, og reduserende sukker i en potensielt blandet utvalg av biomolekyler. Metodene stole på differensial følsomheten pentoses og andre karbohydrater til Benedict, Bial tallet (orcinol), og Dische er (difenylamin) reagenser, de strømlinjeformede protokoller kan være comgjennomført i løpet av minutter, uten noen ytterligere trinn for å måtte isolere komponentene. Assayene kan utføres i parallell for å differensiere mellom RNA og DNA, samt indikere tilstedeværelse av frie reduserende sukker som glukose, fruktose, og ribose (Figur 1).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mye av cellebiologi skjer via molekylære interaksjoner som involverer DNA og RNA. 4 Disse naturlig forekommende nukleinsyrer (NAS) interagerer med hverandre, 5 med proteiner, 6 og med en rekke små-molekyl forbindelser og ligander in vivo (f.eks, divalente kationer 7). Interaksjonene kan være kort eller lang levetid (kinetisk), kan variere fra høy til moderat til lav affinitet (termodynamisk styrke), og kan også oppvise betydelig variasjon i kjemiske egenskaper og spesifisitet - noen foreninger er ganske spesifikke (f.eks DNA · · · transkripsjonsfaktorer, RNA · · · skjøting faktorer), mens andre interaksjoner er nødvendigvis langt mer generisk (f.eks DNA · · · bakterielle histone-lignende HU proteiner 8). Uspesifikke interaksjoner med NAs kan ha praktiske konsekvenser for in vitro forsøk med blandinger av biomolecules, som det er mulig, og selv sannsynlig, at noen NAs vil assosiere med biomolekyler av interesse, i det minste under noen delsett av de eksperimentelle betingelser som er brukt (ionestyrke, pH, osv.).

Se for eksempel, fremstilling av et protein av interesse (POI) via heterolog over-ekspresjon av det rekombinante protein i Escherichia coli cellekultur; slik prosedyre blir rutinemessig utført i praktisk talt hvilken som helst strukturell biologi lab 9 Ved utarbeidelse for ytterligere eksperimenter, slik. som biokjemiske / biofysisk karakterisering, krystallisering osv.., innledende innsats generelt fokus på å skaffe en tilstrekkelig mengde av POI i så ren form som mulig, helst som en kjemisk homogen og biophysically monodisperse prøven. Etter avbrudd i vertsceller, de tidlige stadiene av en typisk rensing arbeidsflyt som mål å isolere POI fra E. coli proteiner, nukleinsyrer, cellevegg rusk,og andre komponenter av den cellulære lysatet. Imidlertid kan verten NAs samtidig rense med POI for flere fysiokjemiske grunner - en svært grunnleggende POI kan ikke-spesifikt pull-down vert DNA / RNA, POI kan ha en generisk NA-bindende aktivitet (f.eks nevnte HU); POI kan være en ganske bestemt NA-bindende protein, men utstillingen kryssreaktivitet med vert RNA eller DNA'er, vert NAs kan interagere med en kromatografi matrise og derved bare ko-eluer med POI, og så videre. Kritikkløs, høyaffinitetsbinding av vert NAs til en POI kan utgjøre en vexing problem fordi NA urenheter vil trolig påvirke nedstrøms eksperimenter (f.eks fluorescens anisotropi analyser av POI • RNA bindende 10). Alternativt, uforutsette POI · · · Ikke foreninger også kan sees tilfeldig, da slike interaksjoner belyse severdighetene nukleinsyre-bindende kapasitet. Uansett, om NAs er sentrale komponenter eller forurensninger, må man først kvantifisere ogidentifisere hvilken type (DNA, RNA) av co-rensing NAs i forberedelse til nedstrøms eksperimenter.

