Summary
Descrevemos o isolamento de miócitos atriais humanos, que podem ser utilizados para a intracelular de Ca
Abstract
O estudo das propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular cardíaca Ca 2 + anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Além disso, a possibilidade de investigar miócitos de pacientes que utilizam estas técnicas é um requisito de valor inestimável para elucidar a base molecular das doenças cardíacas, tais como fibrilação atrial (FA). Uma Descrevemos aqui um método para o isolamento de miócitos atriais humanos, que são apropriados tanto estudos de patch-clamp e medições simultâneas de Ca 2 + concentrações intracelulares. Primeiro, apêndices atriais direita obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto são cortadas em pedaços pequenos de tecido ("método pedaço") e lavados em solução de Ca 2 +-free. Em seguida, os pedaços de tecido são digeridos em colagenase e protease contendo soluções com 20 mM de Ca 2 +. Posteriormente, os miócitos isolados são harvested por filtração e centrifugação da suspensão de tecido. Finalmente, a concentração de Ca2 + na solução de armazenamento de células é ajustada gradualmente para 0,2 mM. Brevemente discutidos o significado de Ca 2 + e Ca 2 + tamponamento durante o processo de isolamento e também proporcionar gravações representativos de potenciais de acção e as correntes de membrana, juntamente com a simultânea tanto de Ca 2 + medições transientes, realizada nesses miócitos isolados.
Introduction
Estudar propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular Ca 2 + anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Estes são geralmente obtidos após a exposição in vitro de amostras de tecidos cardíacos de enzimas digestivas (colagenase, hialuronidase, peptidase, etc.) Desde o primeiro relato de isolamento de miócitos cardíacos viáveis em 1955 2 uma grande quantidade de protocolos foi desenvolvido a fim de colher cardiomiócitos atriais e ventriculares individuais a partir de diferentes espécies, incluindo ratinho, rato, coelho, cão, cobaia e humano. Nesta revisão, vamos nos concentrar no isolamento de miócitos atriais humanos. Em relação aos procedimentos para o isolamento de miócitos de outras espécies que se referem ao "Worthington Tissue dissociação guia" fornecido pelo Worthington Biochemical Corp, EUA ( www.tissuedissociation.com ).
et ai. 3 Aqui nós fornecemos uma descrição passo a passo de uma técnica, que é adaptado de um método previamente publicado, a fim de obter miócitos atriais adequadas não só para os experimentos de patch-clamp, mas também para Ca 2 + intracelular medições simultâneas 4-11.
Protocol
Protocolos experimentais precisa ser aprovado pelo comitê de ética local e todos os pacientes precisam dar consentimento informado por escrito. Nossa pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Mannheim, da Universidade de Heidelberg (# 2011-216N-MA) e foi realizado em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todos os pacientes assinaram termo de consentimento.
0. A obtenção de tecido atrial humano
Durante os procedimentos de rotina de punção, em pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto de circulação extracorpórea, a ponta da aurícula direita é normalmente removida e pode ser usada para o isolamento dos cardiomiócitos atriais. Após a excisão da amostra de tecido é transferido imediatamente para um tubo Falcon de 50 ml estéril com Ca2 + livre transporte solução contendo 2,3-butanodiona monoxime (Tabela I; BDM, inibidor contráctil, impedindo miócitos contracture). Com o tempo de transporte entre 30 e 45 min, que não reconhecemos uma clara vantagem de arrefecimento ou oxigenação em relação ao número e qualidade dos cardiomiócitos atriais isoladas. Nos transportes em geral para o laboratório deve ser tão rápido quanto possível. No entanto, se for mais longo o tempo de transporte não pode ser evitada, o transporte, a 4 ° C em solução oxigenada pode ser vantajosa.
1. Prearrangements
- Ligue o thermocirculator, que controla a temperatura do recipiente encamisado (Tabela II). Certifique-se de que a temperatura dentro do recipiente é igual a 37 ° C. Cobrir a proveta com uma tampa de vidro para manter uma temperatura constante no interior da taça ao longo de todo o processo de isolamento.
- Pesa-se a colagenase I e protease XXIV em três copos de vidro e armazená-lo a temperatura ambiente. As enzimas serão diluídos imediatamente antes da utilização.
- Loja 20 ml de uma solução de Ca2 + livre numa placa de Petri, a 4 ° C.
- Loja 250 ml de Ca2 + livre em solução num banho de água a 37 ° C.
2. Limpeza do Tecido
- Transfira a amostra de tecido em conjunto com a solução de transporte numa placa de Petri (~ 10 cm de diâmetro) e remover o tecido adiposo aproximadamente usando uma tesoura.
- Pesa-se a amostra de tecido. Entre 200 e 600 mg são utilizados para isolamento de células. O tecido restante pode ser congelada em azoto líquido para posterior análise bioquímica.
