Summary
Nous décrivons l'isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de Ca
Abstract
L'étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l'exploration de l'cardiaque Ca 2 + cellulaire anomalies manipulation nécessite cardiomyocytes isolés. En outre, la possibilité d'enquêter sur les myocytes de patients utilisant ces techniques est une condition indispensable d'élucider les bases moléculaires des maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire (FA). 1 Nous décrivons ici une méthode pour l'isolement des myocytes auriculaires humains qui sont adaptés à la fois études de patch-clamp et des mesures simultanées des concentrations de Ca 2 +. Tout d'abord, appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert sont coupés en petits morceaux de tissus («méthode du morceau") et lavées dans Ca 2 + sans solution. Puis les morceaux de tissus sont digérés dans la collagénase et la protéase contenant des solutions avec 20 uM Ca 2 +. Par la suite, les myocytes isolés sont harvested par filtration et la centrifugation de la suspension de tissu. Enfin, la concentration en Ca2 + dans la solution de stockage de cellules est ajusté par paliers de 0,2 mM. Nous discuterons brièvement le sens de Ca 2 + et Ca 2 + en mémoire tampon au cours du processus de séparation et aussi fournir des enregistrements représentatifs de potentiels d'action et des courants de la membrane, à la fois simultanée avec Ca 2 + mesures transitoires, réalisée dans ces myocytes isolés.
Introduction
L'étude des propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques cardiaques avec la technique de patch-clamp et l'exploration de Ca 2 + cellulaire anomalies de manutention nécessitent cardiomyocytes isolés. Ils sont généralement obtenus à la suite de l'exposition à in vitro d'échantillons de tissus cardiaques aux enzymes digestives (collagénase, hyaluronidase, peptidase, etc.) Depuis le premier rapport de l'isolement des myocytes cardiaques viables en 1955 2 une grande quantité de protocoles a été développé dans le but de récolter des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires simples de différentes espèces, y compris souris, rat, lapin, chien, cochon Guinée et humain. Dans cette revue, nous nous concentrons sur l'isolement des myocytes auriculaires humains. En ce qui concerne les procédures d'isolement des myocytes d'autres espèces que nous appelons le "Guide de Worthington Tissue dissociation» fourni par Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
et al. 3 Ici nous fournissons une description étape par étape, d'une technique, qui est une adaptation d'une méthode publiée précédemment, afin de obtenir myocytes auriculaires appropriés non seulement pour les expériences de patch-clamp, mais aussi pour Ca2 + intracellulaire mesures simultanées. 4-11
Protocol
Les protocoles expérimentaux doivent être approuvés par le comité d'éthique local et tous les patients ont besoin de donner un consentement éclairé écrit. Notre recherche a été approuvé par le comité d'éthique de la Faculté de médecine de Mannheim, Université de Heidelberg (# 2011-216N-MA) et a été réalisée en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé.
0. L'obtention de tissu auriculaire humain
Pendant les procédures de cathétérisme routine chez les patients subissant une chirurgie à coeur ouvert pour la circulation extracorporelle greffe, la pointe de l'appendice auriculaire droit est habituellement retiré et peut être utilisé pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires. Après l'excision de l'échantillon de tissu est transféré immédiatement dans un tube Falcon de 50 ml avec du Ca 2 + libre stérile solution de transport contenant la 2,3-butanedione monoxime (tableau I; BDM, inhibiteur contractile, ce qui empêche des myocytes contracture). Avec des temps de transport entre 30 et 45 min, nous n'avons pas reconnu un net avantage de refroidissement ou d'oxygénation par rapport à la fois le nombre et la qualité des cardiomyocytes auriculaires isolées. Dans les transports en général au laboratoire doit être aussi rapide que possible. Toutefois, si le temps de transport plus ne peut être évitée, transport à 4 ° C dans une solution oxygénée pourrait être avantageux.
1. Préarrangements
- Allumez le thermocirculator, qui contrôle la température du récipient à double enveloppe (tableau II). Assurez-vous que la température dans le bécher est égal à 37 ° C. Recouvrir d'un couvercle en verre pour maintenir une température constante à l'intérieur du récipient à travers le processus d'isolement ensemble.
