巨脂质体制剂成像和膜片钳电

Summary

重构功能膜蛋白组成界定成巨脂质体是一个功能强大的方法，结合膜片钳电。然而，传统的巨头脂质体产量可能与蛋白质的稳定性不相容。我们描述生产从单纯的脂质的巨脂质体或小脂质体含有离子通道的协议。

Abstract

离子通道电生理记录的已有化学定义的脂膜的重组一直是一个强大的技术确定并探讨这些重要的蛋白质的功能。然而，经典的制剂，如平面双层，限制了可被执行的操作和实验上的重建的信道和它的膜环境。巨脂质体的细胞状结构允许在不牺牲脂质环境控制的传统的膜片钳实验。

electroformation>10μm的直径依赖于一个薄的，有序的脂质膜沉积在电极表面的交变电压的应用产生巨大的脂质体是一种高效的平均值。然而，由于经典的协议需要从有机溶剂中的脂质沉积，它是不兼容不太可靠的膜蛋白，如离子通道，并必须进行修改。近日，公关已经开发otocols部分脱水的小我们已经适应了在我们的实验室中的含蛋白质的脂质体的脂质体，脂质体从电铸巨。

我们在座的背景下，设备，技术，脂质体分散的小巨脂质体和陷阱electroformation。我们开始尝试更具挑战性的协议之前，应首先掌握经典的协议。我们证明了小脂质体饱和盐溶液的蒸汽平衡的过程中，控制部分脱水。最后，我们演示过程的electroformation本身的。我们将描述简单，价格低廉的设备，可在内部，以产生高质量的脂质体，并描述在每一个阶段的准备目视检查，以确保最佳的效果。

Introduction

巨脂质体（通常称为巨室脂质体，或GUVs的）主要被用来研究的物理和物理化学的脂质双层，包括研究的双层变形，横向相共存（“木筏”），膜融合等 ^1-4。他们有一个严重的细胞样结构：膜周围的水的内部，比周围的水性缓冲液中，可以很容易作出不同的球壳。 ，顾名思义，他们是≈直径1-100微米，所以他们可以使用各种光镜方法成像。它们可使用渗透压梯度或机械施加张力拉紧，因此，虽然一般较软，它们的属性可以被操纵，易于处理。特别是控制的“刚性”的脂质体，使得它可以直接形成“脂质体连接”或切除电补丁。在过去，主要是在平面脂B进行离子通道重建ilayers。现在，巨脂质体形成的补丁，并使用相当颤动的常规电开发工具（荧光显微镜，微吸管，快速灌注和温度控制等 ）的能力，使得巨脂质体重建研究^5,6越来越有吸引力。

巨脂质体已作出许多战略。事实上，巨脂质体膨胀过程自发形成，当干脂质膜水化^4,7,8。的愿望更加迅速地准备更大，更均匀的脂质体的研究人员领导的其他方法，其中最主要的electroformation ^1,9。 electroformation也依赖于水化干燥的脂质膜，但加速的过程中，通过应用一个振荡电场穿过脂质膜。施加电场时，通过两个电极，无论是铂丝或铟锡氧化物（ITO）涂层的载玻片，分离水或缓冲和脂质沉积其上。加快脂质体肿胀，达到较高的产量较大的脂质体。因此，electroformation已经成为默认的方式产生巨大的脂质体^4。

的electroformation的机理还没有完全理解，大多数协议都是依靠经验（ 例如 ^10,11）。然而，我们可以学到一点什么期望考虑的理论和一些实证结果。人们普遍认为，的发生electroformation通过驱动电渗流的缓冲液层叠在沉积的脂质膜^10,11之间的脂质双层。脂质双层静电耦合热波动也可能是涉及^12。这些假说定性预测的电场的频率和强度，可用于^10,12的上限。特别是，据预测，高导电性的解决方案（ <eM>即生理盐溶液）减少电流体的力量，可能引发的脂质体electroformation的^12。电渗流速率一般随盐的浓度增加，并经常达到高峰，一些电场振荡频率（ 例如，尽管在不同的几何形状，Green 等人 ）。因此，较高的磁场强度和更高的频率是合理的，高导电性的解决方案，在一定限度内^10。