Flere analytiske metoder finnes for påvisning og kvantifisering av NAs i en prøve. De fleste av de tilgjengelige metodene er fundamentalt enten spektrofotometrisk (f.eks en 260 absorbansverdier og en 260 / A 280 forholdstall), fluorometrisk (f.eks binding av tiazolring oransje eller andre fluorescerende fargestoffer til NA), eller kolorimetrisk (følsomhet nukleosider til kjemiske reaksjoner at avkastning kromoforer absorberende i UV-vis område av det elektromagnetiske spektrum), som nylig er beskrevet av De Mey et al. 1 er imidlertid avgjørende skritt å identifisere hvilken type polynukleotid som RNA eller DNA utenfor rammen av mange av disse kvantifisering tilnærminger. Her har vi gi et sett av kolorimetriske assays for å raskt identifisere hvilke typer NA komponenter i et proteinholdig prøve.

Protokollene er beskrevet her cen effektivt utført uten ytterligere trinn for å isolere de potensielle NA urenheter, og stole på Benedicts analysen for reduserende sukker 11, den orcinol analysen for pentoser 12,13, og difenylamin reaksjoner 14,15 av 2'-deoxypentoses (figur 1 og 2) . Benedikt test (Figur 2a) utnytter evnen av den lineære, åpen-kjede (aldehyd) form av en aldose sukker å redusere Cu 2 +, med samtidig oksydasjon av sukkeret er karbonyl til et karboksylat gruppe og produksjon av Cu 2 O som en uløselig rød bunnfall. Denne reaksjonen vil teste positivt med frie reduserende sukker som aldoses og ketoses (som omdanner de tilsvarende aldoses via enediol mellomprodukter), men ikke med pentose sukker som er låst inn i syklisk form som en del av det kovalente ryggraden av et DNA-eller RNA-polynukleotidet. På grunn av den minimalistiske kravet av en fri hemiacetal funksjonalitet, andre compounds som kunne tester positiv i denne analysen - og derfor fungere som potensielle interferents - inkluderer α-hydroksy-ketoner og korte oligosakkarider (f.eks disakkaridet maltose). Både Bial største orcinol (Figur 2b) og Dische største difenylamin (figur 2c) reaksjoner er basert på innledende ødeleggelse av polynukleotidet ryggraden, via depurination av nukleosid og ytterligere syre-eller base-katalysert hydrolyse av de overordnede nukleotider, for å gi furan-2 -karbaldehyd (furfural) derivater, og disse derivater reagerer med enten en polyhydroksy fenol eksempel orcinol (Bial største) eller difenylamin (Dische tallet) reagenser for å danne fargede kondensasjonsprodukter av meste ukjent kjemisk struktur. DNA versus RNA Spesifisiteten til Dische s analysen stammer fra det faktum at den pentose sukker må være 2'-deoxygenated for å være utsatt for oksidasjon til ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som videre reagerer med difenylaminunder sure betingelser for å gi en lys blå kondensat (Figur 2c). Bruke strømlinjeformede protokollen beskrevet her, har vi funnet at disse sukker-spesifikke kolorimetriske reaksjoner kan skille mellom RNA og DNA, og vil også indikere tilstedeværelse av frie reduserende sukker som glukose, fruktose, eller ribose i biomolekylære prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Benedicts Assay for reduserende sukker

  1. Lag et passende mengde Benedicts reagens - 940 mM vannfritt natriumkarbonat, 588 mM natriumcitrat dehydrate, 68 mM kobber (II) sulfat-pentahydrat. Denne reagensen kan oppbevares ved romtemperatur (RT) i minst seks måneder uten merkbar endring i reaktivitet.
  2. Listen reagens er 6x. Således, for 600 ul reaksjoner, tilsett 100 ul Benedicts reagens til en ren 1,5 ml mikrosentrifugerør (f.eks Eppendorf merke), per prøve som skal analyseres.
  3. Legg alt fra 10 pl til 500 pl av prøven som dette røret, den optimale volum kan bestemmes basert på intensiteten av fargedannelse i en innledende prøvekjøringen. Hvis tilstrekkelig prøve er tilgjengelig så begynne slike forsøk ved det største mulige prøvevolum (dvs. fem sjettedeler av den samlede reaksjon volum, 500 pl av prøven i dette tilfellet), og deretter fortynne i etterfølgende analyser.
  4. Legg DDH 2 O til tuvære å bringe sluttvolumet til 600 ul; Bland oppløsningen ved å virvle eller pipettering.
  5. Inkuber prøvene i 20 min i et kokende vannbad.
  6. Fjern den oppvarmede prøven fra badekaret og la det avkjøles i RT i 10 min.
  7. Sentrifuger prøverøret ved> 9300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min for å sedimentere ethvert partikkelformig materiale, og dette trinnet er mer viktig for kvantitativ snarere enn kvalitativ studier.
  8. Aliquot supernatanten fra dette røret i en ren kyvette.
  9. Blank UV-VIS spektrofotometer med vann.
  10. Måle absorbansen denne prøve ved 475 nm.

