Summary
Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann
Abstract
Das Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung von Herz-zellulären Ca 2 + Umgang mit Anomalien erfordert isolierten Herzmuskelzellen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Myozyten von Patienten mit diesen Techniken zu untersuchen eine wertvolle Voraussetzung, um die molekulare Basis von Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern (AF) aufzuklären. 1 Hier ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten, die für beide beschreiben Patch-Clamp-Technik und gleichzeitige Messungen der intrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen. Zuerst werden das rechte atriale Anhängsel von Patienten Operation am offenen Herzen erhalten in kleine Stücke Gewebe ("Chunk-Methode") zerkleinert und gewaschen in Ca 2 +-freien Lösung. Dann werden die Gewebe Brocken werden in Kollagenase und Protease verdaut haltigen Lösungen mit 20 uM Ca 2 +. Danach werden die isolierten Myozyten harvested durch Filtration und Zentrifugation des Gewebes Suspension. Schließlich wird der Ca 2 +-Konzentration in der Zelle Aufbewahrungslösung angepasst schrittweise bis 0,2 mm. Diskutieren wir kurz die Bedeutung Ca 2 + und Ca 2 + Pufferung bei der Isolierung Verfahren und auch Vertreter Aufnahmen von Aktionspotentialen und Membranströme sowohl bei gleichzeitiger Ca 2 + Transienten Messungen in diesen isolierten Myozyten durchgeführt.
Introduction
Studieren elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung der zellulären Ca 2 + Handhabung Anomalien erfordern isolierten Herzmuskelzellen. Diese werden in der Regel im Anschluss an die in vitro Exposition von Herzgewebe Proben Verdauungsenzyme (Kollagenase, Hyaluronidase, Peptidase usw.) erhalten. Seit dem ersten Bericht der Isolation von lebensfähigen Herzmuskelzellen 1955 2 eine große Menge von Protokollen entwickelt worden, um einzelnen atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus verschiedenen Arten, darunter Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Meerschweinchen und Menschen ernten. In diesem Beitrag werden wir auf Isolierung von humanen Vorhofmyozyten konzentrieren. In Bezug auf Verfahren zur Isolierung von Myozyten aus anderen Spezies verweisen wir auf die "Worthington Gewebedissoziation guide" von Worthington Biochemical Corp, USA (vorausgesetzt www.tissuedissociation.com ).
et al. 3 beschrieben Hier haben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung einer Technik, die von einer zuvor veröffentlichten Verfahren geeignet ist, bereitzustellen, um abgeleitet erhalten Vorhofmyozyten eignet sich nicht nur für die Patch-Clamp-Experimente als auch für die gleichzeitige intrazellulären Ca 2 +-Messungen. 4-11
Protocol
Experimentelle Protokolle müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und alle Patienten müssen eine schriftliche Einverständniserklärung geben. Unsere Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (# 2011-216N-MA) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung.
0. Gewinnung von menschlichem Vorhofgewebe
Im Routinebetrieb Kanülierung Verfahren bei Patienten mit Operationen am offenen Herzen für Herz-Lungen-Bypass-Operation, wird die Spitze des rechten Herzohr Regel entfernt und zur Isolierung von atrialen Kardiomyozyten verwendet werden. Nach Exzision der Gewebeprobe wird sofort in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit sterilem Ca 2 +-freien übertragen Transportlösung mit 2,3-butanedione Monoxim (Tabelle I; BDM, kontraktilen Inhibitor, verhindert myocyte contracture). Mit Transportzeiten zwischen 30 und 45 min, haben wir nicht erkennen, einen klaren Vorteil von Kühl-oder Sauerstoffversorgung sowohl in Bezug auf Anzahl und Qualität der isolierten atrialen Kardiomyozyten. Im allgemeinen Transport zum Labor sollte so schnell wie möglich. Allerdings, wenn längere Transportzeit nicht vermieden werden kann, Transport bei 4 ° C in sauerstoffhaltigen Lösung könnte von Vorteil sein.
1. Prearrangements
- Schalten Sie den Thermostatenkreislauf, der die Temperatur der ummantelten Becherglas (Tabelle II) steuert. Achten Sie darauf, die Temperatur innerhalb des Bechers beträgt 37 ° C. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel, um eine konstante Temperatur im Becherglas während der gesamten Trennung aufrechtzuerhalten.
- Wiegen Sie die Collagenase I und Protease XXIV in drei Bechergläser und speichern Sie es bei Raumtemperatur. Die Enzyme werden unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden.
- Shop 20 ml Ca 2 + freier Lösung in einer Petrischale bei 4 ° C.
- Shop 250 ml von Ca 2 + freier Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C
2. Reinigung des Tissue
- Übertragen Sie die Gewebeprobe zusammen mit dem Transport-Lösung in eine Petrischale (~ 10 cm Durchmesser) und entfernen Fettgewebe grob mit einer Schere.
- Wiegen Sie die Gewebeprobe. Zwischen 200 und 600 mg sind für die Zell-Isolierung verwendet. Der verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff für eine spätere biochemische Analyse eingefroren.
- Übertragen Sie die Gewebeprobe in die Petrischale mit 20 ml Ca 2 + kostenlose Lösung bei 4 ° C (siehe Schritt 1.3) und hacken die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 in der Größe.
- Die folgenden Schritte sollten bei 37 ° C und unter ständiger Begasung mit 100% O 2 ausgeführt werden. Eine Pipettenspitze auf die Sauerstoff-Schlauch gelegt werden, um starke Blasenbildung zu vermeiden und kontinuierliche Luftstrom erzeugen.
- Übertragen Sie die Gewebe Stücke zusammen mit dem Ca 2 +-freie Lösung inder ummantelten Becherglas und rühren Sie vorsichtig für etwa 3 min mit einem magnetischen Rührstab.
- Stoppen Rühren und lassen Sie die Stücke Gewebe niederlassen für ein paar Sekunden. Vorsichtig belasten den Überstand durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas mit einer Pinzette.
- Refill das Becherglas mit Ca 2 + kostenlose Lösung und wiederholen Sie den Waschschritt 2.4 und 2.5 zwei mal.
3. Erste enzymatische Verdauung
- Re-suspend die Gewebe Brocken mit 20 ml Enzymlösung E1 (Tabelle I), die Kollagenase und Protease und vorsichtig umrühren für 10 min.
- In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 &mgr; M Ca 2 + erhalten.
- Nach 35 min Belastung der Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz (200 um, Tabelle II) in einer Weise, dass die meisten der Stücke Gewebe im Becherglas verbleiben. Zurück Restregnete Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas.
4. Second enzymatische Verdauung
- Resuspendieren der Gewebe Brocken wieder mit 20 ml Enzymlösung E2 mit Kollagenase ich nur (Tabelle I). In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung sofort, um eine Endkonzentration von 20 &mgr; M Ca 2 + erhalten.
- Während der zweiten Verdauung Verwendung Schere weiter zu hacken Gewebe Blutgerinnsel gelegentlich.
- Nach 5 min eine Probe mit einer Pasteurpipette auf die Dissoziation von Zellen zu überprüfen. Wiederholen Sie diese alle 2-3 min bis stabförmigen, gestreift Kardiomyozyten erscheinen.
- Stoppen Rühren und damit die Gewebe Brocken, um sich niederzulassen für ca. 20-30 sek.
- Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube A). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas.
- Re-suspend die Gewebe Brocken im Becherglas mit 20 ml storage Lösung (Tabelle I) und 10 weitere distanzieren die Zellen durch vorsichtiges mechanisches Verreiben mit 20 ml serologische Pipette mit Spender. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nachteilig auf das Überleben der Zelle und Qualität sind.
- Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube B).
5. Abschließende Vorbereitung und Einstellung von Final Ca 2 +-Konzentration
- Zentrifuge sowohl Falcon-Röhrchen A und B (siehe Schritt 4.5 und 4.7) bei 95 g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand von beiden Rohre sorgfältig durch Aspiration. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Überstand verwerfen.
- Re-suspend sowohl Pellets in 1,5 ml-Storage-Lösung (Tabelle I) jede (Raumtemperatur).
- Fügen Sie zwei mal 7,5 ul 10 mM CaCl 2-Lösung in jedes Falcon und vorsichtig umrühren. Inkubieren für 10 min nach jedem Schritt.
- In 15 ul 10 mM CaCl 2-Lösung, um eine endgültige Ca 2 +-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten.
6. Laden von Myozyten mit dem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 AM (Abbildung 1)
- Übertragen 1,5 ml Zellsuspension (Röhrchen A und / oder das Rohr B) in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen).
- Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 ausgeführt.
- Lösen Sie 50 ug der Membran durchlässig Acetoxymethylester Derivat Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabelle III) in 44 ul der Pluronic F-127 (Tabelle III) stock Lösung (20% w / v in wasserfreiem DMSO) zu erhalten eine 1 mM Fluo-03.00 Lager-Lösung, die bei -20 ° C für höchstens 1 Woche gelagert werden können.
- In 15 ul der Fluo-03.00 Stammlösung der Mikrozentrifugenröhrchens mit 1,5 ml Zellsuspension (siehe Schritt 6.1) und agitierensorgfältig.
- Inkubation der Zellsuspension für 10 min in einem optisch undurchsichtige Box.
- Kurz bei etwa 6.000 rpm zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml Badlösung (Tabelle IV).
- Verlassen Sie die Zellsuspension für etwa 30 min für Entesterung vor Beginn mit Experimenten.
7. Gleichzeitige Patch-Clamp-und Epifluoreszenz Ca 2 + Messungen
Seit dem Patch-Clamp-Messungen sind nicht das große Thema dieser Bewertung verweisen wir den interessierten Leser auf andere Publikationen Bereitstellung eines genauere Beschreibung dieser Technik. 11-14 Aus Gründen der Vollständigkeit stellen wir eine kurze Zusammenfassung eines Protokolls zu messen Aktionspotentiale oder L-Typ-Ca 2 +-Ströme, die beide bei gleichzeitiger Ca 2 +-Transienten-Aufnahmen.
Bei Versuchen Myozyten werden bei 37 ° C mit Bad Lö superfundiertauf (Tabelle IV) mit einem schnellen Perfusion System (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Für Voltage-Clamp-Experimente, K +-Ströme durch Zugabe von 4-Aminopyridin (5 mmol / l) und BaCl 2 (0,1 mmol / L) der Badlösung blockiert. Borosilikatglas Mikroelektroden verwendet werden und sollte kippen Widerstände von 2-5 MOhm haben, wenn sie mit Pipette Lösung (Tabelle V) gefüllt. Neben der Fluo-3 AM des Myozyten Laden (siehe Schritt 6) wird Fluo-3 auch in der Pipette Lösung (Tabelle V) enthalten. Fluoreszenz wird bei 488 nm angeregt und emittiert Licht (<520 nm) auf [Ca 2 +] i vorausgesetzt umgewandelt
wo k d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz;. F max = Ca 2 +-gesättigten Fluoreszenz am Ende jedes Experiments 12 erhaltenen beiden elektrischen Signalen und epifluoreszenten Ca 2 +-Signale werden gleichzeitig erfasst. Aktionspotentiale werden in 0,5 Hz in Current-Clamp-Modus mit 1 ms Stromimpulse 1.2x Schwelle Stärke stimuliert. L-Typ-Ca 2 +-Ströme werden in Voltage-Clamp-Modus mit einem Haltepotential von -80 mV und eine 100-ms-Impulses Rampe bis -40 mV, die schnellen Na +-Strom, gefolgt von einer 100-ms gemessen inaktivieren Test-Impuls auf +10 mV bei 0,5 Hz liegt.
Representative Results
2A zeigt drei repräsentative Beispiele aus isolierten Menschenrecht Vorhofmyozyten. Um die Zellausbeute wir Pipette 10 ul Zellsuspension (Schritt 5.5) auf einem Objektträger CellFinder (quantifizieren http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Gemittelte Zellausbeuten in 2B zeigen deutlich, dass es eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei chronischen AF (CAF) Patientenproben (Röhre A: 16,5 ± 3,1 Zellen/10 ul (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 Zellen/10 ul (n = 10) in SR und CAF, p <0,05; Rohr B: 17,9 ± 3,9 Zellen/10 ul (n = 29) im Vergleich zu 5,9 ± 2,0 Zellen/10 ul (n = 9) in SR und CAF, , p = 0,107).
Repräsentative Beispiele für Action-Potential-Messungen und gleichzeitige Aufnahmen von zytosolischen Ca 2 + Transienten in Abbildung 3 dargestellt. In etwa 90% der untersuchten Zellen, ter Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Freisetzung verursacht klare und regelmäßige Kontraktionen Zelle. Wie bereits berichtet, lag die Ruhemembranpotenzial, die ein akzeptierter Indikator für die Integrität der Zelle ist, etwa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 Myozyten / Patienten) und -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 Myozyten / Patienten ) in SR und CAF (p> 0,05). 15 Abbildung 4 zeigt repräsentative gleichzeitige Aufnahmen von spannungsabhängigen L-Typ-Ca 2 +-Ströme und cytosolischen Ca 2 +-Transienten. Verwendung des nicht-selektiven β-Adrenozeptor-Agonisten Isoprenalin (1 uM) erhöht Amplituden der beiden I Ca, L und zytosolischen Ca 2 + Transienten, was intakte β-adrenergen Signaltransduktion.
Fild 1. Flussdiagramm der Myozyten Fluo-03.00 Be-Protokoll (siehe Schritt 6.1-6.5). m / v, Masse / Volumen.
Abbildung 2. A, Isoliert Menschenrecht Vorhofmyozyten nach einer Stunde in Storage-Lösung. B, Mittelwert ± SEM der Zelle Ausbeute in 10 ul Zellen in Storage-Lösung gezählt (siehe Schritt 5.5). n bezeichnet die Anzahl der Vorbereitung innerhalb jeder Gruppe. * P <0,05.
Abbildung 3. Repräsentative Aufnahmen von Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und chronic Vorhofflimmern Patienten. Top: Injected Membran Strom (I M) zur Stimulation (0,5 Hz) verwendet. Unten: Gleichzeitige Aufnahme von Membran-Potential (V M), und löste Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt et al. 2012) 15
Abbildung 4. Repräsentative Aufnahmen der Isoprenalin (1 uM) Wirkung auf L-Typ-Ca 2 +-Strom ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und einer chronischen Vorhofflimmern Patienten. Top: Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). Unten: Gleichzeitige Aufnahme des Netto-Membran (I M), überwiegend aufgrund einer L-Typ-Ca 2 +-Strom (Mitte) und ausgelöst Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt,et al. 2012) 15
Tabelle I. Lösungen.
Tabelle II. Ausstattung.
Tabelle III. Stoffe für das Laden von Myozyten mit Fluo-3 Uhr.
Tabelle IV. Bath Lösung für Patch-Clamp.
Tabelle V. Pipette Lösung für Patch-Clamp *.
Discussion
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten von rechts Herzohren von Patienten mit Operationen am offenen Herzen erhalten. Um diese Myozyten für Messungen von zytosolischen Ca 2 + verwenden wir angepasst ein zuvor beschriebenes Verfahren 4-11 durch Weglassen EGTA aus der Aufbewahrungslösung.
Bereits im Jahr 1970 wurde beobachtet, dass, obwohl Myozyten in Gegenwart von Ca 2 + während der Verdauung zerfallen, alle von ihnen in Kontraktur und nicht lebensfähig. 16,17 Daher waren, wird Zellisolation in Ca 2 +-freie Lösung durchgeführt. Allerdings ist die Wiedereinführung von physiologischen Konzentrationen von Ca 2 + in Folge rasch Ca 2 +-Einstrom und Zelltod. Dies wurde als die Ca 2 + Paradox Phänomen, das ursprünglich in perfundierten Herzen von Zimmerman und Hulsman beobachtet wurde beschrieben worden. 18 Änderungen der Isolation Medien einschließlich der Verringerung des pH-Wertes auf 7,0, <sup> 19 Zusatz von Taurin 20 oder kleiner Mengen von Ca 2 + (siehe Schritt 3.2 und 4.1), 21 sowie die Lagerung von isolierten Myozyten in EGTA enthält storage-Lösung 22 vorgeschlagen worden, um die Ca 2 + Paradox. 17 zu verhindern Es ist jedoch bekannt, daß Ca 2 + Pufferung durch EGTA verringert die Amplitude des L-Typ-Ca 2 +-induzierte Ca 2 + Transienten Amplituden und die Ergebnisse in einem zweiphasigen Zerfall der Ca 2 + Transienten ist. 23 Daher verzichtet man EGTA während des gesamten Prozesses in Isolation, um Ca 2 +-Transienten mit typischen Eigenschaften und monophasischen zerfällt zu erhalten. Um die Zellen von der Ca 2 + schützen Paradoxon erhöhten wir die endgültige Ca 2 +-Konzentration der Aufbewahrungslösung schrittweise bis 0,2 mM.
Die Wahl von Kollagenase ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche myocyte Isolation. Konventionelle collagenases sind Rohpräparaten von Clostridium histolyticum erhalten und enthält Kollagenase zusätzlich zu einer Reihe von anderen Proteinasen Polysaccharidasen und Lipasen. Auf der Grundlage ihrer allgemeinen Zusammensetzung Kollagenasen sind in verschiedene Typen unterteilt. Worthington 24 Kollagenase Typ I und II wurden erfolgreich für die Isolierung von menschlichen Vorhofmyozyten. 4-10,15,25-30 In unserem vorliegend beschriebenen Protokoll verwendet, empfehlen wir die Verwendung von Kollagenase Typ I, obwohl wir waren auch in der Lage, akzeptable Mengen an lebenden Zellen mittels Collagenase Typ II zu erhalten. Selbst innerhalb eines einzelnen Collagenase Typ gibt es einen signifikanten Charge zu Charge Schwankungen in Bezug auf die Enzymaktivitäten. Diese Variationen erfordern eine sorgfältige Batch Auswahl und Prüfung der verschiedenen Chargen zu Isolation Verfahren zu optimieren. Die Online verfügbar Batch-Werkzeug aus Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) kann verwendet werden, um verfügbaren Chargen mit einer Zusammensetzung, die gezeigt hat, dass für die Isolierung der menschlichen Vorhofmyozyten finden werden. Derzeit verwenden wir Kollagenase Typ I mit 250 U / mg Kollagenase-Aktivität, 345 U / mg Caseinase Aktivität, 2,16 U / mg Clostripainaktivität und 0,48 U / mg Trypsin-Aktivität (lot # 49H11338).
Die erhaltenen Zellen unter Verwendung des in diesem Manuskript beschrieben innerhalb von 8 Stunden kann für Patch-Clamp-Technik, Ca 2 + Transienten Messungen und einer Kombination von beiden. 15 zusätzlich verwendet werden, können diese Zellen Messungen der zellulären Kontraktion als Reaktion auf ein elektrisches Feld Stimulation oder elektrische Stimulation mit der Patch-Clamp-Pipette (unveröffentlichte Beobachtungen).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp unterstützte diese Veröffentlichung durch Abdecken Herstellungskosten Videodatei. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder Vorbereitung des Manuskripts.
Acknowledgments
Darüber hinaus danken wir den Herzchirurgen an der Universität Heidelberg für die Bereitstellung von menschlichen Vorhofgewebe und Claudia Liebetrau, Katrin Kupser und Ramona Nagel für ihre ausgezeichneten technischen Support. Besonderer Dank gilt auch Andy W. Trafford für seine Anregungen und Ratschläge während der Errichtung der Ca 2 + transiente Messungen. Die Autoren wollen ihre tiefste Dankbarkeit an die Mitglieder der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie (Leitung: Ursula Ravens) Ausdruck der TU Dresden für die Gelegenheit boten sie uns in die grundlegenden Techniken und Fertigkeiten in zelluläre Elektrophysiologie und cardiomyocyte Isolierung zu lernen.
Die Autoren Forschung wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Do769/1-1-3), das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Kompetenznetzes Vorhofflimmern (01Gi0204) und das Deutsche Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, der Europäischen Union unterstützt durch die Euischen Netzwerk für Translationale Forschung bei Vorhofflimmern (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, groß angelegte Projekt Integration, Vorschlag Nr. 261057) und der europäisch-nordamerikanischen Vorhofflimmern Research Alliance (ENAFRA) Erteilung Fondation Leducq (07CVD03).
Die schematische Übersicht in der Videodatei gezeigt wurde mit Hilfe von Servier ärztlichen Kunst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
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