Summary
Vi beskriver isolering af humane atriale myocytter som kan anvendes til intracellulær Ca
Abstract
Studiet af elektrofysiologiske egenskaber af hjerte ionkanaler med patch-clamp teknik og udforskning af cardiac cellulær Ca2 + håndtering abnormiteter kræver isolerede cardiomyocytes. Desuden er muligheden for at undersøge myocytter fra patienter, som anvender disse teknikker en uvurderlig krav at belyse den molekylære basis for hjertesygdomme, såsom atrieflimren (AF). 1. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af humane atriale myocytter som er egnet til både patch-clamp-forsøg og samtidige målinger af intracellulære Ca 2 + koncentrationer. Først højre atrium vedhæng opnået fra patienter, der gennemgår åben hjertekirurgi hakket i små væv bidder ("bid-metoden"), og vaskes i Ca 2 +-fri løsning. Så væv klumper er fordøjet i collagenase og protease opløsninger med 20 pM Ca 2 +. Derefter de isolerede myocytes er harveplace ved filtrering og centrifugering af vævssuspensionen. Endelig er Ca2 +-koncentration i cellen lagerløsning justeret trinvist til 0,2 mM. Vi kort diskutere betydningen af Ca 2 + og Ca 2 + buffering under isolation processen og også give repræsentative optagelser af aktionspotentialer og membran strømninger, både sammen med samtidige Ca 2 + forbigående målinger udført i disse isolerede myocytes.
Introduction
Studere elektrofysiologiske egenskaber af hjerte ionkanaler med patch-clamp teknik og udforskning af cellulære Ca 2 + håndtering abnormiteter kræver isolerede cardiomyocytes. Disse er normalt opnået efter in vitro eksponering af hjerte vævsprøver til fordøjelsesenzymer (collagenase, hyaluronidase, peptidase osv.). Siden den første rapport af isolering af levedygtige hjertemyocytter i 1955 2 en stor mængde af protokoller er blevet udviklet med henblik på at høste enkelt atrielle og ventrikulære cardiomyocytter fra forskellige arter, herunder mus, rotte, kanin, hund, marsvin og menneske. I denne gennemgang fokuserer vi på isolering af humane atrielle myocytes. Vedrørende procedurer for isolering af myocytter fra andre arter, vi refererer til "Worthington Tissue Dissociation guide" fra Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
et al. 3. Her giver vi et trin-for-trin beskrivelse af en teknik, der er tilpasset fra en tidligere publiceret metode, med henblik på at opnå atrielle myocytes egnede ikke kun for patch-clamp eksperimenter, men også for samtidige intracellulære Ca2 + målinger. 4-11
Protocol
Forsøgsprotokoller skal godkendes af den lokale etiske komité, og alle patienter skal give skriftligt informeret samtykke. Vores forskning blev godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet Mannheim, Heidelberg Universitet (# 2011-216N-MA), og blev udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke.
0. Indhentning Humant atrievæv
Under rutinemæssige kanyleringssted procedurer i patienter, der gennemgår åben hjerteoperation for kardiopulmonær bypass, er spidsen af højre atriale vedhæng fjernes sædvanligvis og kan anvendes til isolering af atrielle cardiomyocytter. Efter udskæring vævsprøven overføres straks til en 50 ml Falcon-rør med steril Ca2 +-fri transport opløsning indeholdende 2,3-butandion monoxime (tabel I; BDM kontraktile inhibitor, forhindrer myocyt contracture). Med transporttider mellem 30 og 45 min, vi ikke genkende en klar fordel for køling eller iltning både med hensyn til antallet og kvaliteten af isolerede atrielle cardiomyocytes. I almindelighed transport til laboratoriet, bør være så hurtig som muligt. Men hvis længere transporttid ikke kan undgås, transport ved 4 ° C i iltet løsning kunne være en fordel.
1.. Prearrangements
- Tænd thermocirculator, der styrer temperaturen af den med kappe bægerglas (tabel II). Sørg for, at temperaturen i bægeret er lig 37 ° C. Bægerglasset dækkes med et glaslåg at opretholde en konstant temperatur i bægerglasset hele isolation processen.