2. Bial er orcinol Assay for pentose sukker

  1. Lag et passende mengde frisk Bial reagens - 24,2 mM orcinol monohydrat (se Figur 2b for strukturen av denne forbindelsen), 6 M HCl, 0,025% w / v jernklorid heksahydrat OBS.:For langtidslagring kan Bial reagens fremstilles som to separate stamløsninger: (i)-reagens A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O i konsentrert HCl] og (ii) Reagens B [422 mM orcinol monohydrat fremstilt i 95 % etanol]. Reagens A kan lagres ved RT i seks måneder, Reagens B kan lagres ved 4 ° C i én måned, dekket med folie for å begrense lyseksponering. Disse stamløsninger blandes i en 15 (A): 1 (B) v / v forhold før bruk.
  2. Listen reagens er 2x. Således, for 1,0 ml reaksjoner, tilsett 500 ul Bial reagens til en ren 1,5 ml mikrosentrifugerør, per prøve som skal analyseres.
  3. Legg alt fra 10 pl til 500 pl av prøven til dette røret. Pr note 1.3 (ovenfor), hvis tilstrekkelig prøve er tilgjengelig så begynne prøveperioden reaksjoner hjelp det største mulige prøvevolum (dvs. halvparten den samlede reaksjon volumet, 500 pl av prøven i dette tilfellet), og fortynn derfra.
  4. Legg DDH 2 O til røret for å bringe final volum til 1,0 ml, bland løsningen ved å virvle eller pipettering.
  5. Inkuber prøvene i 20 min i et kokende vannbad.
  6. Fjern den oppvarmede prøven fra badekaret og la det avkjøles i RT i 10 min.
  7. Sentrifuger prøverøret ved> 9300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min for å sedimentere ethvert partikkelformig materiale, og dette trinnet er mer viktig for kvantitativ snarere enn kvalitativ studier.
  8. Aliquot supernatanten fra dette røret i en ren kyvette for visuell inspeksjon.
  9. For semi-kvantitativ analyse, blank UV-Vis spektrofotometer med vann og måle absorbansen av kyvetten prøven ved 660 nm.

3. Dische er Difenylamin analyse for 2'-deoxypentose Sukker

  1. Lag et passende mengde Dische største difenylamin reagens - 60 mM difenylamin, 11 M iseddik 179 mM svovelsyre, 62% v / v etanol. Denne reagensen kan være preutarbeidet på forhånd og lagret ved RT i en mørk beholder, eller dekket med folie, for å begrense lyseksponering. På grunn av lyssensitivitet reagensen bør ikke oppbevares på ubestemt tid, men i praksis kan det være forberedt hver to til tre måneder uten åpenbare endringen i reaktivitet.
  2. Listen reagens er 2x. Således, for 1,0 ml reaksjoner, tilsett 500 ul Dische reagens til en ren 1,5 ml mikrosentrifugerør, per prøve som skal analyseres.
  3. Legg alt fra 10 pl til 500 pl av prøven til dette røret. Pr note 1.3 (ovenfor), hvis tilstrekkelig prøve er tilgjengelig så begynne prøveperioden reaksjoner hjelp det største mulige prøvevolum (dvs. halvparten den samlede reaksjon volumet, 500 pl av prøven i dette tilfellet), og fortynn derfra.
  4. Legg DDH 2 O til røret for å bringe det endelige volum til 1,0 ml, bland løsningen ved å virvle eller pipettering.
  5. Inkuber prøvene i 20 min i et kokende vannbad.
  6. Fjern oppvarmede prøven fra badekaret og allow den avkjøles ved RT i 10 min.
  7. Sentrifuger prøverøret ved> 9300 xg (~ 10.000 rpm i en FA45-24-11 Eppendorf fast vinkel rotor) i 5 min for å sedimentere ethvert partikkelformig materiale, og dette trinnet er mer viktig for kvantitativ snarere enn kvalitativ studier.
  8. Aliquot supernatanten fra dette røret i en ren kyvette for visuell inspeksjon.
  9. For semi-kvantitativ analyse, blank UV-Vis spektrofotometer med vann og måle absorbansen av kyvetten prøven ved 600 nm.