- Peser la collagénase I et protéase XXIV dans trois récipients en verre et stocker à température ambiante. Les enzymes seront dilués juste avant utilisation.
- Magasin 20 ml de Ca 2 + solution libre dans une boîte de Petri à 4 ° C.
- Magasin 250 ml de solution de Ca 2 + libre dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Nettoyage du tissu
- Transférer l'échantillon de tissu avec la solution de transport dans une boîte de Pétri (~ 10 cm de diamètre) et enlever les tissus adipeux grossièrement avec des ciseaux.
- Peser l'échantillon de tissu. Entre 200 et 600 mg sont utilisés pour l'isolement de cellules. Le tissu restant peut être congelé dans l'azote liquide pour une analyse ultérieure biochimique.
- Transférer l'échantillon de tissu dans la boîte de Petri contenant 20 ml de Ca 2 + solution à 4 ° C (voir l'étape 1.3) et hacher l'échantillon de tissu en petits morceaux d'environ 1 mm 3 dans la taille.
- Les étapes suivantes doivent être exécutées à 37 ° C et sous gazage continu avec 100% d'O 2. Un embout de pipette peut être placé sur le tube d'oxygène pour éviter la formation de bulles et de forte générer un flux d'air continu.
- Transférer les morceaux de tissu avec la solution sans Ca + 2 endans le bécher enveloppe et mélangez soigneusement pendant environ 3 min avec un agitateur magnétique.
- Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s'installer pendant quelques secondes. Filtrer soigneusement le surnageant à l'aide d'un filet de nylon (200 um, tableau II). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher aide d'une pince.
- Remplir le bécher avec Ca 2 + solution libre et répéter l'étape de lavage 2.4 et 2.5 deux fois.
3. Première digestion enzymatique
- Re-suspendre les morceaux de tissus avec 20 ml Enzyme solution E1 (tableau I) contenant de la collagénase et la protéase et mélangez soigneusement pendant 10 min.
- Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +.
- Après filtrer le surnageant 35 min soigneusement à travers un tamis en nylon (200 um, Tableau II) de façon que la majeure partie des morceaux de tissu restent dans le bécher. Retour reposplu morceaux de tissus provenant de la maille dans le bécher.
4. Deuxième digestion enzymatique
- Reprendre les morceaux de tissus de nouveau avec 20 ml enzyme E2 solution contenant de la collagénase I seulement (tableau I). Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution immédiatement pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +.
- Au cours de la deuxième utilisation des ciseaux de digestion de couper davantage caillots de tissus parfois.
- Après 5 minutes, prendre un échantillon à l'aide d'une pipette Pasteur pour vérifier la dissociation des cellules. Répétez cette opération tous les 2-3 min jusqu'à ce que la tige en forme de cardiomyocytes striés apparaissent.
- Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s'installer pendant environ 20-30 secondes.
- Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, Tableau II) dans un tube de 50 ml Falcon (Tube A). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher.
- Re-suspendre les morceaux de tissus dans le bécher avec 20 ml Storasolution GE (tableau I) 10 et plus dissocier les cellules par trituration mécanique douce à l'aide d'une pipette sérologique de 20 ml avec distributeur. Essayez d'éviter la formation de bulles depuis bulles sont préjudiciables à la survie et la qualité cellulaire.
- Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, tableau II) dans un ml Tube Falcon 50 (tube B).
5. Préparation finale et d'adaptation de Final concentration de Ca2 +
- Centrifugeuse deux Falcon tubes A et B (voir l'étape 4.5 et 4.7) à 95 g pendant 10 min.
- Eliminer le surnageant de deux tubes soigneusement par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot. Jeter le surnageant.
- Re-suspendre les boulettes dans une solution de stockage de 1,5 ml (tableau I) chacune (température ambiante).
- Ajoutez deux fois 7,5 pi de solution à 10 mM CaCl2 à chaque Falcon et mélangez soigneusement. Incuber pendant 10 minutes après chaque étape.
- Ajouter 15 ul d'une solution à 10 mM CaCl 2 pour obtenir une finale Ca 2 + concentration de 0,2 mM.
6. Chargement des myocytes avec le Ca 2 + Fluorescent indicateur Fluo-3 AM (Figure 1)
- Transférer 1,5 ml de suspension cellulaire (tube A et / ou du tube B) dans un microtube de 2 ml (tube Eppendorf).
- Les étapes suivantes doivent être exécutées à l'étude de la sensibilité à la lumière du Ca 2 + indicateur fluorescent Fluo-3.
- Dissoudre 50 mg du dérivé d'ester acétoxyméthylique perméable de la membrane de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tableau III) dans 44 pl de la Pluronic F-127 (tableau III) solution (20% p / v dans du DMSO anhydre) pour obtenir ± 1 mm Fluo-3 heures solution mère, qui peut être conservé à -20 ° C pendant au maximum 1 semaine.
- Ajouter 15 ul du Fluo-3 heures solution stock à la microtube contenant 1,5 ml de suspension cellulaire (voir l'étape 6.1) et agitersoigneusement.
- Incuber la suspension de cellules pendant 10 min dans une boîte optiquement opaque.
- Centrifuger brièvement à environ 6000 rpm.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans une solution de bain de 1,5 ml (Tableau IV).
- Laisser la suspension cellulaire pendant environ 30 min pour désestérification avant le début des expériences.
7. Simultanés patch-clamp et épifluorescence Ca 2 + Mesures
Puisque les mesures de patch-clamp sont pas le sujet principal de cette étude, nous renvoyons le lecteur intéressé à d'autres publications fournissant une description plus détaillée de cette technique. 11-14 Par souci d'exhaustivité, nous donnons un bref résumé d'un protocole pour mesurer potentiels d'action ou de courants Ca 2 + de type L, les deux avec 2 enregistrements +-transitoires simultanées ca.
Au cours d'expériences myocytes sont perfusées à 37 ° C avec baignoire solutisur (Tableau IV) en utilisant un système de perfusion rapide (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Pour les expériences de potentiel imposé, courants K + sont bloquée par addition de 4-aminopyridine (5 mmol / L) et de BaCl 2 (0,1 mmol / L) à la solution du bain. Microélectrodes de verre borosilicate sont utilisés et auraient dû faire pencher résistances de 2-5 MQ quand il est rempli avec une solution pipette (Tableau V). En plus du Fluo-3 heures Chargement de la myocytes (voir l'étape 6), Fluo-3 est également inclus dans la solution pipette (Tableau V). La fluorescence est excitée à 488 nm et la lumière émise (<520 nm) converti en [Ca 2 +] i en supposant
où k d = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescence;. Fmax = Ca2 +-fluorescence saturée obtenue à la fin de chaque expérience 12 Les deux signaux électriques et épifluorescence Ca 2 + signaux sont enregistrés simultanément. Les potentiels d'action sont stimulés à 0,5 Hz en mode courant-clamp avec 1 ms impulsions de courant de la force de seuil 1.2x. De type L de Ca 2 +-courants sont mesurés en mode voltage-clamp à l'aide d'un potentiel de maintien de -80 mV et une de 100 msec rampe impulsion à -40 mV à inactiver la Na +-courant rapide, suivie d'une 100 msec test d'impulsion de 10 mV à 0,5 Hz.
Representative Results
La figure 2A montre trois exemples représentatifs de droits de myocytes oreillette droite isolés. Pour quantifier le rendement cellulaire nous pipette 10 ul de la suspension cellulaire (étape 5.5) sur une lame de microscope CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Les rendements des cellules moyennes dans la figure 2B indiquent clairement qu'il ya une tendance à la baisse des rendements des cellules en chronique AF (CAF) des échantillons de patients (d'un tube: 16,5 ± 3,1 cellules/10 pi (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 cellules/10 ul (n = 10) SR et de la CAF, respectivement, p <0,05; Tube B: 17,9 ± 3,9 cellules/10 ul (n = 29) vs 5,9 ± 2,0 cellules/10 ul (n = 9) SR et de la CAF, respectivement, p = 0,107).
Des exemples représentatifs de mesures d'action potentiels et des enregistrements simultanés de Ca 2 + cytosolique transitoires sont donnés dans la figure 3. Dans environ 90% des cellules étudiées, tIl potentiel d'action déclenché par Ca 2 + provoque des contractions de cellules claires et régulières. Comme indiqué précédemment, le potentiel de membrane au repos, ce qui est un indicateur reconnu pour l'intégrité des cellules, en moyenne de -73.9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytes / patients) et -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytes / patients ) en SR et de la CAF, respectivement (p> 0,05). 15 La figure 4 montre des enregistrements simultanés représentatifs de voltage-dépendant de type L Ca 2 + et courants Ca 2 + cytosolique transitoires. Application de la isoprénaline agoniste β-adrénergique non sélectif (1 nM) augmente les amplitudes des deux I Ca, L et cytosolique de Ca 2 + transitoires, suggérant intact β-adrénergique cascade de transduction du signal.
Figure 1. Diagramme des myocytes Fluo-3 heures chargement protocole (voir l'étape 6,1-6,5). m / v, masse / volume.
Figure 2. A, isolés myocytes auriculaires droits humains après une heure dans une solution de stockage. B, moyenne ± SEM du rendement des cellules comptées dans 10 pi de cellules dans une solution de stockage (voir l'étape 5.5). n désigne le nombre de préparations à l'intérieur de chaque groupe. * P <0,05.
Figure 3. Enregistrements représentatifs du potentiel d'action déclenché par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d'un rythme sinusal et une chrONIC patients de fibrillation auriculaire. Top: courant injecté membrane (I M) utilisée pour la stimulation (0,5 Hz). Ci-dessous: l'enregistrement simultané du potentiel de membrane (V M), et le chat déclenchée (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt et al. 2012) 15
Figure 4. Enregistrements représentatifs de l'(1 M) effet isoprénaline sur L-Type courant Ca 2 + déclenchée par Ca 2 + transitoires (CAT) dans un myocyte auriculaire d'un rythme sinusal et un patient atteint de fibrillation auriculaire chronique. Top: Voltage-clamp protocole (0,5 Hz). Ci-dessous: enregistrement simultané de membrane total net courant (I M), reflétant principalement de type L Ca 2 + Cat actuel (au milieu) et déclenché (en bas). (Retracé avec la permission de Voigt,et al. 2012) 15
Tableau I. Solutions.
Tableau II. Equipements spécifiques.
Le tableau III. Substances pour le chargement des myocytes avec Fluo-trois heures.
Tableau IV. solution pour bain de patch-clamp.
Pipette solution de tableau V. de patch-clamp *.
Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour l'isolement des myocytes auriculaires humains des appendices auriculaires droit obtenus à partir de patients subissant une chirurgie à cœur ouvert. Pour utiliser ces myocytes pour les mesures de Ca 2 + cytosolique nous avons adapté une méthode décrite précédemment 4-11 en omettant EGTA à partir de la solution de stockage.
Déjà en 1970, il a été observé que, bien que les myocytes se dissocient en présence de Ca 2 + au cours de la digestion, ils étaient tous dans contracture et non-viable. 16,17 conséquent, l'isolement cellulaire est réalisée en Ca 2 + sans solution. Cependant, la réintroduction des concentrations physiologiques de Ca 2 + a entraîné rapide influx de Ca2 + et la mort cellulaire. Cela a été décrit comme le 2 + phénomène de paradoxe Ca qui a été initialement observée dans les coeurs perfusés par Zimmerman et Hulsman. 18 Des modifications des milieux d'isolement, y compris la réduction du pH à 7,0, <sup> 19 plus de 20 taurin ou de petites quantités de Ca 2 + (voir l'étape 3.2 et 4.1), 21 ainsi que le stockage des myocytes isolés dans EGTA contenant stockage solution 22 ont été suggérées pour éviter le Ca 2 + paradoxe. 17 Cependant, il est bien connu que Ca 2 + tampon par EGTA réduit l'amplitude de type L Ca 2 + induite par le courant Ca 2 + amplitudes et les résultats dans une décroissance biphasique des transitoires de Ca2 transitoires. 23 Par conséquent, nous avons omis EGTA tout au long du processus d'isolement ensemble afin d'obtenir Ca 2 + transitoires avec des propriétés typiques et se désintègre monophasique. Afin de protéger les cellules du Ca 2 + paradoxe, nous avons augmenté la finale Ca 2 + concentration de la solution de stockage de manière progressive jusqu'à 0,2 mm.
Le choix de la collagénase est probablement l'étape la plus critique pour la réussite de l'isolement des myocytes. Coll conventionnelagenases sont des préparations brutes obtenues à partir de Clostridium histolyticum et contiennent collagénase en plus d'un certain nombre d'autres protéases, lipases et polysaccharidases. Sur la base de leurs collagénases générales de composition sont subdivisées en différents types. 24 Worthington collagénase de type I et II ont été utilisés avec succès pour l'isolation des myocytes auriculaires humains. 4-10,15,25-30 Dans notre protocole décrit ici nous recommandons l'utilisation de la collagénase Type I, mais nous avons également pu obtenir des quantités acceptables de cellules viables en utilisant la collagénase de type II. Cependant, même au sein d'un seul type de collagénase il ya une variation de lot à lot significatif sur les activités enzymatiques. Ces variations nécessitent la sélection des lots attention et les essais des différents lots afin d'optimiser la procédure d'isolement. L'outil disponible lots sélection en ligne de Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) peut être utilisé pour trouver des lots disponibles avec une composition qui a été montré pour être adapté à l'isolation des myocytes auriculaires humains. Actuellement, nous utilisons la collagénase de type I avec 250 activité U / mg de collagénase, l'activité 345 U / mg caséinase, activité 2,16 U / mg clostripaïne et 0,48 U / mg activité tryptique (lot # 49H11338).
Les cellules obtenues en utilisant la procédure décrite dans ce manuscrit peuvent être utilisés dans les 8 h pour les études de patch-clamp, 2 + mesures transitoires de CA et une combinaison des deux. 15 En outre, ces cellules permettent des mesures de contraction cellulaire en réponse à une stimulation de champ électrique ou la stimulation électrique à l'aide de la pipette de patch-clamp (observations non publiées).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp a soutenu cette publication en couvrant les coûts de production du fichier vidéo. Les bailleurs de fonds n'a eu aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Acknowledgments
En outre, nous remercions les chirurgiens cardiaques de l'Université de Heidelberg pour la fourniture de tissu auriculaire humain et Claudia Liebetrau, Katrin Kupser et Ramona Nagel pour leur excellent soutien technique. Un merci spécial aussi à Andy W. Trafford pour ses suggestions et ses conseils lors de la mise en place des mesures transitoires 2 + Ca utiles. Les auteurs tiennent à exprimer leur profonde gratitude aux membres du Département de pharmacologie et de toxicologie (tête: Ursula Ravens) de l'Université de technologie de Dresde pour l'occasion ils nous ont offert d'apprendre les techniques de base et des compétences en électrophysiologie cellulaire et l'isolement des cardiomyocytes.
Les recherches des auteurs est soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (Do769/1-1-3), le ministère fédéral allemand de l'éducation et de la recherche à travers le réseau de compétence de la fibrillation auriculaire (01Gi0204) et le Centre allemand de recherche cardiovasculaire, l'Union européenne par le biais l'EuRéseau péenne pour la recherche translationnelle sur la fibrillation auriculaire (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, le projet d'intégration à grande échelle, la proposition n ° 261057) et la fibrillation auriculaire Research Alliance Europe-Amérique du Nord (ENAFRA) subvention de la Fondation Leducq (07CVD03).
La vue d'ensemble schématique montré dans le fichier vidéo a été produite utilisant l'art médical Servier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
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