Summary
Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu anlatır
Abstract
Yama klemp tekniği ve kalp hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin çalışma + taşıma anomaliler izole kardiyomiyositlerin gerektirir. Buna ek olarak, bu yöntemler kullanılarak hastaların miyositleri araştırmak için olasılık, bu tür atriyal fibrilasyon (AF) ve kalp hastalıklarının moleküler temeli aydınlatmak için çok değerli bir gerekliliktir. 1 Burada her iki için uygun olan insan atrial miyositlerinde bölgesinin izolasyonu için bir yöntem tarif Patch-clamp çalışmaları ve hücre içi Ca2 + konsantrasyonu aynı anda ölçümleri. İlk olarak, açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları küçük doku parçaları ("yığın yöntemi") içine doğranmış ve +-ücretsiz bir çözüm Ca 2 yıkanır. Daha sonra doku parçaları 20 mcM Ca 2 + ile çözümler içeren kollajenaz ve proteaz sindirilir. Bundan sonra, izole edilmiş olan miyosit Harvedoku süspansiyonu filtrasyon ve santrifüj ile sted. Son olarak, hücre depolama çözelti içinde Ca2 + konsantrasyonu 0.2 mM kademeli bir şekilde ayarlanır. Biz kısaca + ve Ca 2 + izolasyon işlemi sırasında tampon ve aksiyon potansiyelleri ve membran akımlarının temsilcisi kayıtları sağlamak, her ikisi birlikte aynı anda Ca 2 + geçici ölçümler, bu izole miyositler yapılan ile Ca 2 anlamını tartışmak.
Introduction
Yama klemp tekniği ve + taşıma anormallikleri izole kardiyomiyositlerin gerektiren hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özellikleri incelenmesi. Bunlar genellikle sindirim enzimleri kardiyak doku örneklerinin in vitro maruz kalma (kolajenaz, hiyaluronidaz, peptidaz vb) ardından elde edilir. 1.955 2'de canlı kalp miyositlerin izolasyonu ilk rapordan bu yana protokoller büyük miktarda fare, sıçan, tavşan, köpek, kobay ve insan dahil olmak üzere farklı türlerden tek atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde hasat için geliştirilmiştir. Bu derlemede insan atriyal miyositlerin izolasyonu odaklanın. Biz Worthington Biyokimyasal Corp, ABD (tarafından sağlanan "Worthington Doku Ayrılma kılavuzu" bölümüne bakın diğer türlerden miyositlerin izolasyonu için prosedürleri ile ilgili www.tissuedissociation.com ).
ve diğ. 3 açıklanan yöntem kullanılarak elde edilmiştir Patch-clamp deneyler için değil, aynı zamanda eş zamanlı olarak hücre içi Ca2 + ölçümü için sadece uygun atrial miyositlerinde elde edilir. 4-11
Protocol
Deneysel protokolleri, yerel etik kurul tarafından onaylanmış ve tüm hastalarda yazılı onay vermek gerekir gerekir. Araştırma Tıp Fakültesi Mannheim etik kurul, Heidelberg Üniversitesi (# 2011-216N-MA) tarafından onaylandı ve insan refahı için tüm, kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallar uygun olarak yapıldı. Tüm hastalar yazılı onam verdi.
0. İnsan Atriyal Doku Alınması
Aşılama kardiyopulmoner bypass için açık kalp ameliyatı geçiren hastalarda rutin kanülasyon prosedürleri sırasında, sağ atriyal apendiks ucunda genellikle kaldırılır ve atriyal kardiyomiyositlerinin izolasyonu için kullanılabilir. BDM, kasılma önleyici, miyosit c önlenmesi; eksizyon sonrası doku örneği 2,3-bütandion monoxime (Tablo I içeren +-ücretsiz ulaşım çözümü steril Ca 2 ile 50 ml Falcon tüp içine hemen aktarılır) ontracture. 30 ve 45 dakika arasında ulaşım zaman ile, izole atriyal kardiyomiyositlerinin sayısı ve kalitesini göre soğutma veya oksijenasyon bir avantaj tanımadı. Laboratuara genel ulaşım mümkün olduğunca hızlı olmalıdır. Daha uzun süre taşıma süresi önlenemez Ancak, 4 de ulaşım ° C oksijenli çözüm avantajlı olabilir.
1. Prearrangements
- Ceketli beher (Tablo II) sıcaklık kontrol thermocirculator, açın. Kabı içindeki sıcaklık 37 ° C ye eşit olduğundan emin olun Tüm süreç boyunca izolasyon beher içinde sabit bir sıcaklığı korumak için bir cam kapak ile kabı kapsamaktadır.