4. Ytterligere Merknader

  1. De følgende klasser av molekyler er passende referanse forbindelser for positive og negative-reaksjonene for hver analyse:
    • Benedikts - Positiv = gratis ribose, fruktose, glukose, Negativ = RNA, DNA, ATP, etc. (Noen saccharide mangler et gratis reduserende sukker funksjonalitet)
    • Bial tallet - Positiv = RNA (f.eks gjær ekstrakt), ribose, ATP, UMP, Negativ = storfe serum albumin (BSA) eller noe annet protein
    • Dische tallet - Positiv = DNA (f.eks kalvethymus), Negative = RNA, ATP, etc. (Alle ikke-2'-deoxygenated nukleotid)
  2. Disse analysene har blitt funnet å være ganske motstandsdyktige mot forbindelser som ofte benyttes i proteinrensing, for eksempel, vanlige salter som NaCl, (NH 4) 2 SO 4 og K 2 SO 4 ikke forstyrre, og reaksjonene vises generelt upåvirket av innholdet av fortynningsmiddelet. Vaskemidler eller chaotropic agenter som urea kan påvirke reaktiviteten av analysene hvis pH er svært grunnleggende; en nøytral til surt pH-område er generelt mest optimal for Bial-og Dische største analyser på grunn av den underliggende kjemiske reaksjoner (se teksten og protonene i figur 2b, c). Potensielt suboptimale reaksjonsbetingelser, mistenkte interferents, osv.. bør testes på et sak-til-sak basis, ved hjelp av positiv og negativ kontroll eksperimenter wed referanse forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultatene er vist i Figur 3 for påføring av disse kolorimetriske assays til kjente referanseforbindelser. Representative kvalitative data er vist for Benedict (A), Bial største orcinol (b), og Dische største difenylamin (c) analyser, og standardkurver for disse tre analysene er vist i figur 4.. I paneler 3 (AC), venstre paneler viser positive / negative kontroll forsøk med videooverføring reaktive / reaktivt analytter, disse visuelle resultater er vist i situ, i kyvettene som beskrevet i protokoller 1-3 (ovenfor). Høyre sub-paneler viser titrering serie for hver respektive analytt. I Benedicts analyse (a), er den positive kontrollen ribose (0,42 mg / ml), mens negative kontroller er vann, et generisk protein (0,75 mg / ml BSA), og to ikke-reduserende sukker (DNA på 0,75 mg / ml og RNA ved 12,5 mg / ml). I orcinol analyse (b) viser de positive kontrollene er ribose (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml), og DNA (0,45 mg / ml), mens vann og BSEt protein (0,45 mg / ml) er negative kontroller. I difenylamin analyse (c), er kalvethymus DNA (0,45 mg / ml) vist som en positiv kontroll, og vann, gjærekstrakt RNA (7,5 mg / ml), ribose (0,15 mg / ml), og BSA (0,45 mg / ml) tjene som negative kontroller. Endelig illustrerer panel (d) robustheten av analysene ved å vise Dische reaksjon med prøver av varierende heterogenitet: to konsentrasjoner av DNA er vist som en positiv kontroll i venstre to prøver (kyvetter 1-2), DNA + RNA blandinger ( ved forskjellige forhold) er vist i de neste tre prøver (3-5), og de tre siste prøver viser DNA i fravær (Prøve 6) eller tilstedeværelse (prøver 7-8) av nukleinsyre-bindende protein "Hfq '. 16 Merk at det positive resultat av Dische sin analysen er bevart for DNA-holdige prøver, selv i nærvær av 'forurensende' RNA eller protein.