- Afvejes collagenase I og protease XXIV i tre glasbægre og opbevare det ved stuetemperatur. De enzymer vil blive fortyndes lige før brug.
- Store 20 ml Ca2 + fri opløsning i en petriskål ved 4 ° C.
- Store 250 ml Ca2 + fri opløsning i et vandbad ved 37 ° C.
2.. Rengøring af Tissue
- Overfør vævsprøve sammen med transportløsning i en petriskål (~ 10 cm i diameter), og fjern fedtvævet groft med en saks.
- Afvejes vævsprøven. Mellem 200 og 600 mg anvendes til celleisolering. Den resterende væv kan fryses i flydende nitrogen i senere biokemisk analyse.
- Overfør vævsprøven i petriskål indeholdende 20 ml Ca2 + fri opløsning ved 4 ° C (se trin 1.3) og hak vævsprøven i små stykker på ca 1 mm 3 i størrelse.
- Følgende trin skal udføres ved 37 ° C og under løbende gasning med 100% O 2. En pipette spids kan placeres på ilt røret for at undgå stærk boblende og generere kontinuerlig luftstrøm.
- Overfør væv klumper sammen med Ca2 +-fri opløsning ifor det dobbeltvæggede bægerglas og der omrøres forsigtigt i ca 3 minutter med en magnetomrører.
- Stop omrøring og tillade væv bidder at slå sig ned i et par sekunder. Forsigtigt stamme supernatanten gennem en nylon mesh (200 um, tabel II). Returnér fastholdte væv bidder fra masken i bægerglasset med en pincet.
- Refill bægeret med Ca 2 + gratis løsning og gentag vasketrinnet 2.4 og 2.5 to gange.
3.. Første enzymatisk nedbrydning
- Genopslæmmes væv bidder med 20 ml Enzyme løsning E1 (tabel I), der indeholder collagenase og protease og rør forsigtigt i 10 min.
- Tilsæt 40 gl 10 mM CaCl2-opløsning til opnåelse af en slutkoncentration på 20 uM Ca 2 +.
- Efter 35 min stamme supernatanten forsigtigt gennem en nylon mesh (200 um, tabel II) på en måde, at de fleste væv klumper forbliver i bægerglasset. Retur hvileregnede væv bidder fra masken ned i bægerglasset.
4.. Anden enzymatisk nedbrydning
- Gensuspendér væv bidder igen med 20 ml enzymopløsning E2 indeholdende collagenase jeg kun (tabel I). Tilsæt 40 gl 10 mM CaCl2-opløsning umiddelbart til opnåelse af en slutkoncentration på 20 uM Ca 2 +.
- I andet fordøjelsen brug sakse til yderligere hakke væv blodpropper lejlighedsvis.
- Efter 5 minutter tage en prøve ved hjælp af en Pasteur-pipette til at kontrollere dissociation af cellerne. Gentag dette hver 2-3 min, indtil stavformede, tværstribede cardiomyocytes vises.
- Stop omrøring og tillade væv bidder at slå sig ned i ca 20-30 sek.
- Strain supernatanten forsigtigt gennem en nylon mesh (200 um, tabel II) i en 50 ml Falcon-rør (Tube A). Returnér fastholdte væv bidder fra masken ned i bægerglasset.
- Genopslæmmes væv bidder i bægerglasset med 20 ml storage opløsning (tabel I) 10 og yderligere dissociere cellerne ved forsigtig mekanisk triturering anvendelse af en 20 ml serologisk pipette med dispenseren. Prøv at undgå bobledannelse da boblerne er skadelige for celleoverlevelse og kvalitet.
- Strain supernatanten forsigtigt gennem en nylon mesh (200 um, tabel II) i en 50 ml Falcon-rør (Tube B).
5.. Final Forberedelse og Regulering af Final Ca 2 + koncentration
- Centrifugeres både Falcon rør A og B (se trin 4.5 og 4.7) ved 95 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten fra begge rør omhyggeligt ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre bundfaldet. Supernatanten.
- Genopslæmmes begge pellets i 1,5 ml lagerløsning (tabel I) hver (stuetemperatur).
- Tilføj to gange 7,5 gl 10 mM CaCl2 opløsning til hver Falcon og rør grundigt. Inkuber i 10 minutter efter hvert trin.
- Tilsæt 15 gl 10 mM CaCl2 opløsning til opnåelse af en endelig Ca 2 +-koncentration på 0,2 mM.
6.. Lastning af Myocytter med fluorescerende Ca2 +-indikator Fluo-3 AM (figur 1)
- Overfør 1,5 ml cellesuspension (rør A og / eller rør B) i en 2 ml mikrocentrifugerør (Eppendorf-rør).
- Følgende trin bør gennemføres under hensyntagen til lysfølsomhed på det fluorescerende Ca 2 + indikator Fluo-3.
- Opløs 50 ug af membranen gennemtrængelig acetoxymethylester derivat af Fluo-3 (Fluo-3 AM tabel III) i 44 ul af Pluronic F-127 (tabel III) stamopløsning (20% w / v i vandfrit DMSO) for at få en 1 mM Fluo-3:00 stamopløsning, som kan opbevares ved -20 ° C i højst 1 uge.
- Tilsæt 15 ul af Fluo-3:00 stamopløsning til mikrocentrifugerør indeholdende 1,5 ml cellesuspension (se trin 6.1) og agitereomhyggeligt.
- Inkubér cellesuspensionen i 10 min i en optisk uigennemsigtig boks.
- Kortvarigt centrifugeres ved ca 6.000 rpm.
- Supernatanten fjernes, og resuspender pellet i 1,5 ml bad opløsning (tabel IV).
- Forlade cellen suspension i ca 30 min til de-forestring, før du begynder med eksperimenter.
7.. Samtidige Patch-clamp og epifluorescerende Ca 2 + Målinger
Da patch-clamp målinger ikke er det vigtigste emne i denne anmeldelse, henviser vi den interesserede læser til andre publikationer med en mere uddybende beskrivelse af denne teknik. 11-14 For fuldstændighedens skyld giver vi et kort resumé af en protokol til at måle virkningspotentialer eller L-type Ca2 + strømme, både sammen med samtidige Ca 2 +-forbigående optagelser.
Under forsøgene myocytes er superfusioneret ved 37 ° C med bad solutipå (tabel IV) under anvendelse af en hurtig perfusionssystem (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). For spænding-clamp eksperimenter, er K + strømme blokeres ved tilsætning af 4-aminopyridin (5 mmol / l) og BaCl2 (0,1 mmol / l) til badopløsningen. Borsilicatglashulsfærer mikroelektroder anvendes og skulle have tip modstande på 2-5 MOhm når den er fyldt med pipette opløsning (tabel V). Ud over de Fluo-3:00 lastningen af myocytter (se trin 6), er Fluo-3 også inkluderet i pipetten opløsning (tabel V). Fluorescens er begejstret ved 488 nm, og udsendte lys (<520 nm) omregnet til [Ca 2 +] Jeg antager
hvor k d = dissociationskonstant Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescens,. F max = Ca 2 +-mættet fluorescens opnået ved slutningen af hvert forsøg 12 Både elektriske signaler og epifluorescerende Ca2 + signaler registreres samtidigt. Virkningspotentialer stimuleres ved 0,5 Hz i den nuværende-clamp-tilstand ved hjælp 1 millisekund nuværende pulser af 1,2 x tærskel styrke. L-typen Ca2 +-strømme måles i spænding-clamp tilstand via en bedrift potentiale på -80 mV og en 100-msek rampe-puls til -40 mV at inaktivere den hurtige Na +-strøm, efterfulgt af en 100-msek test-puls til +10 mV ved 0,5 Hz.
Representative Results
Figur 2A viser tre repræsentative eksempler fra isolerede humane højre atrium myocytter. At kvantificere celleudbyttet vi afpipetteres 10 pi cellesuspension (trin 5.5) på en CellFinder mikroskopobjektglas ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Midlede celleudbytter i figur 2B viser klart, at der er en tendens til lavere celleudbytter i kronisk AF (CAF) patientprøver (tube A: 16,5 ± 3,1 celler/10 pi (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 celler/10 pi (n = 10) i SR og CAF, p <0,05, rør B: 17,9 ± 3,9 celler/10 pi (n = 29) og 5,9 ± 2,0 celler/10 pi (n = 9) i SR og CAF , p = 0,107).
Repræsentative eksempler på action-potentiale målinger og samtidige optagelser af cytosoliske Ca2 + transienter er givet i figur 3.. I omkring 90% af de undersøgte celler, tHan action-potentiale-udløst Ca 2 + frigivelse forårsager klare og regelmæssige celle sammentrækninger. Som tidligere rapporteret, den hvilende membranpotentiale, som er en accepteret indikator for celle integritet, gennemsnit omkring -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytter / patienter) og -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytter / patienter ) i SR og CAF (p> 0,05). 15. Figur 4 viser repræsentative samtidige optagelser af spændingsstyret L-typen Ca2 + strømme og cytosolisk Ca2 + transienter. Anvendelsen af ikke-selektive β-agonist isoprenalin (1 uM) øger amplituderne af både I Ca, L og cytosolisk Ca2 +-transienter, hvilket tyder intakt β-adrenerg signaltransduktionskaskade.
Figur 1.. Flow diagram af myocytes Fluo-03:00 lastning protokol (se trin 6,1-6,5). m / v, masse / volumen.
Figur 2. A, isoleret human højre atrium myocytes efter en time i storageløsning. B, Mean ± SEM af cellen udbyttet tælles i 10 pi af celler i storageløsning (se trin 5.5). n refererer til antallet af præparater inden for hver gruppe. * P <0,05.
Figur 3.. Repræsentative optagelser af action-potentiale-udløst Ca 2 +-transienter (CAT) i en atrial myocyte fra en sinusrytme og chronic atrieflimren patient. Top: Sprøjtet membran strøm (I M), der anvendes til stimulering (0,5 Hz). Herunder: Samtidig optagelse af membranpotentialet (V M), og udløste CaT (nederst). (Plottes igen med tilladelse fra Voigt et al. 2012) 15
Figur 4.. Repræsentative optagelser af isoprenalin (1 uM) virkning på L-typen Ca 2 + strøm-udløst Ca 2 +-transienter (CAT) i en atrial myocyt fra en sinus rytme og en kronisk atrieflimren patient. Top: Spænding-clamp-protokol (0,5 Hz). Herunder: Samtidig optagelse af de samlede netto membran strøm (I M), hovedsageligt afspejler L-typen Ca 2 + strøm (i midten) og udløste CaT (nederst). (Plottes igen med tilladelse fra Voigt,et al. 2012) 15
Tabel I. Solutions.
Tabel II. Specifikt udstyr.
Tabel III. Stoffer til lastning af myocytter med Fluo-3 AM.
Tabel IV. Bath løsning til patch-clamp.
Tabel V. Pipette løsning til patch-clamp *.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af humane atriale myocytter fra højre atrium vedhæng opnået fra patienter, der gennemgår åben hjertekirurgi. For at bruge disse myocytter til måling af cytosolisk Ca2 + vi tilpasset en tidligere beskrevet metode 4-11 ved at udelade EGTA fra storageløsning.
Allerede i 1970 blev det observeret, at selv om myocytter dissocierer i nærværelse af Ca2 + under fordøjelsen, alle af dem var i kontraktur og ikke-levedygtige. 16,17 Derfor celleisolering udføres i Ca2 +-fri opløsning. Imidlertid genindførelsen af fysiologiske koncentrationer af Ca2 + resulterede i hurtig Ca2 +-indstrømning og celledød. Dette er blevet beskrevet som Ca2 + paradoks fænomen, som oprindeligt blev observeret i perfunderede hjerter ved Zimmerman og Hulsman. 18. Ændringer af isoleringsmedier herunder reduktion af pH til 7,0, <sup> 19 tilsætning af taurin 20 eller af små mængder Ca2 + (se trin 3.2 og 4.1), 21 samt opbevaring af isolerede myocytter i EGTA indeholdende storage-løsning 22 er blevet foreslået for at forhindre Ca2 + paradoks. 17. Men det er velkendt, at Ca2 + buffering gennem EGTA reducerer amplituden af L-typen Ca 2 + strøm-induceret Ca2 + forbigående amplituder og resulterer i en bifasisk henfald af Ca 2 + transienter. 23. Derfor har vi udeladt EGTA hele isolation processen for at opnå Ca 2 +-transienter med typiske egenskaber og monofasiske henfald. At beskytte cellerne fra Ca 2 + paradoks vi øget endelige Ca2 +-koncentration af lageret opløsning i en trinvis måde, indtil 0,2 mM.
Valget af collagenase er sandsynligvis det mest kritiske skridt for en vellykket myocyt isolation. Konventionel collagenases er råpræparater opnået fra Clostridium histolyticum og indeholder collagenase foruden en række andre proteinaser, polysaccharidases og lipaser. Baseret på deres generelle sammensætning kollagenaser er opdelt i forskellige typer. 24. Worthington kollagenase type I og II, er blevet anvendt med succes til isolering af humane atriale myocytes. 4-10,15,25-30 I vores nuværende beskrevne protokol anbefaler vi brug af collagenase Type I, selv om vi var også i stand til at opnå acceptable mængder af levedygtige celler ved hjælp af kollagenase type II. Men selv inden for en enkelt kollagenase type er der en betydelig batch-til-batch variation vedrørende enzymaktiviteterne. Disse variationer kræver omhyggelig batch udvælgelse og afprøvning af forskellige partier til at optimere isolation procedure. Den tilgængelige online batch-udvælgelse værktøj fra Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) kan anvendes til at finde ledige partier med en sammensætning, der har vist sig at være egnet til isolering af humane atriale myocytter. I øjeblikket bruger vi collagenase type I med 250 U / mg collagenase aktivitet 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg clostripain aktivitet og 0,48 U / mg tryptisk aktivitet (parti # 49H11338).
De celler opnået ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i dette manuskript kan anvendes inden 8 timer til patch-clamp-forsøg, Ca 2 + forbigående målinger og en kombination af begge. 15. Desuden disse celler tillader målinger af cellulære sammentrækning som reaktion på elektrisk felt stimulation eller elektrisk stimulation ved hjælp af patch-clamp pipette (upublicerede observationer).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp støttede denne publikation ved at dække produktionsomkostningerne videofil. Den finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af manuskriptet.
Acknowledgments
Desuden takker vi hjertets kirurger på Heidelberg Universitet for levering af humane atrievæv og Claudia Liebetrau, Katrin Kupser og Ramona Nagel for deres fremragende tekniske support. Særlige tak også til Andy W. Trafford for hans nyttige forslag og råd under etableringen af Ca 2 + forbigående målinger. Forfatterne ønsker at udtrykke deres dybeste taknemmelighed til medlemmerne af Institut for Farmakologi og Toksikologi (hoved: Ursula Ravens) i Dresden Teknologiske Universitet for muligheden tilbudt de os til at lære de grundlæggende teknikker og færdigheder i cellulær elektrofysiologi og cardiomyocyte isolation.
Forfatternes forskning er støttet af den tyske Research Foundation (Do769/1-1-3), det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning gennem atrieflimren Competence Network (01Gi0204) og den tyske Center for Cardiovascular Research, EU gennem Europæiske Netværk for Translationel forskning i atrieflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, store integrerede projekt, forslag nr. 261.057) og den europæiske-nordamerikanske atrieflimren Research Alliance (ENAFRA) tilskud på Fondation Leducq (07CVD03).
Den skematiske oversigt er vist i videoen filen blev fremstillet ved hjælp af Servier medicinsk art.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
