Summary
Vi beskriver isoleringen av humana atriella myocyter som kan användas för intracellulär Ca
Abstract
Studiet av elektrofysiologiska egenskaper hos jonkanaler med patch-clamp teknik och utforskandet av hjärt-cellulär Ca2 + hanterar avvikelser kräver isolerade hjärtmuskelceller. Dessutom är möjligheten att undersöka myocyter från patienter som använder dessa tekniker ett ovärderligt kravet att belysa den molekylära grunden för hjärtsjukdomar, såsom förmaksflimmer (AF). 1 Här beskriver vi en metod för isolering av humana atriella myocyter som är lämpliga för både patch-clamp-studier och samtidiga mätningar av intracellulära Ca2 +-koncentrationer. Först höger förmak bihang erhållna från patienter som genomgår öppen hjärtkirurgi hackad i små vävnad bitar ("bit metoden") och tvättas i Ca2 +-fri lösning. Då vävnaden bitar smälts i koUagenas och proteas innehållande lösningar med 20 pM Ca 2 +. Därefter de isolerade myocyter harvested genom filtrering och centrifugering av vävnaden suspensionen. Slutligen är den Ca2 +-koncentrationen i cellen lagringslösning justeras stegvis till 0,2 mM. Vi diskuterar kortfattat innebörden av Ca 2 + och Ca 2 + buffring under isoleringen processen och även ge representativa inspelningar av aktionspotentialer och strömmar membran, både tillsammans med samtidig Ca2 + transienta mätningar som utförs i dessa isolerade muskelceller.
Introduction
Studera elektrofysiologiska egenskaper hos jonkanaler med patch-clamp teknik och utforskandet av cellulär Ca2 + hantering avvikelser kräver isolerade hjärtmuskelceller. Dessa är oftast erhålls efter in vitro exponering av hjärt vävnadsprover till matsmältningsenzymer (kollagenas, hyaluronidas, peptidas etc.). Sedan den första rapporten av isolering av livskraftiga hjärtmyocyter 1955 2 en stor mängd protokoll har utvecklats för att skörda enstaka förmaks-och ventrikulär cardiomyocytes från olika arter, inklusive mus, råtta, kanin, hund, marsvin och människa. I denna översyn kommer vi att fokusera på isolering av humana atriella myocyter. Beträffande förfaranden för isolering av myocyter från andra arter som vi hänvisar till "Worthington vävnadsdissociering guide" från Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
et al. 3 Här ger vi en steg-för-steg beskrivning av en teknik som är anpassad från en tidigare publicerad metod, i syfte att erhålla atriella myocyter lämpliga inte bara för patch-clamp-experiment utan även för samtidiga intracellulära Ca2 +-mätningar. 4-11
Protocol
Experimentella protokoll måste godkännas av den lokala etiska kommittén och alla patienter måste ge skriftligt informerat samtycke. Vår forskning godkändes av den etiska kommittén vid medicinska fakulteten Mannheim, University of Heidelberg (# 2011-216N-MA) och genomfördes i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.
0. Skaffa Human förmaksvävnaden
Under rutinmässiga kanylering ingrepp hos patienter som genomgår öppen hjärtkirurgi för hjärt bypass-kirurgi, är spetsen på den högra förmak oftast bort och kan användas för isolering av förmaket hjärtmuskelceller. Efter excision vävnadsprovet omedelbart överföras till en 50 ml Falcon rör med steril Ca2 +-fri transport lösning innehållande 2,3-butan monoxim (Tabell I, BDM, kontraktila hämmare, förebygga myocyt contracture). Med transporttider mellan 30 och 45 minuter, gjorde vi inte igen en klar fördel av kyla eller syresättning med avseende på både antalet och kvaliteten på isolerade atrium hjärtmuskelceller. I allmänhet transport till labbet bör vara så snabb som möjligt. Om längre transporttid inte kan undvikas, transport vid 4 ° C i syresatt lösning kan vara fördelaktigt.
