イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤
Summary
定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。
Abstract
電気生理学的記録のために、化学的に定義された脂質膜へのイオンチャネルの再構成は、これらの重要なタンパク質の機能を識別し、探索するための強力な手法となっています。しかしながら、このような平面的な二重層のような古典的な製剤は、再構成されたチャネルと、その膜環境で行うことができる操作や実験を制限する。巨大リポソームの全表示セル状構造は、脂質環境の制御を犠牲にすることなく、従来のパッチクランプ実験を可能にする。
電鋳は効率的で巨大なリポソーム>薄い、順序付けられた脂質フィルムが電極表面に堆積する交流電圧の印加に依存して、直径が10μmを生成することを意味する。脂質は有機溶媒から析出させるために、古典的なプロトコルを呼び出ししかし、それはイオンチャネルと変更する必要がありますようにそれほど強固な膜タンパク質との互換性はありません。最近では、PRotocolsは私達が私達の研究室でタンパク質含有リポソームに適応している部分脱水小さなリポソームから巨大リポソームを電鋳するために開発されている。
我々はここで、背景、装置、技術、および小型のリポソーム分散液から巨大リポソームの電鋳の落とし穴を紹介。我々は従うより挑戦的なプロトコルを試みる前に、最初に習得すべきである古典的なプロトコルで始まる。私たちは、飽和塩溶液と蒸気の平衡を用いた小型リポソームの制御された部分的な脱水のプロセスを示しています。最後に、電鋳自体のプロセスを示す。我々は、高品質のリポソームを生成し、最良の結果を得るために各段階で調製物の目視検査を記述するために自社で製造することができる単純で安価な機器について説明する。
Introduction
ジャイアントリポソームは（しばしば巨大な単層小胞、またはGUVsと呼ばれる）は、主に二重層変形、横相共存（ "ラフト"）、膜融合など 1-4の研究を含む脂質二重層の物理学と物理化学を勉強するために使用されている。簡単に周囲の水性緩衝液よりも異ならせることができる水性内部を取り囲む膜の球殻：それらは著しくセル状構造を有している。それらは、定義により、直径が1〜100μmで≈ので、それらは光学顕微鏡様々な手法を用いて撮像することができるされている。それらは、一般的にソフトながら、それらの特性は、取り扱いが簡単に操作できるように、ピンと張っ用いて浸透圧の勾配または機械的に適用された張力を行うことができる。具体的には、リポソームの "剛性"電気生理学のための "リポソームに接続された"又は切除したパッチを形成することが簡単で制御することになる。過去には、イオンチャネルの再構成は、主に平面脂質（b）で実施したilayers。さて、巨大リポソームからパッチを形成し、従来の電気生理学のために開発されたツールのかなりの震え（蛍光顕微鏡、マイクロピペット吸引、急速潅流と温度制御など ） を使用する能力は、再構成の研究5,6のために巨大なリポソームがますます魅力的になります。
巨大リポソームは、多くの戦略によってなされている。乾燥した脂質膜は4,7,8を再水和されたとき、実際には、巨大なリポソームは腫れプロセスによって自発的に形成する。より急速に大きくなる準備をする欲求は、より均一なリポソームは、電鋳1,9そのうちチーフ他のアプローチへの研究を主導した。電鋳はまた、乾燥脂質膜の水和に依存するが、脂質膜を横切る振動電場を印加して処理を高速化する。フィールドまたは水によって分離され、二つの電極、白金線のいずれか、またはインジウムスズ酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライドを介して印加されるバッファとその上に脂質が堆積される。リポソームの膨潤をスピードアップすることで、人はより大きなリポソームの高収率を達成しています。したがって、電鋳、巨大リポソーム4を生成するデフォルトの方法となっています。
電鋳のメカニズムは完全には理解されるものではなく、プロトコルのほとんど（ 例えば 、10,11）経験的に開発されている。それにもかかわらず、我々は理論といくつかの実証結果を考慮することによって期待することについて少し学ぶことができます。これは、広く電鋳が堆積脂質膜10,11に積層され、個々の脂質二重層との間のバッファの電気浸透流を駆動することによって起こると考えられている。脂質二重層の熱揺らぎに静電結合はまた、おそらく12複雑です。これらの仮説は、定性的10,12を使用することができる電界の周波数および強度の上限を予測する。特に、その高い導電性溶液を予測している（ <eM>すなわち生理的塩溶液）がリポソーム電鋳12を開始することができる電気流体力を低減。電気浸透流速度は、一般に、塩濃度の増加に伴って減少し、頻繁にいくつかの電界発振周波数（ 例えば 、異なる幾何学的形状、Green ら。13であっても）でピークに達している。したがって、高い電界強度と高い周波数は制限10内、高導電性ソリューションのための合理的である。