- Üç cam bardak içine kollajenaz I ve Proteaz XXIV tartılır ve oda sıcaklığında saklayın. Enzimler, kullanımdan hemen önce seyreltildi edilecektir.
- Ca 2 Mağaza 20 ml 4 bir Petri kabındaki + ücretsiz bir çözüm ° C
- Ca 2 deposu 250 ml 37 ° C'de su banyosunda + serbest çözeltisi ° C
2. Doku temizliği
- Bir Petri kabı (~ 10 cm çapında) içine taşıma çözümü ile birlikte doku örneği aktarın ve yaklaşık makas kullanılarak yağ doku kaldırmak.
- Doku örneği tartılır. 200 ila 600 mg hücre izolasyonu için kullanılır. Kalan doku daha sonra biyokimyasal analiz için likit nitrojende dondurulmuş olabilir.
- 20 ml Ca 2 içeren Petri kabı içine doku örneği aktarmak 4 de + ücretsiz bir çözüm ° C (adım 1.3) ve boyutu yaklaşık 1 mm 3 küçük parçalar halinde doku örneği doğrayın.
- Aşağıdaki adımlar% 100 O 2 ile 37 ° C de ve sürekli gazlama altında yürütülmelidir. Bir pipet güçlü köpüren önlemek ve sürekli hava akışı oluşturmak için oksijen tüpü üzerine yerleştirilebilir.
- Içinde Ca2 + içermeyen bir çözüm ile birlikte doku parçaları transferceketli beher ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile yaklaşık 3 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın.
- Karıştırma durdurmak ve doku parçaları birkaç saniye yerleşmek için izin verir. Bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) ile süpernatant dikkatlice süzün. Forseps kullanarak beher içine örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün.
- Ca 2 ile doldurun beher + serbest çözeltisi ile yıkama aşaması 2.4 ve 2.5 'da iki kez tekrarlayın.
3. İlk Enzimatik Sindirim
- Kolajenaz ve proteaz ihtiva eden 20 ml enzim çözeltisi E1 (Tablo I) ile doku parçaları yeniden askıya ve 10 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın.
- 20 uM Ca2 + bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM CaCl2-çözeltisinin 40 ul ekle.
- 35 dakika doku parçaları çoğu beher kalır bir şekilde bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün sonra. Dinlenme dönörgü gelen behere doku parçaları yağmur yağdı.
4. İkinci Enzimatik Sindirim
- Sadece 20 mL enzim çözeltisi içeren E2 kolajenaz (Tablo I) ile tekrar doku parçaları yeniden süspanse edin. Hemen 20 uM Ca2 bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM CaCl2-çözeltisi 40 ul +.
- İkinci sindirim kullanımı makas sırasında daha fazla bazen doku pıhtıları kesmek için.
- 5 dakika sonra hücrelerin ayrışma kontrol etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak bir örnek almak. Çubuk şeklinde, çizgili kardiyomiyositler görünene kadar bu 2-3 dk her tekrarlayın.
- Karıştırma durdurmak ve doku parçaları yaklaşık 20-30 saniye yerleşmek için izin verir.
- 50 ml'lik bir Falcon tüp (tüp A) içine, naylon elekten (200 mm, Tablo II) ile dikkatli bir şekilde yüzer süzün. Behere örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün.
- 20 ml Stora ile beher doku parçaları yeniden askıyaGE çözeltisi (Tablo I) 'in 10 ve daha fazla dağıtıcı içeren bir 20 mL serolojik bir pipet kullanarak yumuşak mekanik öğütülerek hücreleri ayırmak. Kabarcıklar hücre sağkalım ve kalite için zararlı olduğu için kabarcık oluşumunu önlemek için deneyin.
- 50 ml Falcon Tüp (Tüp B) bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün.
5. Final Ca 2 Son Hazırlık ve Ayar + Konsantrasyon
- 10 dakika 95 xg'de Falcon tüpler A ve B (adım 4.5 ve 4.7) hem de santrifüj.
- Aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde her iki tüpleri süpernatantı. Pelet rahatsız etmemek için emin olun. Süpernatantı atın.
- 1.5 ml saklama solüsyonu (Tablo I) 'in her biri (oda sıcaklığı) her iki pelet yeniden askıya.
- İki kez her Falcon için 10 mM CaCl2 çözüm 7.5 ul ekleyin ve dikkatli bir şekilde karıştırın. Her adım, sonra 10 dakika süreyle inkübe edin.
- 0.2 mM nihai bir Ca2 + konsantrasyonu elde etmek için 10 mM CaCl2 çözeltisi 15 ul ekle.
6. Floresan Ca 2 +-göstergesi Fluo-3 AM (Şekil 1) ile miyositlerin yükleme
- 2 ml mikrosantrifüj tüpü (Eppendorf tüp) içine hücre süspansiyonu, 1.5 ml (tüp A ve / ya da tüp B) aktarın.
- Aşağıdaki adımlar floresan Ca 2 + Gösterge Fluo-3 ışık hassasiyeti dikkate alınarak yürütülmelidir.
- Pluronik F-127 (Tablo III) stok çözeltisi (% 20 susuz DMSO içerisinde ağırlık / hacim olarak) elde etmek için 44 ul içerisinde Fluo-3 membran geçirgen asetoksimetil ester türevi (Fluo-3 AM, Tablo III) 'ün 50 mg çözülür 1 mM Fluo-3 en az 1 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir stok solüsyonu, Am.
- 15 ul ekle Fluo-3 hücre süspansiyonu, 1.5 ml (adım 6.1) ve ajitasyon içeren mikrosantrifüj tüpüne stok solüsyonu AMdikkatli.
- Bir optik olarak donuk olan bir kutuda 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu inkübe edin.
- Kısaca yaklaşık 6000 rpm santrifüj.
- Süpernatantı atın ve 1.5 ml banyo solüsyonu (Tablo IV) pelet yeniden askıya.
- Deneyleri ile başlamadan önce de-esterifikasyon için yaklaşık 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu bırakın.
7. Eşzamanlı Patch-kelepçe ve epifluorescent Ca 2 + Ölçümler
Yama-kelepçe ölçümleri bu yorumu en önemli konu olmadığı, bu tekniğin derinlemesine bir açıklama daha sağlayan diğer yayınlar için ilgilenen okuyucu bakın. 11-14 bütünlüğü uğruna biz ölçmek için bir protokol kısa bir özetini aksiyon potansiyelleri veya L-tipi Ca 2 + akımları, eş zamanlı Ca 2 +-geçici kayıtları ile birlikte hem.
Deneyler sırasında miyositler banyo soluti ile 37 ° C'de superfused edilirhızlı bir perfüzyon sistemi (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY) ile (Tablo IV). Voltaj-kıskaç deneyleri için, K + akımlarının banyo solüsyonuna 4-aminopiridin (5 mg / L) ve BaCl 2 (0.1 mmol / L) eklenerek bloke edilmiştir. Borosilikat cam Mikroelektronlar kullanılır ve pipet çözüm (Tablo V) ile dolu zaman MQ 2-5 dirençleri ucu olmalıdır. Fluo-3 ek olarak (adım 6), miyosit yükleme PM, Flu-3, aynı zamanda pipet çözeltisi (Tablo V) 'de yer almaktadır. Floresan 488 nm heyecanlı ve yayılan ışık (<520 nm) [Ca 2 +] i varsayarak dönüştürülür
burada K, D Fluo-3 sabiti = çözünme (864 KM), K = Fluo-3 floresan;. Fmax = Ca2 her deney sonunda elde edilen + doymuş floresan 12 elektrik sinyalleri ve Epifluorescent Ca2 + hem de görüntü sinyallerini da kaydedilir. Aksiyon potansiyelleri 1.2x eşik gücü 1 msn akım darbeleri kullanarak akım kelepçe modunda 0,5 Hz uyarılır. L tipi Ca2 + akımları, 100 milisaniye ile hızlı-Na + akımı, ardından etkisiz hale getirmek için -80 mV değerinde bir tutma potansiyeli -40 mV'a bir 100-msn rampa darbe ile voltaj-kelepçe modunda ölçülür 0,5 Hz +10 mV test darbe.
Representative Results
Şekil 2A izole insan sağ atriyal miyositlerden üç temsilci örnekler gösterir. Bir CellFinder mikroskop lamı (üzerine hücre süspansiyonu (adım 5.5) 10 ul pipet hücre verimi ölçmek için http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). 16.5 ± 3.1 cells/10 ul (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 ul: Şekil 2B'de Ortalama hücre verim açıkça kronik AF (CAF) daha düşük hücre verim eğilimi hasta örnekleri (tüp bir olduğunu gösterir (n = 10) sırasıyla SR ve Caf, p <0.05; tüp B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ul (n = 29) vs 5.9 ± SR ve Caf 2.0 cells/10 ul (n = 9), , p = 0.107).
Aksiyon potansiyel ölçümleri ve sitosolik Ca2 +, aynı anda geçici kayıtları için temsili örnekler, Şekil 3'te verilmiştir. Incelenmiştir hücreler, T arasında yaklaşık% 90o aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca 2 + sürümü açık ve normal bir cep kasılmalar neden olur. Önceden bildirildiği gibi, hücre bütünlüğü için kabul edilen bir göstergesidir istirahat membran potansiyeli, -73.9 hakkında ortalama ± 2.7 mV (n = 23/10 miyositler / hasta) ve -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 miyositler / hasta ) sırasıyla SR ve Caf (p> 0,05). 15 Şekil 4 voltaj bağımlı L-tipi Ca 2 + akımları ve sitozolik Ca 2 + geçici temsilcisi eş zamanlı kayıtları gösterir. Seçici olmayan β-adrenoseptör agonisti izoprenalin (1 uM) Uygulama sağlam β-adrenerjik sinyal transdüksiyon kaskadının düşündüren bir Ca, L ve sitosolik Ca2 + hem de geçici amplitüdlerinin artırır.
FŞEKIL 1. miyositler Fluo-3 akış şeması (adım 6.1-6.5 bakınız) protokolü yükleme AM. m / v, kütle / hacim.
Şekil 2. Depolama çözümü bir saat sonra bir, izole insan sağ atriyal miyositler. B, depolama çözümü hücrelerin 10 ul sayılır hücre verim ± SEM (adım 5.5) ortalama. n, her bir grup içinde preparatların sayısını ifade eder. * P <0.05.
Aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca 2 sinüs ritmi bir atriyal miyosit içinde +-geçici (Cat) ve chr Şekil 3. Temsilcisi kayıtlarıonic atriyal fibrilasyon hasta. Top: Enjekte stimülasyon (0.5 Hz) için kullanılan akım membran (I M). Aşağıda: membran potansiyeli (V M) ve tetiklenen Cat (alt) aynı anda kayıt. (Voigt ve ark izniyle Replotted. 2012) 15
L-tipi Ca 2 izoprenalin (1 mcM) etkisi Şekil 4. Temsilcisi kayıtları + akım tetiklenen Ca 2 sinüs ritmi ve kronik atriyal fibrilasyon hasta bir atriyal miyosit içinde +-geçici (Cat). Top: Gerilim-kelepçe protokolü (0.5 Hz). Aşağıda: Mevcut toplam net membran Eş zamanlı kayıt (I M), ağırlıklı olarak L-tipi Ca 2 + akım (orta) ve tetiklenen Cat (alt) yansıtan. (Voigt izni ile Replotted,ve ark. 2012) 15
Tablo I. Çözümler.
Tablo II. Özel ekipman.
Tablo III. Fluo-3 ile miyositlerin yükleme için maddeler var.
Tablo IV. Yama-kelepçe için banyo çözüm.
Yama-kelepçe * için Tablo V. Pipet çözüm.
Discussion
Burada açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları insan atriyal miyositlerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Sitosolik Ca2 ölçümleri için bu miyositler kullanmak için + Eğer saklama çözeltisinden EGTA ihmal edilmesi ile daha önce tarif edilen yöntem 4-11 uyarlanmıştır.
Zaten 1970 yılında bu miyositler + sindirim sırasında Ca 2 varlığında ayırmak rağmen, hepsi nedenle kontraktürü ve cansız. 16,17 içinde olduğu gözlenmiştir, hücre izolasyonu Ca 2 +-ücretsiz bir çözüm yapılır. Ancak, Ca 2 fizyolojik konsantrasyonlarının yeniden giriş + hızlı Ca 2 + akını ve hücre ölümüne neden oldu. Bu aslında Zimmerman ve Hulsman ile perfüze gözlenmiştir Ca2 + paradoks bir olgu olarak tarif edilmiştir. 7.0 pH azaltılması da dahil olmak üzere yalıtım ortamı 18 Değişiklikler <taurin 20 veya Ca 2 + (adım 3.2 ve 4.1 'e bakınız), 21 yanı sıra, depolama çözelti 22 EGTA ihtiva eden izole miyosit depolama küçük miktarlarda> 19, ek destek Ca2 + paradoksu. 17 engellemek için öne sürülmüştür Bununla birlikte, iyi bir Ca2 + EGTA ile tampon L-tipi Ca 2 + akımı genliği ile indüklenen Ca2 + geçici genlik ve Ca2 + geçici bifazik bir çürüme ile sonuçlanır azalttığı bilinmektedir. 23. Bu nedenle, EGTA ihmal Tipik özellikleri ve tek fazlı bozunur olan Ca2 + geçici elde etmek için, tüm süreç boyunca izolasyon. Ca 2 + hücreleri korumak için paradoks biz 0.2 mM kadar kademeli bir şekilde depolama çözeltinin nihai Ca2 + konsantrasyonu artar.