Kvantitativ analyse: fortynningen områder i figur 3 (ac) paneler varierer fordi hverreaksjonen har en distinkt visuell deteksjonsgrense, avhengig av hvilken type sukker som analyseres. Spektrofotometriske, snarere enn visuell, kan deteksjon brukes til å forbedre de måleområder, f.eks som vist i figur 4 for (a) Benedict, (b) Bial designet, og (c) s Dische assays. Selv protokollen beskrevet her er ment som primært kvalitative bestemmelser, muliggjør Beer-Lambert relasjon mellom absorbans og konsentrasjon minst semikvantitativ estimering av sukker eller nukleinsyre innhold. Som et eksempel på en standard kurve for kalibrering av Benedict test, er en lineær regresjon anfall av absorbans (475 nm) mot ribose konsentrasjon vist i figur 4 (a); feilfelt indikerer standardavviket av n = 3 replikater, og kvadrerte korrelasjonskoeffisient tilbys. Avviket fra linearitet ved svært lave ribose konsentrasjoner (f.eks 0,28 mM nullpunkt) reflekterer begrenset sensitivitet av denne analysen. Selv om somsier er primært beregnet for kvalitative studier, er følgende retningslinjer foreslått for semi-kvantitativ analyse:

  • For Benedicts analysen (Figur 4a): Reaksjonen utlesing (A 475nm) ble funnet å være lineær i det minste over området 0,04 → 0,5 mg / ml analytt, slik den ble utført i triplikat.
  • For Bial største analysen (Figur 4b): absorbansen data (A 660nm) var lineær minste over området 0 → 0,5 mg / ml analytt (bakegjær RNA), etter å ha analysen utført i triplikat (R 2 = 0,99 lineær regresjon koeffisient). Selv prøvene ble sentrifugert for avklaring før absorpsjonsmålinger, ble ingen fellingsmidlet funnet ved disse lave konsentrasjoner av analytten og derfor sentrifugeringstrinnet var ikke strengt nødvendig. Analysen avviker fra linearitet ved analyttkonsentrasjoner konsentrasjoner utover dette området.
  • For Dische er analysen (Figur 4c): The A 600nm (R2 = 0,99). Plottet av absorbans mot [analytt] begynte å platå 0,90 mg / ml DNA, som angir grensen for lineær respons regionen.
  • Praktiske hensyn for kvantitative eller semi-kvantitativ analyse: Slik fjerner utfelt materiale som ellers ville forstyrre avlesninger, alle tre analysene krever sentrifugering ved maksimal hastighet (25000 xg, eller hva grensen kan motsto av mikrofugerør) for rimelige lengder av gangen (f.eks 20 min), og dette er spesielt viktig ved høyere analytt konsentrasjoner. Etter sentrifugering, kan avklares prøvene overført til en kyvette eller mikroplate (f.eks, 96-brønns mikrotiterplater) for praktisk absorpsjonsmålinger.

Figur 1 Figur 1. Beslutningstre for påføring av analysene. Starter med en potensielt heterogen prøve av biomolekyler (f.eks, fra hel-cellelysater) kan kolorimetriske assays beskrevet her brukes for å avgjøre om blandingen inneholder ikke-reduserende sukker (Benedict test). Hvis ja, så Bial er orcinol test avslører videre om befolkningen av ikke-reduserende sukker inneholder pentosefosfateveien ringer (som i DNA eller RNA), versus heksoser (f.eks glukose, andre pyranoses) og muligens ennå andre aldoses. Til slutt, hvis prøven inneholder minst en moderat brøkdel av DNA deretter 2'-deoksyribose ring vil reagere (ved surgjøring og oppvarming) med Dische største difenylamin reagens, hvilket gav en synlig blå kondensasjonsprodukt. Vær oppmerksom på at dette diagrammet er en beslutning treet, ikke et flytskjema: logikken i analyseresultatene er vist serially, men analysene kan utføres i parallell.