Ett. Prearrangements
- Slå på thermocirculator, som styr temperaturen hos den mantlade bägaren (tabell II). Se till att temperaturen inuti bägaren motsvarar 37 ° C. Täck bägaren med ett glaslock för att hålla en konstant temperatur inuti bägaren genom hela isoleringsprocessen.
- Väg Kollagenas I och proteas XXIV i tre glasbägare och förvara den i rumstemperatur. Enzymerna kommer att spädas omedelbart före användning.
- Store 20 ml av Ca 2 + fri lösning i en petriskål vid 4 ° C.
- Store 250 ml av Ca 2 + fri lösning i ett vattenbad vid 37 ° C.
2. Rengöring av vävnaden
- Överför vävnadsprovet tillsammans med transport lösningen i en petriskål (~ 10 cm diameter) och avlägsna fettvävnad grovt med sax.
- Väg vävnadsprovet. Mellan 200 och 600 mg används för cellisolering. Den kvarvarande vävnaden kan frysas i flytande kväve för senare biokemisk analys.
- Överför vävnadsprovet i petriskål med 20 ml Ca 2 + fri lösning vid 4 ° C (se steg 1.3) och hacka vävnadsprovet i små bitar på ca 1 mm 3 i storlek.
- Följande steg ska utföras vid 37 ° C och under kontinuerlig gasning med 100% O 2. En pipettspetsen kan placeras på syre röret för att undvika starkt bubblande och genererar kontinuerligt luftflöde.
- Överför vävnad bitar tillsammans med Ca 2 +-fri lösning itill den mantlade bägaren och rör om omsorgsfullt under ca 3 min med en magnetisk omrörarstav.
- Sluta röra och låta vävnad bitar att bosätta sig i några sekunder. Försiktigt sila supernatanten genom ett nylonnät (200 ^ m, tabell II). Avkastningen de återhållsamma vävnad bitar från nätet i bägaren med pincett.
- Refill bägaren med Ca2 + fri lösning och upprepa tvättningssteget 2.4 och 2.5 två gånger.
Tre. Första Enzymatisk Digestion
- Återsuspendera vävnad bitar med 20 ml Enzymlösning E1 (Tabell I) innehållande kollagenas och proteas och rör försiktigt i 10 minuter.
- Tillsätt 40 pl av 10 mM CaCl2-lösning för att erhålla en slutlig koncentration av 20 pM Ca 2 +.
- Efter 35 min sila supernatanten försiktigt genom ett nylonnät (200 um, tabell II) på ett sätt som de flesta av de vävnad bitar kvar i bägaren. Återgå vilaregnade vävnad bitar från nätet i bägaren.
4. Andra Enzymatisk Digestion
- Omsuspendera vävnaden bitarna igen med 20 ml enzymlösning E2 innehållande kollagenas jag bara (Tabell I). Tillsätt 40 pl av 10 mM CaCl2-lösningen omedelbart för att erhålla en slutlig koncentration av 20 pM Ca 2 +.
- Under andra saxen matsmältningen användning till ytterligare hugga vävnad blodproppar ibland.
- Efter 5 min ta ett prov med hjälp av en pasteurpipett för att kontrollera dissociation av celler. Upprepa detta varje 2-3 min tills stavformade, strimmig hjärtmuskelceller visas.
- Sluta röra och låta vävnad bitar att bosätta sig i ca 20-30 sek.
- Sila supernatanten försiktigt genom ett nylonnät (200 ^ m, tabell II) i ett 50 ml Falcon-rör (rör A). Avkastningen de återhållsamma vävnad bitar från nätet i bägaren.
- Återsuspendera vävnad bitar i bägaren med 20 ml StoraGE-lösning (Tabell I) 10 och ytterligare separera cellerna genom försiktig mekanisk sönderdelning med hjälp av en 20 ml serologisk pipett med dispenser. Försök att undvika att bubblor bildas då bubblor är skadliga för cell överlevnad och kvalitet.
- Sila supernatanten försiktigt genom ett nylonnät (200 | im, tabell II) i en 50 ml Falcon-rör (rör B).