Kollajenaz seçimi muhtemelen başarılı miyosit izolasyon için en önemli adımdır. Geleneksel collagenases Clostridium histolyticum elde edilen ham preparatlar olup diğer proteinazlar polysaccharidases ve lipazlar arasında bir dizi ek kolajenaz içerir. Kendi genel kompozisyon kolajenazlar göre farklı bölünmüştür. 24 Worthington kollajenaz Türleri I ve II başarıyla anda açıklanan protokolde insan atriyal miyositlerin izolasyonu. 4-10,15,25-30 için kullanılmıştır biz kollajenaz kullanılmasını tavsiye biz de kollajenaz Tip II kullanarak canlı hücreler kabul edilebilir miktarda elde etmek mümkün olmasına rağmen, ben yazın. Ancak, hatta tek bir kollajenaz tip içinde enzim faaliyetleri ile ilgili önemli bir toplu-seri farklılıklar vardır. Bu varyasyonlar dikkatli toplu seçimi ve izolasyon prosedürü optimize etmek için çeşitli gruplar test gerektirir. Worthington Biyokimyasal Corp (den online olarak mevcuttur toplu-seçim aracı http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php), insan atrial miyosit izolasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir bir bileşim ile uygun gruplar bulmak için de kullanılabilir. Şu anda kollajenaz 250 U / mg kollajenaz aktivite, 345 U / mg caseinase aktivite, 2.16 U / mg clostripain aktivite ve 0.48 U / mg triptik aktivite (lot # 49H11338) ile tip I kullanın.
Bu makalede tarif edilen prosedür kullanılarak elde edilen hücreler patch-clamp çalışmaları, Ca2 + geçici ölçümleri ve ek olarak her iki. 15 bir kombinasyonu için 8 saat içinde kullanılabilir, bu hücrelerin elektrik alanı uyarılmasına tepki olarak hücre daralma ölçümü sağlar ya da elektrik stimülasyonu yama-kelepçe pipet (yayınlanmamış gözlemler) kullanarak.
Disclosures
Worthington Biyokimyasal Corp video dosyasının üretim maliyetleri kapsayan bu yayın destekledi. Fon bir çalışma tasarımında rol, veri toplama ve analizi, yayınlamak karar, ya da yazının hazırlanması vardı.
Acknowledgments
Buna ek olarak, onların mükemmel teknik destek için insan atriyal doku ve Claudia Liebetrau, Katrin Kupser ve Ramona Nagel sağlanması için Heidelberg Üniversitesi'nde kalp cerrahlar teşekkür ederim. Onun yararlı öneriler ve Ca 2 + geçici ölçümlerin kuruluş aşamasında danışmanlık için de Andy W. Trafford için teşekkür etmek istiyorum. Onlar hücresel elektrofizyoloji ve kardiyomiyosit izolasyon temel teknikleri ve becerileri öğrenmek için bize sunulan fırsatı için Teknoloji Dresden Üniversitesi: Yazarlar Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı (Ursula Ravens kafa) üyelerine en derin şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz.
Yazarlar araştırma Alman Araştırma Vakfı (Do769/1-1-3), Atriyal fibrilasyon Yetkinlik Ağı aracılığıyla Eğitim ve Araştırma Alman Federal Bakanlığı (01Gi0204) ve Kardiyovasküler Araştırma için Alman Merkezi aracılığıyla Avrupa Birliği tarafından desteklenmektedir EuAtriyal fibrilasyon içinde Translational Araştırma Sanatlar Lisesi, Avrupa Ağı (EUTRAF, FP7-SAĞLIK-2010, büyük ölçekli entegre proje, Teklif No 261057) ve Avrupa-Kuzey Amerika Atriyal fibrilasyon Araştırma Birliği (ENAFRA) Vakfı Leducq (07CVD03) bir hibe.
Video dosyası gösterilen şematik bir genel Servier, tıp tekniğinde kullanılarak üretildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