- Transfira a amostra de tecido para a placa de Petri contendo 20 ml de uma solução de Ca2 + livre, a 4 ° C (ver passo 1.3) e cortar a amostra de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm 3 de tamanho.
- Os passos seguintes devem ser executadas a 37 ° C e sob gaseificação contínua com 100% de O 2. Uma ponta de pipeta pode ser colocado no tubo de oxigénio para evitar a forte ebulição e gerar um fluxo de ar contínuo.
- Transfira os pedaços de tecido juntamente com a solução de 2 Ca + livre emao béquer com camisa e agitou-se cuidadosamente durante cerca de 3 min, com uma barra de agitação magnética.
- Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para se acalmar por alguns segundos. Estirpe cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II). Retorne os pedaços de tecido contido da malha no copo usando uma pinça.
- Encher o copo com Ca 2 + solução gratuita e repita a etapa de lavagem 2.4 e 2.5, duas vezes.
3. Primeiro digestão enzimática
- Re-suspender os pedaços de tecidos com 20 ml de solução de enzima E1 (Quadro I) contendo colagenase e protease e agita-se cuidadosamente durante 10 min.
- Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução para obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +.
- Após 35 min coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) de uma maneira que a maioria dos pedaços de tecido permanecem no copo. Resto retornarchover pedaços de tecido a partir da malha para o copo.
4. Segundo digestão enzimática
- Ressuspender os pedaços de tecido de novo com 20 ml de solução de enzima E2 colagenase I contendo apenas (Tabela I). Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução imediatamente para se obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +.
- Durante o segundo tesoura para cortar o uso de digestão mais coágulos tecido ocasionalmente.
- Após 5 min tomar uma amostra, utilizando uma pipeta de Pasteur, para procurar a dissociação de células. Repita isso a cada 2-3 min até em forma de bastonete, cardiomiócitos estriados aparecer.
- Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para estabelecer-se para cerca de 20-30 segundos.
- Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) num tubo Falcon de 50 ml (um tubo). Retorne os pedaços de tecido contido da malha para o copo.
- Re-suspender os pedaços de tecido no copo com 20 ml storasolução ge (Tabela I) e após 10 dissociar as células por trituração mecânica suave usando uma pipeta de 20 ml serológica com doseador. Tente evitar a formação de bolhas, desde bolhas são prejudiciais para a sobrevivência e qualidade celular.
- Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 mM, Tabela II) em um Falcon 50 ml (tubo B).
5. Preparação final e Ajuste de Final Ca 2 + Concentração
- Centrifugar os tubos Falcon ambos A e B (ver passo 4.5 e 4.7) a 95 xg durante 10 min.
- Remove-se o sobrenadante de ambos os tubos cuidadosamente por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. Descartar o sobrenadante.
- Re-suspender em ambos os peletes de 1,5 ml de solução de armazenamento (Tabela I), cada uma (temperatura ambiente).
- Adicione duas vezes 7,5 mL de solução 10 mM CaCl 2 para cada Falcon e mexa com cuidado. Incubar durante 10 minutos depois de cada passo.
- Adicionar 15 ul de solução de CaCl2 10 mM para se obter uma última concentração de Ca2 + de 0,2 mM.
6. O carregamento dos miócitos com o fluorescente de Ca 2 + Fluo-indicador-3 AM (Figura 1)
- Transferir 1,5 ml de suspensão de células (tubo A e / ou o tubo B) para um tubo de microcentrifugação de 2 ml (tubo Eppendorf).
- Os seguintes passos devem ser executados tendo em consideração a sensibilidade à luz fluorescente do Ca 2 + Indicador de Fluo-3.
- Dissolve-se 50 mg do derivado do éster de acetoximetilo permeável membrana de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III), em 44 mL do Pluronic F-127 (Tabela III), solução de reserva (20% w / v em DMSO anidro) para obter de 1 mm de Fluo-03:00 solução de stock, o que pode ser armazenada a -20 ° C durante, no máximo, de 1 semana.
- Adicionam-se 15 ul do Fluo-03:00 solução estoque para o tubo de microcentrífuga contendo 1,5 ml de suspensão de células (ver passo 6.1) e agitecuidado.
- Incubar a suspensão de células durante 10 minutos numa caixa opticamente opaca.
- Resumidamente, centrifugar a cerca de 6.000 rpm.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de solução de banho (Tabela IV).
- Deixe a suspensão celular por cerca de 30 min para de-esterificação, antes de iniciar os experimentos.
7. Simultâneas de patch-clamp e epifluorescência Ca 2 + Medições
Desde que as medições de patch-clamp não são o principal tema desta revisão, referem-se ao leitor interessado em outras publicações fornecendo uma descrição mais aprofundada desta técnica. 11-14 Por uma questão de exaustividade nós fornecemos um breve resumo de um protocolo para medir potenciais de ação ou L-tipo Ca 2 + correntes, ambos com gravações simultâneas Ca 2 +-transitória.