Figur 2
Figur 2. Underliggende kjemiske reaksjonene er vist for de kolorimetriske assays, med den detekterbare farget produkt indikert sammen de tilsvarende reaksjoner. (A) en uløselig, rød bunnfall av Cu 2 O er det positive resultat av Benedicts analysen for reduserende sukker. (B) Ved oppvarming og forsuring vil sukker inneholdende pentose ringene brytes ned til furfural, som deretter reagerer med orcinol (Bial reagens) for å gi et oppløselig blågrønn addukt. I Dische s analysen, mangel på en hydroksyl-substituent i 2-stillingen muliggjør en ringåpnings-oksidasjonsreaksjon, aldehydet produktet som ytterligere reagerer med difenylamin [(Ph) 2 NH] for å gi et sterkt blått produkt. Kjemisk structures forbli ukjent for de store, multi-ring kondensasjonsprodukter av de orcinol (B) og difenylamin (c) reaksjoner.

Figur 3
Figur 3. Anvendelse av kolorimetriske assays for referanseforbindelser og heterogene prøver. Prøveresultat er vist for Benedict (a), Bial tallet (b), og Dische'S (c) kolorimetriske analyser. I (a) → (c), til venstre, sub-paneler viser positive / negative kontroller av egnede reaktive / reaktivt analytter og retten underrubrikker paneler viser titrering serie for hver analytt. Også vist er et illustrerende panel av Dische reaksjoner (d) karakterisert ved at analytten varierer i heterogenitet - enten DNA alene (venstre), DNA / RNA blandinger av ulike forhold (midten) eller DNA i nærvær av en nukleinsyre-assosiert protein ( 'Hfq'). Disse paneleneer nærmere beskrevet i den representative resultater delen av teksten.

Figur 4
Figur 4. Standardkurver fra analyser med referanseforbindelser. Kalibreringskurver er vist for Benedict (a), Bial'S (b), og Dische'S (c) analyser, viser en representativ del av den lineære respons regionen for hver analyse. Den lineære regresjonen tilpasser og tilsvarende korrelasjonskoeffisienter er indikert for hver analyse. Standard bakegjær RNA (B) og kalvethymus DNA (c) var analytter i disse titrering serien. Klikk her for å vise større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De kolorimetriske analyser presenteres her tilby en enkel tilnærming for å raskt vurdere den kjemiske natur biomolekylære blandinger, som er oppstått når rensing proteiner, RNA eller komplekser fra hel-cellelysat i forberedelse for videre studier. Som strukturell biologi forfølger flere innfødte som forsamlinger, gradvis større utfordringer, som for eksempel prøve heterogenitet, vil bli stilt av intrikate og multi-komponent komplekser. Supramolecular samlinger er ofte bare marginalt stabil, og deres vellykkede isolasjon kan kreve mindre strenge rensing forhold (for eksempel, som finnes for spliceosomal snRNP komplekser 17,18). Under slike mildere forhold både autentisk og falske POI · · · Ikke interaksjoner er mer sannsynlig å vedvare og dermed blande seg inn i nedstrøms analyser med et mål protein eller nukleinsyre. En nødvendig første skritt er å identifisere hvilke typer kjemiske komponenter i disse prøvene.