Fem. Slutlig beredning och justering av Final Ca2 +-koncentrationen
- Centrifugera både Falcon rör A och B (se steg 4.5 och 4.7) vid 95 xg under 10 min.
- Avlägsna supernatanten från båda rören försiktigt genom aspiration. Se till att inte störa pelleten. Kasta bort supernatanten.
- Återuppslamma både pellets i 1,5 ml lagringslösning (Tabell I) respektive (rumstemperatur).
- Lägg två gånger 7,5 pl 10 mM CaCl2-lösning till varje Falcon och rör om försiktigt. Inkubera i 10 min efter varje steg.
- Tillsätt 15 pl av 10 mM CaCl2-lösning för att erhålla en slutlig Ca2 +-koncentrationen av 0,2 mM.
6. Lastning av Myocyter med fluorescerande Ca2 +-indikator Fluo-3 AM (figur 1)
- Överför 1,5 ml cellsuspension (rör A och / eller rör B) i en 2 ml mikrocentrifugrör (Eppendorf-rör).
- Följande steg ska utföras under övervägande av ljuskänslighet fluorescerande Ca 2 + indikator Fluo-3.
- Lös 50 | ig av membranet permeabelt acetoximetylester derivat av Fluo-3 (Fluo-3:00, tabell III) i 44 ^ il av Pluronic F-127 (tabell III) stamlösning (20% vikt / volym i vattenfri DMSO) för att få en 1 mM Fluo-3:00 stamlösning, som kan lagras vid -20 ° C under högst en vecka.
- Tillsätt 15 pl av Fluo-3:00 stamlösning till mikrocentrifugrör innehållande 1,5 ml cellsuspension (se steg 6.1) och agiteranoggrant.
- Inkubera cellsuspensionen under 10 minuter i en optiskt opak låda.
- Kortfattat centrifugera vid ca 6000 rpm.
- Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 1,5 ml bad lösning (Tabell IV).
- Låt cellsuspension under ca 30 minuter för de-esterifiering innan börjar med experiment.
7. Samtidiga Patch-clamp och epifluorescent Ca2 + Mått
Sedan patch-clamp mätningarna inte den stora ämnet för denna översyn, vi hänvisar den intresserade läsaren till andra publikationer som har en mera ingående beskrivning av denna teknik. 11-14 För fullständighetens skull ger vi en kort sammanfattning av ett protokoll för att mäta aktionspotentialer eller L-typ Ca2 +-strömmar, både tillsammans med samtidiga Ca2 +-transient inspelningar.
Under experiment myocyter är superfused vid 37 ° C med bad solutipå (tabell IV) med användning av en snabb perfusionssystem (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). För spänning-clamp experiment, är K + strömmar blockeras genom tillsats av 4-aminopyridin (5 mmol / l) och BaCl2 (0,1 mmol / l) till badlösningen. Borosilikatglas microelectrodes används och borde ha tips resistanser 2-5 Mohm när den är fylld med pipett lösning (Tabell V). Förutom den Fluo-03:00 lastning av myocyter (se steg 6), är Fluo-3 också i pipetten lösning (tabell V). Fluorescens exciteras vid 488 nm och emitterade ljuset (<520 nm) omvandlas till [Ca2 +] Jag antar
där k d = dissociationskonstant Fluo-3 (864 NM), F = Fluo-3 fluorescens;. F max = Ca2 +-mättad fluorescens erhålls vid slutet av varje experiment 12 Både elektriska signaler och epifluorescent Ca 2 +-signaler spelas in samtidigt. Aktionspotentialer stimuleras vid 0,5 Hz i ström-clamp-läge med 1 msek strömpulser med 1.2x tröskel styrka. L-typ Ca2 +-strömmar mäts i spänning-clamp-läge med en hållpotential av -80 mV och en 100-ms ramp-puls till -40 mV för att inaktivera den snabba Na +-ström, följt av en 100-ms prov-puls till +10 mV vid 0,5 Hz.