Durante as experiências de miócitos são superfused a 37 ° C com banho de solução quena (Tabela IV), utilizando um sistema de perfusão rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para as experiências de tensão-grampo, as correntes de K + são bloqueados pela adição de 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl 2 (0,1 mmol / L) à solução de banho. Microeléctrodos de vidro de borosilicato e são utilizados devem ter resistências de ponta de 2-5 mohms quando cheio com a solução da pipeta (Tabela V). Além do Fluo-3 AM carregando dos miócitos (ver passo 6), Fluo-3 também está incluído na solução de pipeta (Tabela V). Fluorescência está animado a 488 nm e luz emitida (<520 nm) convertido em [Ca 2 +] i assumindo
d, em que k = constante de dissociação de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3,. Fmax = fluorescência de Ca2 +-saturada obtida no final de cada experiência de 12 Ambos os sinais eléctricos e Ca 2 + sinais epifluorescência são gravados simultaneamente. Os potenciais de ação são estimulados a 0,5 Hz no modo atual-clamp usando um ms pulsos de corrente de força limiar 1.2x. Tipo-L de Ca 2 +-correntes são medidas no modo de voltagem-grampo com um potencial de manutenção de -80 mV e 100 mseg de rampa de pulso para -40 mV para inactivar o jejum de Na +-corrente, seguido por uma de 100 mseg ensaio de pulso para 10 mV a 0,5 Hz.
Representative Results
Figura 2A mostra três exemplos representativos de miócitos atriais direitos humanos isolados. Para quantificar o rendimento das células que pipetar com 10 ul de suspensão de células (passo 5.5) numa lâmina de microscópio CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Colheitas de células em média, na Figura 2B indicam claramente que há uma tendência para os rendimentos mais baixos em células crónica AF (CAF) de amostras do doente (tubo A: 16,5 ± 3,1 células/10 ul (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 células/10 ul (n = 10), em SR e CAF, respectivamente, p <0,05; tubo B: 17,9 ± 3,9 células/10 mL (n = 29) versus 5,9 ± 2,0 células/10 mL (n = 9) em SR e CAF, respectivamente, p = 0,107).
Os exemplos representativos de acção potenciais medições simultâneas e gravações de Ca 2 + citosólico transientes são apresentados na Figura 3. Em cerca de 90% das células estudadas, tele acção potencial disparado Ca 2 + liberação provoca contrações de células claras e regular. Como relatado anteriormente, o potencial de repouso da membrana, que é um indicador aceite para a integridade das células, em média, cerca de -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 / miócitos pacientes) e -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 / miócitos pacientes ) em SR e CAF, respectivamente (p> 0,05). 15 A Figura 4 mostra registos representativos de simultâneas por voltagem tipo-L de Ca 2 + e de correntes de Ca 2 + citosólico transientes. Aplicação da isoprenalina agonista β-adrenérgico não selectivos (1 uM), aumenta as amplitudes de ambos I Ca, L e citosólica de Ca 2 + transientes, sugerindo cascata de transdução de sinal β-adrenérgico intacta.
Figura 1. Fluxograma dos miócitos Fluo-03:00 carregamento protocolo (veja o passo 6,1-6,5). m / v, massa / volume.
Figura 2. A, miócitos atriais direito humano isolado depois de uma hora em solução de armazenamento. B, média ± SEM de rendimento celular contados em 10 ul de células em solução de armazenamento (ver passo 5.5). n significa o número de preparações em cada grupo. * P <0,05.
Figura 3. Gravações representativas de ação e potencial acionado Ca 2 + transientes (CAT), em um dos miócitos atrial do ritmo sinusal e um chronic paciente fibrilação atrial. Top: Injetado atual membrana (I M), usado para a estimulação (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea do potencial de membrana (V M), e gato acionado (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt et al. 2.012) 15
Figura 4. Gravações representativos da (1 uM) no efeito isoprenalina tipo L de Ca 2 + desencadeada corrente Ca2 +-transientes (CAT), em um dos miócitos atrial de um ritmo sinusal e um doente de fibrilação atrial crónica. Top: Voltage-clamp protocolo (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea de membrana líquida total de corrente (I M), reflectindo predominantemente do tipo L Ca 2 + atual (meio) e provocou Gato (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt,et ai. de 2012) 15
Tabela I. Solutions.
Tabela II. Equipamento específico.
Tabela III. Substâncias para o carregamento de miócitos com Fluo-3 AM.
Tabela IV. Solução do banho de patch-clamp.
Tabela solução Pipeta V. de patch-clamp *.
Discussion
Aqui, nós descrevemos um método para o isolamento de miócitos atriais humanos de apêndices atriais direito obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto. De forma a utilizar estas miócitos para medições de Ca 2 + citosólico que adaptado com um método previamente descrito 4-11 omitindo EGTA a partir da solução de armazenamento.
Já em 1970, verificou-se que, embora os miócitos dissociar na presença de Ca2 + durante a digestão, todos eles foram em contractura e não viáveis. 16,17 Assim, o isolamento de células é realizada em solução de Ca2 + livre. Contudo, a re-introdução de concentrações fisiológicas de Ca 2 + resultou numa rápida influxo de Ca2 + e na morte celular. Isto foi descrito como o 2 + Ca paradoxo fenómeno que foi inicialmente observada em corações perfundidos por Zimmerman e Hulsman. 18 modificações dos meios de isolamento, incluindo a redução do pH para 7,0, <sup> 19 20 adição de taurina ou de pequenas quantidades de Ca 2 + (veja passo 3.2 e 4.1), 21, bem como o armazenamento de miócitos isolados em EGTA, contendo solução de armazenagem-22, têm sido sugeridos para impedir o paradoxo de Ca 2 + 17. No entanto, é bem conhecido que o Ca 2 + tamponamento através EGTA reduz a amplitude de tipo-L de Ca 2 + corrente induzida por Ca 2 + amplitudes transientes e resulta numa deterioração bifásica dos transientes de Ca 2 + 23. Portanto, é omitida EGTA ao longo de todo o processo de isolamento, a fim de obter os transientes de Ca 2 + com propriedades típicas e decai monofásicas. Para proteger as células do Ca 2 + paradoxo que aumentou a última concentração de Ca2 + da solução de armazenamento de uma forma gradual até 0,2 mM.
A escolha da colagenase é provavelmente o passo mais crítico para o sucesso do isolamento dos miócitos. Coll convencionalagenases são preparações brutas obtidas a partir de Clostridium histolyticum e contêm colagenase, além de uma série de outras proteases, polissacaridases e lipases. Com base nas suas colagenases composição geral são subdivididas em tipos diferentes. Worthington 24 Tipos colagenase I e II têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miócitos atriais humanos 4-10,15,25-30. Em nosso protocolo atualmente descrito recomendamos o uso de colagenase O tipo I, apesar de, também foram capazes de obter quantidades aceitáveis de células viáveis utilizando colagenase de Tipo II. No entanto, mesmo dentro de um único tipo de colagenase há uma variação significativa de lote para lote em relação às actividades enzimáticas. Estas variações exigir a selecção cuidadosa e lote de teste de vários lotes para optimizar procedimento de isolamento. A ferramenta disponível batch-seleção on-line a partir de Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) pode ser usada para encontrar os lotes disponíveis com uma composição que tem sido mostrado para ser adequado para o isolamento de miócitos atriais humanos. Atualmente nós usamos colagenase tipo I com 250 U / mg atividade da colagenase, 345 U / mg atividade caseinase, 2,16 U / mg atividade clostripaína e 0,48 U / mg atividade tríptica (lote # 49H11338).
As células obtidas utilizando o processo descrito neste manuscrito podem ser utilizadas dentro de 8 horas para os estudos de patch-clamp, Ca 2 + medições transientes e uma combinação de ambos. 15 Além disso, estas células permitem a medição de contracção celular, em resposta à estimulação do campo eléctrico ou estimulação elétrica usando a pipeta de patch-clamp (observações não publicadas).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp apoiaram esta publicação, cobrindo os custos de produção do arquivo de vídeo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Acknowledgments
Além disso, agradecemos aos cirurgiões cardíacos da Universidade de Heidelberg para a prestação de tecido atrial humano e Claudia Liebetrau, Katrin Kupser e Ramona Nagel por sua excelente suporte técnico. Um agradecimento especial também para Andy W. Trafford para suas sugestões e conselhos durante o estabelecimento dos Ca 2 + medidas transitórias. Os autores desejam expressar sua profunda gratidão aos membros do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (cabeça: Ursula Ravens), da Universidade de Tecnologia de Dresden pela oportunidade que nos ofereceram para aprender técnicas e habilidades básicas em eletrofisiologia celular e isolamento dos cardiomiócitos.
Pesquisa dos autores é apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Do769/1-1-3), o Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, através da Rede de Competência Fibrilação Atrial (01Gi0204) e do Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, a União Europeia através de o EuRede ropeia para Pesquisa Translacional em Fibrilação Atrial (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, o projeto de integração em larga escala, Proposta n º 261057) ea Aliança de Investigação Europeia-América do Norte fibrilação atrial (ENAFRA) concessão de Fondation Leducq (07CVD03).
A visão geral do esquema mostrado no arquivo de vídeo foi produzido usando Servier arte médica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
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