ve_content "> Metoder for å oppdage RNA, DNA og proteiner varierer avhengig mengde og konsentrasjon av analytter, tilgjengelige ressurser og tidsbegrensninger og, kanskje viktigst, kan ens forkunnskaper om den sannsynlige kjemiske sammensetningen av analytter. proteinmaterialet bli oppdaget av mange veletablerte metoder, inkludert de som er spektroskopiske (A 280), hydrodynamisk (gelelektroforese), kjemisk / kolorimetrisk 19 (f.eks biuret test for peptidbindinger), og med stor følsomhet og nøyaktighet, via massespektrometri. Tilsvarende NAs kan påvises ved hjelp av spektroskopi (A 260), fluorometrisk eller kjemiske analyser (beskrevet her). Hver type metode har karakteristiske styrker og svakheter. Eksempelvis PicoGreen, SYBR-Gold og andre cyanine-baserte fluorescerende fargestoffer er ganske følsomme for nukleinsyre (mange størrelsesordener utover kolorimetriske analysen), utviser forskjellige grader av selektivitet (f.eks PicoGreen for dobbel-strandet DNA, binder SYBR-Gold mest NAS), og har også bred dynamiske områder for kvantifiseringsgrensen formål. Men disse metodene er ikke uten grenser: fargestoffer krever mer avansert utstyr for deteksjon (transilluminators for gels, spectrofluorometers for batch samples), versus enkel visuell avlesning av kolorimetriske analyser, fargestoffer behandles som mutagener, beslektet med etidiumbromid, og det er restriksjoner på analysebetingelser (f.eks en anbefalt pH-område på 7 til 8,5 for SYBR-Gold, en 30% reduksjon av PicoGreen signal intensitet ved> 200 mM NaCl). Således, kolorimetriske og fluorescens-baserte analyser er komplementære: nukleinsyre fargestoffer kan være særlig nyttig i tilfelle av negative resultater med den raske kolorimetriske analyser, eller som en måte til mer forsiktig (kvantitativt) ekspandere på initielle resultater fra kolorimetriske analyser. En grunnleggende fordel av de kolorimetriske NA protokollene, i tillegg til enkelhet i bruk, er at de er avhengige utelukkende på den iboende covalent struktur NAs snarere enn fold/3D strukturer, reaktiviteter eller noen andre egenskaper for biopolymer som kan variere med sekvens.

Protokollene er beskrevet her er robuste mot de fleste problemer, spesielt når utført med enkel visuell inspeksjon av reaksjonsprodukter, spesielle hensyn må tas for mer kvantitative (spektrofotometriske) analyser. For eksempel, i den Benedict analysen den røde precipitant (ppt) som dannes i nærvær av høye konsentrasjoner av ribose må fjernes før spektrofotometrisk analyse, og dette er lett oppnådd via sentrifugering. For Dische sin analysen, er tilsetningen av difenylamin reagens ledsaget av dannelse av et hvitt PPT som kan oppløseliggjøres ved oppvarming, en grønn PPT som former i nærvær av DNA kan interferere med spektrofotometriske målinger og må fjernes før kvantitativ analyse. I tillegg er hver analyse basert på kjemiske reaksjoner som er mottakeligetil potensielle interferents, som nevnt i innledningen og videre beskrevet nedenfor. Endelig bemerker vi at en høy relativ konsentrasjon av RNA i en DNA / RNA blanding kan maskere den forventede positivt resultat av Dische største assay, denne falske negativ for DNA stammer fra det faktum at en høy molfraksjon av RNA også reagerer, via furfuralforbindelsen mellomprodukter, med Dische største reagenser, gir, men en fargeløs produkt snarere enn den blå addukt fremstilt ved omsetning med den 2'-deoxypentose sukker av DNA.

Potensielle Interferents: Beyond the åpenbare tilfelle av sukker, fett og proteiner er to andre biomolekyler som kunne hypotetisk forårsake problemer med disse kolorimetriske analyser på grunn av kryss-reaktivitet (falske positiver) eller maskert reaktivitet (falske negative). I prinsippet kan flere typer cellulære lipider tenkes forstyrre, inkludert glycosylglycerols og andre glycerolipids konjugert til sukker, glykosfingolipider (f.eks cerebrosides), saccharolipids (f.eks glukosamin derivater), lipopolysaccharides, og så videre. I praksis er disse klassene av lipider er usannsynlig å utgjøre et problem i å jobbe med lipofile proteiner fordi de er relativt sjeldne, versus de mye mer rikelig fosfolipider, og derfor under deteksjonsgrenser av våre analyser. Fordi de fleste av de nevnte cellulære lipider er bygget på hexoser (galaktose, glukose) snarere enn pentoses, bør de ikke forstyrre som falsk-positive i Bial-eller Dische er analyser. Gratis monosakkarider som kan gi falske positive inkluderer fruktose, galactofuranose eller andre furanoses. På et beslektet notat, kan forstyrrelser fra uønskede sukker bli et problem for rekombinante proteiner uttrykt med maltose-bindende protein (MBP) koder. I affinitetskromatografi trinnene som brukes for å rense slike fusion konstruerer blir maltose brukes å eluere proteinet, og det kan tenkes at gjenværende maltose i nedstrøms forberedelser kunne forstyrre med the Benedikts analysen (det er den mest generelle / uspesifikke av analysene, glukose enheter av maltose bør ikke reagere under Bial-eller Dische tallet). Dermed måtte man utvise forsiktighet i post-kromatografiske skritt for å sikre at gjenværende maltose ikke ga falske resultater. Vi har ikke testet glykosylerte proteiner eller andre glycoproteiner, men vi tror at det ville være vanskelig å få et klart positivt resultat for tilstedeværelse av sukker på slike proteiner (eller glykolipid, proteoglykan, eller andre glykokonjugater) fordi vi forvente at sukkerkjedene molekyldeler ville ligge under følsomhet grensen av våre analyser. I prinsippet, en løsning som inneholder et fritt aldohexose eksempel glukose, frigjort fra en glykosylerte protein via syrehydrolyse, ville teste positive ved Benedicts assay, på samme måte, bør et glykoprotein-derivert pentose, slik som xylose, gi et positivt resultat i Bial største analyse. Imidlertid, i praksis et positivt resultat for glykoproteiner ville kreve ekstremt h igh protein konsentrasjoner, selv for multiplisere glykosylerte polypeptider, på grunn av lav sukker / protein molarforhold.