Representative Results
Figur 2A visar tre representativa exempel från isolerade humana högra atriella myocyter. För att kvantifiera cellutbytet vi pipettera 10 l cellsuspension (steg 5,5) på en CellFinder objektglas ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Genomsnittsberäknade cellutbyten i Figur 2B visar tydligt att det finns en tendens till lägre cellutbyten i kronisk AF (CAF) patientprover (rör A: 16,5 ± 3,1 celler/10 il (n = 29) jämfört med 5,1 ± 2,3 celler/10 pl (n = 10) i SR och CAF, respektive p <0,05, rör B: 17,9 ± 3,9 celler/10 pl (n = 29) jämfört med 5,9 ± 2,0 celler/10 pl (n = 9) i SR och CAF, respektive, p = 0,107).
Representativa exempel på action-potentialmätningar och samtidiga inspelningar av cytosoliska Ca 2 + transienter ges i figur 3. I omkring 90% av de undersökta cellerna, than action-potential-utlöst Ca2 + frisättning orsakar tydliga och vanlig cell sammandragningar. Som tidigare rapporterats i genomsnitt vilomembranpotentialen, vilket är en accepterad indikator för cellernas integritet, ca -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocyter / patienter) och -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocyter / patienter ) i SR och CAF respektive (p> 0,05). 15 Figur 4 visar representativa samtidiga inspelningar av spänning-gated L-typ Ca2 +-strömmar och cytosoliska Ca 2 + transienter. Tillämpning av den icke-selektiva β-adrenoceptoragonist isoprenalin (1 pM) ökar amplituden för både I Ca, L och cytosolisk Ca2 + transienter, vilket tyder på intakt β-adrenergisk kaskad signaltransduktion.
Figure 1. Flödesschema av myocyter Fluo-03:00 lastning protokollet (se steg 6,1-6,5). m / v, vikt / volym.
Figur 2. A, Isolerade humana högra atriella myocyter efter en timme i lagringslösning. B, medelvärden ± SEM av cellutbytet räknas i 10 | il av celler i lagringslösning (se steg 5.5). n avser antalet av beredningar inom varje grupp. * P <0,05.
Figur 3. Representativa inspelningar av action-potential-utlöst Ca2 +-transienter (CAT) i en förmaks myocyt från en sinusrytm och ett chrONIC förmaksflimmer patienten. Överst: Injicerat membran ström (I M) används för stimulering (0,5 Hz). Nedan: Samtidig inspelning av membran potential (V M), och utlöste Katt (botten). (Ritat med tillstånd från Voigt et al. 2012) 15
Figur 4. Representativa inspelningar av isoprenalin (1 pM) effekt på L-typ Ca 2 + ström-utlöst Ca2 +-transienter (CAT) i en atriell myocyt från en sinusrytm och en kronisk förmaksflimmer patienten. Top: Spänning-clamp Protocol (0,5 Hz). Nedan: Samtidig inspelning av total netto membran ström (I M), främst avspeglar L-typ Ca2 + ström (mitten) och utlöst cat (botten). (Ritat med tillstånd från Voigt,et al. 2012) 15
Tabell I. Solutions.
Tabell II. Särskild utrustning.
Tabell III. Ämnen för lastning av myocyter med Fluo-3 AM.
Tabell IV. Bath lösning för patch-clamp.
Tabell V. Pipettera lösning för patch-clamp *.
Discussion
Här beskriver vi en metod för isolering av humana atriella myocyter från höger atriumbihangen erhållna från patienter som genomgår öppen hjärtkirurgi. För att kunna använda dessa myocytes för mätningar av cytosoliskt Ca 2 + vi anpassat en tidigare beskriven metod 4-11 genom att utelämna EGTA från lagringslösning.