しかしながら、膜タンパク質は、その後、薄い脂質フィルムを残すように蒸発させる有機溶媒中、すなわち、electroswelling手順については電極上に脂質を堆積する通常の方法と互換性があると思われる。この難しさの周りに二つの主要な経路があります：巨大リポソーム形成後にタンパク質を組み込むために、または脂質が堆積されているどのように適応する。我々のアプローチは、脂質とreconstiを堆積させるために他の人5,11上に構築小規模または大規模な "プロテオ"の懸濁液から一緒に膜タンパク質をtuted。我々は、（コリンズとゴードン、 レビューで）他の場所で、タンパク質と脂質を精製からプロテオリポソームを生成する長い、より挑戦的なプロセスについて説明します。ここでは、任意のタンパク質が存在しない場合にプロトコルを記述しますが、タンパク質が組み込まれているとき、それは同じであり、私たちはイオンチャネルTRPV1を含むプロテオがGUVsに変換され、パッチクランプ電気生理学に使用できることを示す結果が含まれています。任意の電鋳アプローチでは、脂質堆積プロセス中の脂質サンプルの目視検査が成功に不可欠である。
我々のアプローチはイオンチャネル再構成に専用アプリケーションを超えて関連しているかもしれません。まず現在、このプロトコルを開発してからの時間で、それはまた、脂質電鋳用電極上に積層された方法は、得られたGUVsの組成の不均一性をどのように影響するかが示されている。 BaykアルCaglar ら 14は慎重に脱水リポソームから形成GUVsは、様々なリン脂質とコレステロールの混合物から形成GUVsの混和転移温度で2.5倍小さい変動を有することを示した。彼らの仕事は、その脂質を示し、特にコレステロール、堆積された脂質膜の組成に大きな空間的変動を生じる有機溶媒から析出脂質混合物から沈殿し得る。これは、脂質膜の相挙動の研究のために特に重要であるだけでなく、イオンチャンネル機能に関する定量実験に重要であり得る。バイカル-Caglar らのプロトコルは似ていますが、私たち自身と同一ではない、と読者は、同様にそれを勉強することをお勧めします。
このプロトコルは、（概要、 図1を参照）を使用することができる、多くの一つである。原則電鋳の成功で脂質混合物、水和、温度、他の溶質（特にイオン）、およびに依存もちろん形成に使用される電圧および周波数を。電鋳は、より良い理解になると、我々はより多くの我々のプロトコルを絞り込むことを期待しています。
最後に、巨大リポソームを電鋳で急な学習曲線がしばしばあります。我々は、従来のプロトコル（セクション1と4、そして、必要に応じて、第5項）をリポソーム懸濁液（セクション2-5）から脂質を堆積させるために学習する前にマスタリングを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
巨大リポソームの電鋳は、多様な脂質、準備、およびバッファとの互換性が柔軟な手法へと発展しています。脂質堆積プロセスの注意深い制御が成功にとって最も重要である。私たちは小さなリポソーム製剤簡単なプロセスからの脂質の制御された堆積を作るための簡単なツールを提示している。相対湿度は、初期リポソームの適切な脱水するために重要であり、最適値は、リポソーム?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、電鋳装置を構築するためにブライアンVenema氏とエリック·マーティンソンに感謝します。この作品は、国立衛生研究所の総合医科学の国立研究所からの補助金（SEGへR01GM100718）と国立衛生研究所の国立眼研究所（SEGへR01EY017564）によって賄われていた。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Luisi, P. L., Walde, P. . Giant Vesicles. , (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. . International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H., Cevc, G. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. , (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