然而，膜蛋白的脂质沉积到电极上，即在有机溶剂中，然后蒸发掉，留下一个薄的脂质膜为electroswelling过程与通常的方法很可能是不相容的。解决这个困难主要有两个路径：巨脂质体形成后，将蛋白质或脂质沉积，以适应如何。我们的做法的基础上存入脂类和reconsti的别人^5,11tuted膜蛋白从暂停或大或小的“蛋白脂质体”。我们描述了过程冗长，更具挑战性的脂蛋白体纯化的蛋白质和脂类（科林斯和戈登， 在审查）。这里，我们描述的协议，在没有任何蛋白质的情况下，但它是相同的蛋白结合时，我们包括结果显示，含有离子通道TRPV1受体的蛋白脂质体可以转化成GUVs用于膜片钳电生理。在任何electroformation方法中，脂质沉积过程过程中的脂质样品目视检查是成功的关键。

我们的做法可能超出了专门的应用程序相关的离子通道重建。在规定的时间，因为我们第一次开发了这个协议，现在也被证明的方式，脂质沉积在电极electroformation如何影响所产生的GUVs组成的异质性。 Baykal-恰拉尔的等¹⁴表明，，仔细脱水脂质体形成的GUVs有2.5倍的变化较小的混溶性化转变温度的各种磷脂和胆固醇的混合物形成的GUVs。他们的工作表明，脂质，尤其是胆固醇，可从脂质混合物沉淀在沉积有机溶剂时，导致沉积的脂质膜的组合物中的大的空间变化。脂质膜的相行为的研究，这是特别重要的，但也可以是离子通道功能的定量实验的关键。巴伊卡尔恰拉尔等人的协议是我们自己相似但不完全相同的，并鼓励读者研究。

此协议（见概述， 图1）是一个可以使用的许多。在原则electroformation成功依赖于脂质混合物，水化，温度，其他溶质（特别是离子），和当然，形成中使用的电压和频率。 ，由于electroformation变得更好理解，我们预期更加完善我们的协议。

最后，在电铸巨脂质体往往有一个陡峭的学习曲线。我们建议掌握学习脂质沉积脂质体悬浮液（2-5节）之前，传统的协议（第1和第4，和，如果有必要的话，第5节）。

Protocol

1。脂质沉积有机溶剂：古典协议删除脂质储存于-20℃或-80℃;温暖RT 注意：血脂极易吸湿，许多对氧气敏感。在干燥的氩气或氮气覆盖血脂，并在所有步骤尽量减少暴露在空气中 。 如果有必要，在氯仿或环己烷暂停脂类在1-10毫克/毫升，注意制造商声明的浓度通常标称注意：在使用有机溶剂时，戴上适当的手套和其他个人防护装备。删除个人防护装备，很快?…

Representative Results

在我们的例子中，我们准备了脂质体的混合物约55％（摩尔）POPC（1 -棕榈酰-2 -油酰-SN-甘油-磷酸胆碱），15％（摩尔）持久性有机污染物（1 -棕榈酰-2 -油酰-SN-甘油磷酸丝氨酸摩尔，30％胆固醇和0.1％（摩尔）德州红色标记的1,2 -二棕榈酰-SN-磷酸乙醇胺（TXR DPPE），这个组合被选为约代表性的背根神经节血脂18，我们注意到，扣除15％（摩尔）脂质（POPS）的限制，可用于?…

Discussion

发展成一个灵活的技术，兼容不同的血脂，准备和缓冲区巨脂质体Electroformation已。仔细的脂质沉积过程的控制是最关键的成功。我们已经提出了简单的工具，使小脂质体准备一个简单的过程控制血脂沉积。相对湿度是至关重要的适当初始脂质体脱水，将随溶质的初始浓度的脂质体悬浮液中的最佳值。较低的相对湿度是必需的，脱水更浓缩的样品，以适当的水平。

确切的的水?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667