Redan 1970 konstaterades att även myocytes dissocierar i närvaro av Ca2 + under matsmältningen, var alla av dem i kontraktur och icke livskraftiga. 16,17 Därför cellisolering utförs i Ca2 +-fri lösning. Emellertid återinförandet av fysiologiska koncentrationer av Ca 2 + resulterade i en snabb Ca 2 ^-inflöde och celldöd. Detta har beskrivits som den Ca2 + paradox fenomen som ursprungligen sågs i perfunderade hjärtan av Zimmerman och Hulsman. 18 Ändringar av isoleringsmedia däribland sänkning av pH till 7,0, <sup> 19 tillsats av taurin 20 eller av små mängder av Ca2 + (se steg 3.2 och 4.1), 21 samt lagring av isolerade myocyter i EGTA innehållande förvaring-lösning 22 har föreslagits för att förhindra Ca2 + paradox. 17 Det är emellertid väl känt att Ca 2 + buffring genom EGTA minskar amplituden av L-typ Ca 2 + ström-inducerad Ca 2 + transienta amplituder och resulterar i en bifasisk sönderfallet av Ca 2 +-transienter. 23 Därför utelämnade vi EGTA genom hela isoleringsprocessen för att erhålla Ca 2 +-transienter med typiska egenskaper och monofasiska sönderfall. För att skydda cellerna från Ca2 + paradox vi ökat den sista Ca 2 + koncentrationen av lagringslösning på ett stegvis sätt tills 0,2 mM.
Valet av kollagenas är förmodligen det mest kritiska steget för framgångsrik myocyte isolering. Konventionell collagenases är råa beredningar som utvinns ur Clostridium histolyticum och innehåller kollagenas förutom ett antal andra proteinaser, polysaccharidases och lipaser. Baserat på deras allmänna sammansättningen koUagenaser är uppdelade i olika typer. 24 Worthington kollagenas typ I och II med framgång har använts för isolering av humana atriella myocyter. 4-10,15,25-30 I vår nu beskrivna protokoll vi rekommenderar användning av kollagenas Typ I, även om vi också kunna få acceptabla mängder av livsdugliga celler med kollagenas typ II. Men även inom en och samma kollagenas typ finns det en betydande sats-till-sats variation beträffande enzymaktiviteterna. Dessa variationer kräver noggrann batch urval och testning av olika partier för att optimera isolering förfarande. Online tillgängliga batch-markeringsverktyg från Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) kan användas för att hitta lediga satser med en komposition som har visat sig vara lämpliga för isolering av humana atriella myocyter. För närvarande använder vi kollagenas typ I med 250 U / mg kollagenasaktivitet, 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg klostripain aktivitet och 0,48 U / mg tryptisk aktivitet (mycket # 49H11338).
De celler som erhållits med användning av förfarandet som beskrivs i detta manuskript kan användas inom 8 h för patch-clamp-studier, Ca 2 + transienta mätningar och en kombination av båda. 15 Dessutom är dessa celler kunna mäta cellulärt sammandragning som svar på elektrisk fältstimulering eller elektrisk stimulering med användning av patch-clamp pipett (opublicerade observationer).
Disclosures
Worthington Biochemical Corp stödde denna publikation genom att täcka produktionskostnaderna för videofil. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Acknowledgments
Dessutom tackar vi de hjärt kirurger vid Heidelbergs universitet för tillhandahållande av mänskliga förmaksflimmer vävnad och Claudia Liebetrau, Katrin Kupser och Ramona Nagel för deras utmärkta tekniska support. Särskilt tack också till Andy W. Trafford för hans användbara förslag och råd under upprättandet av Ca2 + transienta mätningar. Författarna vill uttrycka sin djupaste tacksamhet till medlemmarna i avdelningen för farmakologi och toxikologi (head: Ursula Ravens) av Dresdens Tekniska Universitet för tillfället de erbjöd oss att lära sig grundläggande tekniker och färdigheter i cellulär elektrofysiologi och cardiomyocyte isolering.
Författarnas forskning stöds av den tyska Research Foundation (Do769/1-1-3), det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning genom Förmaksflimmer Competence Network (01Gi0204) och den tyska Centrum för kardiovaskulär forskning, Europeiska unionen genom Europeiska nätverket för translationell forskning i förmaksflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, och stora integrerade projekt, förslag nr 261.057) och Europeiska-nordamerikanska förmaksflimmer Research Alliance (ENAFRA) beviljande av Fondation Leducq (07CVD03).
Den schematiska översikten visas i videofilen producerades med Servier medicinsk art.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I |  Worthington |
4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