Analyseresultatene protokollen beskrevet her kan utvides og tilpasses for å håndtere grensene for lite utvalg - det vil si, små volumer eller lave konsentrasjoner av analytter. For begrensede prøvemengder har vi funnet at reaksjonene kan skaleres ned til 100-ul utvalg (for eksempel bruk PCR rør og en Termocycler for inkubasjon trinn). For små-volum prøver ved lave konsentrasjoner (nær deteksjonsgrensen), et spektrofotometer utstyrt med en plate-leser kan brukes, og i slike tilfeller, vil den eneste forventet vanskelighetsgrad være fjerning av en hvilken som helst uønsket precipitant før absorpsjonsmålinger. Til tross for den begrensede deteksjonsområde av enkel visuell inspeksjon, er en fordel med metoden beskrevet her sin effektivitet og hurtighet, med prøver som kan bli analysert umiddelbart etter oppvarming.

"> Anvendelser av protokollene presenteres her inkluderer identifisering av co-rensende forbindelser, vurdering av RNA eller DNA renhet, og påvisning av gjenværende NA eller sukker forurensning i proteinprøver. For eksempel kan uønskede NA oppdages av våre analyser bli fjernet fra et protein prep via kjemiske midler (for eksempel alkalisk hydrolyse av RNA) eller enzymatisk fordøyelse (f.eks nuklease behandling). Selv om det finnes alternative tilnærminger til slike søknader, metodene beskrevet her er svært effektiv i form av både tid og kostnader, og kan derfor lett integreres i en eksperimentell arbeidsflyt. Tidlig identifisering av co-rensing forbindelser som gratis reduserende sukker, RNA, DNA eller protein kan veilede utformingen av nedstrøms rensetrinn, versus arbeidskrevende prøving og feiling studier. En vanlig skritt følge våre protokoller kan være isolering av RNA fra DNA og protein, via tiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon, eller utvinning av DNA alone (ved å ekskludere tiocyanat). 20 For å vurdere renheten av NAS følge fenol-kloroform ekstraksjoner, kan disse kolorimetriske assays brukes som et enkelt alternativ til elektroforese eller DNase behandling. I denne og andre måter, kan de kolorimetriske assays beskrevet her kan kombineres med veletablerte metoder for protein og NA vilje til å oppnå en hurtig og robust system for å belyse den RNA, DNA, og proteinkomponentene i heterogene biomolekylære prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av University of Virginia og Jeffress Memorial Trust (J-971). Vi takker L. Columbus, K. Jain, og P. Randolph for personer diskusjoner og kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 4th, Wiley. (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. 4th, John Wiley & Sons. (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. The Biochemistry of the Nucleic Acids. 10th, Chapman and Hall. (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. RSC Pub. (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
Rapid Kolorimetriske Analyser til kvalitativt Skille RNA og DNA i biomolekylære Prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter