Near Infrared optisk projeksjon Tomography for vurderinger av β-celle Mass Distribusjon i Diabetes Research

Summary

Vi beskriver tilpasning av optiske projeksjon tomografi (OPT)

Abstract

Ved å tilpasse OPT å inkludere evnen bildebehandling i nær infrarødt (NIR) spektrum, vi her illustrerer muligheten til bilde større legemer av pankreasvevet, for eksempel rotte bukspyttkjertel, og å øke antallet av kanaler (celletyper) som kan bli studert i en enkelt prøve. Vi videre beskrive gjennomføring av en rekke av dataverktøy som gir: 1 / nøyaktig posisjonering av en prøve er (i vårt tilfelle bukspyttkjertelen) tyngdepunkt (COM) ved dreieaksen (AR) ^2; 2 / forbedrede algoritmer for post -justering tuning som hindrer geometriske forvrengninger under tomographic gjenoppbygging ² og 3 / en protokoll for intensitet utjevning for å øke signal til støy-forhold i OPT-baserte BCM bestemmelser ^3. I tillegg beskriver vi en prøveholderen som minimerer risikoen for utilsiktede bevegelser av prøven under bildet oppkjøpet. Sammen utgjør disse protokollene gjør vurderinger av BCM distribusjon og OTHeh funksjoner, som skal utføres i hele volumet av intakt pancreata eller andre organer (f.eks i studier av holme transplantasjon), med en oppløsning ned til nivået av individuelle Langerhans øyer.

Introduction

De insulinproduserende β-celler er nøkkelen til kroppens evne til å kontrollere blodsukkeret homeostase. Derfor vurderinger av bukspyttkjertelen BCM distribusjon er viktig for mange områder av pre-klinisk diabetes forskning. I evalueringer av terapeutiske regimer for eksempel effekten av målrettet genet ablasjon på endokrin celledifferensiering eller studier av diabetes etiologien i gnagermodeller for sykdommen ofte avhenge av slike analyser. Tradisjonelt har denne type vurderinger lettelse på tidkrevende stereological tilnærminger som er vanskelige å utføre på grunn av størrelsen og komplekse anatomisk konstitusjon av bukspyttkjertelen. Mest høy oppløsning tilnærminger i dag (vanligvis optisk), ikke gir tilstrekkelig inntrengningsdybde å tillate hele bukspyttkjertelen bildebehandling i gnagere. Omvendt, bildebehandling tilnærminger som ikke er begrenset av deres inntrengningsdybde (vanligvis kjernefysisk) gir til dårlig oppløsning for å løse hele BCM distribusjon og er hemmetav mangel på tilstrekkelige kontrastmidler ^4,5.

Optisk projeksjon tomografi er en 3D imaging modalitet som gir høy oppløsning vurderinger av biomedisinske prøver på mm til cm skala ^6. Herved, kan informasjon om den romlige posisjon og volum av det enkelte insulin uttrykke Langerhanske øyer ekstraheres hele volumet av bukspyttkjertelen i normale og diabetiske mus ^3,7-10. Målet med studien er å ytterligere øke kapasiteten av denne teknikken for vurdering av bukspyttkjertelen β-celler, deres endogene distribusjon, når podet inn andre vev, de utnyttes til andre pancreatic bestanddeler (for eksempel infiltrere celletyper) og i større bukspyttkjertelen forberedelser enn tidligere mulig.

Den nær infrarød optisk projeksjon tomografi (NIR-OPT) setup

I under protokoller, en OPT skanner basert på den opprinnelige oppsettet beskrevet av Sharpe 1 al, tilpasset bildebehandling i nær infrarøde området er beskrevet og brukt. For enkelt kanal vurderinger av musen bukspyttkjertelen (f.eks av BCM), kan SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner brukes.

En metallhalogen lampe som gir høyere eksitasjon energi enn en kvikksølv buelampen på bølgelengder over 650 nm, leverer eksitasjon lys. Lyset overføres gjennom en væske lysføring. En nyttig kombinasjon av fluorokromer og band pass filtre for NIR fluorescens bildebehandling og kanalseparasjon er vist i figur 3. Det avgitte lys detekteres med en tilbake opplyst CCD kamera, med høy Quantum effektiviteten i NIR spekteret. Den OPT skanning er automatisert ved hjelp av en LabView plattform som styrer kameraet og stepper motor. Å støtte prøvene i størrelsen av intakt rotte pancreata, en beskyttet sølv belagt speil og en stor kyvette brukes. Endelig en prøveholderen som eliminerer uønskede loddrette movements av prøven under skanningen ble utformet.

Protocol

1. Prøveopparbeidelse og skanning

1,1 Prøveopparbeidelse

Følgende prosedyre utføres hovedsakelig som beskrevet tidligere ^7.

1. Høste bukspyttkjertelen. Bruk iskald PBS for å unngå proteolytisk nedbrytning.
2. Fix vevet i 4% PFA i PBS på isen for 2-3 timer. Pass på at lobes er "spredt ut" under fiksering. Dette vil lette identifiseringen av anatomiske landemerker etter gjenoppbygging.
3. Vask i overkant PBS i 30 min.
4. Dehydrere bukspyttkjertelen trinnvis i metanol (33, 66%, 100%), 15 min / trinn. Dette minimerer dannelsen av bobler ved bleking (se trinn 5) og hindrer celle ødeleggelse under fryse-tine (se trinn 7).
5. Inkuber vev i nylaget MeOH: H ₂ O _2: DMSO bleking buffer i en 02:01:03 ratio på RT i 24 timer å slukke endogen vev fluorescens. For større prøver, utveksling til ny bleaching buffer og inkuberes i ytterligere 24 timer.
6. Vask i overkant MeOH, ON.
7. Fryse-tine for minst 5 sykluser i -80 ° C - RT å lette antistoff penetrasjon.
8. Rehydratiseres trinnvis tilbake til TBST (33, 66%, 100%), 15 min / trinn.
9. Block i TBST med 10% serum (fortrinnsvis fra samme art som den sekundære antistoffet ble generert), 5% DMSO og 0,01% NAAZ for 12-24 timer ved romtemperatur
10. Inkuber med primære antistoffer i blokkering buffer i 48 timer, på RT, utvide til 72 timer for større prøver (antistoffer som brukes her er listet opp i tabellen av reagenser).
11. Vask i overkant TBST, ON.
12. Inkuber med fluorescensmerket konjugerte sekundære antistoffer i 48 timer, ved RT, utvide til 72 timer for større prøver.
13. Vask i overkant TBST, ON.

1.2

Følgende prosedyre beskriver hvordan du monterer prøven i agarose og fest den til skreddersydde prøveholderen (se Figur 7) Før OPT skanning.

1. Separer spleniske, duodenal og gastrisk lobes ifølge figur 3A i Hörnblad m.fl. ^3. Forholdet mellom flikene er ytterligere klargjort i Hörnblad m.fl. ^11.
2. Forbered 1,5% (w / v) lavtsmeltende temperatur agarose i dH ₂ O, filter, la den avkjøles til 37 ° C og skyll vevet i dH ₂ O for å vaske bort og fjerne vaskemiddel boblene før agarose-innebygging på isen.
3. Skjær ut en agarose blokk omslutter prøven og forlate en ~ 1 cm spacer mellom prøven og undersiden av agarose. Trim skarpe kanter (≤ 90 °) av agarose blokken å redusere lysspredning.
4. Dehydrere prøven trinnvis i MeOH (33, 66%, 100%), gir tid til å ekvilibrere mellom hvert trinn. Når prøven synker det anses å være ekvilibrert.
5. Slett prøven i en 01:02 oppløsning av Benzylalkohol: Benzyl Benzoat (Babb) inntil det blir gjennomsiktig. Utveksling Babb løsning og inkuber i ytterligere 12 timer.
6. Plasser ryddet prøven i prøveholderen og fest den ved å sette to nåler gjennom agarose spacer via hullene i flensene av holderen.
7. Plasser prøven i skanneren og senk den til en kyvette fylt med Babb clearing løsning. Når man sammenligner et serie pancreata samme forstørrelse skal brukes for alle skanninger. Forstørrelsen skal være optimalisert for den største prøven i serien.

1.3 Plassering av prøven på AR

Følgende protokoll beskriver fremgangsmåten for å nettopp plassere en prøve ved hjelp av COM-AR algoritmen. Denne prosedyren gjelder bare når ROI omfatter hele prøven. For detaljerte beskrivelser av algoritmer, se Cheddad et al ^2.

1. Skaffe bilder av prøven i to posisjoner for both anatomi og signal-kanaler. Posisjon ₁ ved 0 ° (assosiert med X-aksen), og viser det største projeksjonsområdet, og posisjon ₂ ved 90 ° (som er knyttet til Z-aksen). Vi bruker GFP kanal for å visualisere anatomien.
2. Påfør forventning-maksimering (EM) algoritme på anatomien bilder til terskel avkastningen.
3. Beregn COM punkter (X-koordinater) av binære bilder oppnådd i trinn 2 for både 0 ° og 90 ° anslag.
4. Overlagre en vertikal linje som passerer gjennom den identifiserte COM punktet beregnet i trinn 3 på 0 ° og 90 ° bilder av signalkanalen.
5. Bruke bildene ervervet i trinn 4 som referanser for å bevege prøven slik at senterlinjen av synsfeltsrapporten passerer gjennom de fundne COM poeng av prøven.

1.4 Skanning

1. Juster eksponering ganger for å oppnå høyest signal til støyforhold mulig uten Saturaterende noen områder av projeksjon bilder. Gjenta for alle kanaler som skal skannes.
2. Velg filter sett for første fluorescens kanal som skal skannes. Utslipp fra kortere λ fluoroforer kan opphisse fluoroforer med lengre λ og dermed føre fotobleking. For å minimere denne muligheten, skanne fluorophore med lengst eksitasjon λ først.
3. Åpne lukkeren å belyse prøven og samle fluorescens signal over 360 °, roterende prøven langs den vertikale aksen for hver kanal. Trinnet vinkel som brukes for NIR-OPT oppsettet er 0,9 ° og for Bioptonics 3001 skanneren 0,45 °.
4. Velg riktig filter for neste kanal og fortsett som over.

2. Databehandling og gjenoppbygging

2.1 Post-oppkjøpet forskyvning deteksjon og korreksjon (A-verdi tuning)

I projeksjon tomografi, er det generelt nødvendigå tilordne en post-justeringsverdi til anslagene til finjustere bildene posisjon langs rotasjonsaksen før rekonstruksjon. Imidlertid kan en liten avvik i vinkelen kameraet mot den optiske aksen forårsake uensartede A-verdier langs lengden av prøven og dermed indusere geometriske forvrengninger. For å unngå slike skjevheter, kan en beregningsorientert metode for å finne nøyaktig og enhetlig etter justeringsverdi (A-verdi) i hele prøven påføres ^to.

1. Bruke en diskret Fourier transform å dele en projeksjon av den spesifikke signal på 0 ° og 180 ° i 8 piksler høyde blokker og beregne skift langs x-aksen (A-verdi) mellom hver blokk.
2. Påfør en lineær minste kvadraters regresjon som hjelper beregne vinkelen θ ', som beskriver helningen på x-aksen-skift langs lengden av prøven, og for å finne en dreiende midtpunkt.
3. Korrigere for forskyvninger under skanning ved å rotere hele projections θ '/ 2 rundt roterende midtpunkt.

2.2 Kontrast begrenset adaptive histogram utjevning (CLAHE)

For å lette gjenkjenning og segmentering av objekter (holmer) stiller meget svake signaler, som er i faresonen for å bli "thresholded ut" under gjenoppbygging og / eller segmentering for kvantitative vurderinger, kan en CLAHE algoritme brukes til projeksjon bildene. Den CLAHE utføres med to store intensitet transformasjoner:

1. Den lokale kontrast er anslått og utlignet innenfor ikke-overlappende blokker i projeksjon bildet.
2. Intensiteten blir deretter normalisert på grenseområdene mellom blokkene gjennom bilinear interpolering.

Navnet kontrast-limited refererer til klippet grensen, som er satt for å unngå metning piksler i bildet. I denne protokollen, MATLAB innebygd funksjon "adapthisteq" ble brukt og brukes med standard c leppe grensen på 0,01 og en flis størrelse av 256. Notat, må den optimale flisstørrelsen skal testes empirisk og kan variere avhengig av prøven analyseres. Flere detaljer om algoritmen og eksempler kan finnes i Hörnblad m.fl. ^3.

NB! Nevnt ovenfor, beregningsorientert prosesstrinn (inkludert COM-AR, A-Value tuning og CLAHE, se 1.3 til 2.2) bygger på standard algoritmer og er utført i MATLAB (Mathworks).

2,3 tomographic gjenoppbygging og iso-overflate rendering

1. Ved hjelp av en filtrert back-projeksjon algoritme, kan de korrigerte og normalisert bilder nå bli rekonstruert med enhetlig forskyvning kompensasjon og minimumskravet for optimalisering av dynamisk rekkevidde. I denne protokollen, er alle rekonstruksjoner utført med filtrert tilbake projeksjon metoden tilgjengelig i NRecon programvare (Skyscan), 1.6.8-versjonen (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Notat, avhenger forstørrelse av et avbildes objekt på sin avstand fra navet linsen mindre parallelt stråle geometri er implementert i bildebehandling oppsettet. Derfor, når et fremspring import datasett til NRecon programvare er det viktig å ta med den riktige objektet til kilden avstand (mm) og dreieretning skanneren (for mot klokkeretningen inngang "CC" og for medurs inngang "CW") i den medfølgende loggfilen, for å unngå cone beam indusert gjenstander under gjenoppbygging.
2. Å visualisere og kvantifisere bunken med virtuelle seksjoner innhentet, generere 3D iso-flater med egnet programvare for bildebehandling som Imaris eller Volocity.

Murine holme isolasjon og transplantasjon prosedyrer ble utført ved Diabetes Research Institute Preklinisk Cell Processing og Translasjonell Model kjernen under protokoller gjennomgått og godkjent av Universitetet i MiamJeg Institutional Animal Care og bruk komité. Den etiske komiteen for dyreforsøk, Nord-Sverige, godkjent alle andre forsøk med dyr.

Representative Results

I dagens rapporten beskriver vi en protokoll for utvinning og behandling av beregningsorientert BCM data i gnager pancreata (og andre vev) bruke NIR-OPT (Figur 1). Som illustrert i figur 2, er vev autofluorescense fra bukspyttkjertelen prøven som forventet markert redusert i NIR spekteret. Dette fører til en betydelig økning i gjennomsnittlig signal til støy (S: N) for vurdering av insulin merket Langerhans øyer. Ved tilpasninger av OPT til bildebehandling i NIR delen av spekteret, som beskrevet heri, kan minst tre bestemte kanaler bli visualisert med tilstrekkelig S: N-forhold for å muliggjøre vurdering av antistoff merket celletyper hele volumet av den murine bukspyttkjertelen med distinkt kanalseparasjon (se Figur 3 og 4). Anvendt til avbildning av diabetogenic prosesser og / eller BCM vurderinger generelt, tillater teknikken således for visualisering og kvantifisering avinsulin positive områder i forhold til omkringliggende og / eller interaksjon celletyper (se figur 4). Slike vurderinger er takket være den økte vev inntrengningsdybden erholdt i NIR mulig område å utføre i mye større prøver enn tidligere, inkludert rotte bukspyttkjertelen, som er 3-5 ganger større enn dens mus motstykke (se Figur 5). Uavhengig av om synlige eller NIR bølgelengder benyttes, kan gjennomføringen av CLAHE signifikant lette OPT evalueringer av BCM under forskjellige genetiske og fysiologiske betingelser ved å øke deteksjonsfølsomheten av teknikken (se Figur 6). En oppskrift for den utviklede prøveholderen er vist i Figur 7.

Figur 1. Flytskjema som viser de kritiske trinnene for OPT baserte analyser av BCM i murine bukspyttkjertelen. Tiden det tar å vurdere en typisk mus bukspyttkjertelen er 13-14 dager. Flertallet av tiden blir konsumert under vev prosessering og immunhistokjemisk farging (10 dager), krever vev clearing ca 2 dager mens lengden av skanning er avhengig av eksponeringstiden kreves (normalt rundt 1 time). Den påfølgende Databehandling typisk utføres innen en dag. Notat, relativt lang farging protokollen ideell for batch prosessering av større mengder prøver.

Figur 2. Signal til støy forhold for BCM vurderinger på ulike bølgelengder. En mus duodenal bukspyttkjertelen lapp, farget for insulin og med en cocktail av fluorokromkonjugerte konjugerte sekundære antistoffer (488 Alexa, 594, 680 og750), ble brukt for å bestemme S: N forholdstall ved forskjellige bølgelengder. A, bildene viser første projeksjon rammen for hver signalkanal. B, Graph illustrerer gjennomsnittlig S: N for hver signalkanal. Forholdstall ble bestemt som gjennomsnittlig holmen intensiteten (basert på 215 holmer) dividert bakgrunnen intensiteten (endogene vev fluorescens fra exocrine vev). C, Diagram som viser S: N forholdstall for de enkelte holmer i hver kanal normalisert til S: N som oppnås for Alexa 594 kanal. En måte ANOVA ble brukt for statistiske analyser. Signifikansnivå indikert tilsvare ** p <0,01. Skala bar i (A) tilsvarer 1 mm. Klikk her for å se større figur .

Figur3. Kanalseparasjon. A, var sekundært antistoff konjugert med Alexafluor fargestoffer oppført i tabellen immobilisert separat på proteinG-Sepharose perler. B ble Fluorescerende perler deretter innebygd på ulike nivåer i en agarose fantom og avbildes med indikerte filtre.

Figur 4. OPT flerkanals bildebehandling i diabetes forskning. A, OPT basert iso-overflate rekonstruksjon av en bukspyttkjertel (12 uker, duodenal lapp) fra Non overvektige diabetes (NOD) modell for type 1 diabetes. Prøven er farget for insulin (holme β-celler, pseudo farget blå), glatt muskulatur α-actin (blodkar, røde) og CD3 (infiltrere T-lymfocytter, grønn). De tilsvarende sekundære antistoffer som ble brukt var; Cy3, IRDye-680 og DyeLight-750 kroner. Deninnfellinger (A'-A'' ') viser de enkelte signalkanaler. B, OPT bilde (blåse opp visning) av en mus lever lapp (lobus skumle lateralis) podet med syngenic holmer og avbildes med NIR-OPT to uker etter transplantasjon. Insulinet uttrykker holmene er pseuodocolored i blått og glatt muskel α-aktin positive fartøy er i rødt. Tilnærmingen gjør vurderinger av holmen pode fordeling innenfor vaskulære nettverket. Scale barer samsvarer til 1 mm.

Figur 5. NIR-OPT forenkler bildebehandling av større prøver. A, Iso-overflate gjengivelse av BCM distribusjon i en rotte bukspyttkjertelen fra Zucker Fatty modell for type 2 diabetes (milten lapp på 9 måneder), eksemplifiserer muligheten til bildet prøven på rotte bukspyttkjertelen skala av NIR-OPT. Som bestemmesved denne teknikk den viste lapp er ~ 6 ganger større (v / v) enn sin mus motstykke og havner 10139 insulin uttrykke øyer Langerhans hvis β-cellevolum utgjør 1,32% av den totale lobular volum. B, tomografisk snitt tilsvarende den stiplede linje i (A) og som illustrerer at holmer fra alle dybder av vev oppdages. C, Iso-overflate gjengivelse av BCM distribusjon i en mus bukspyttkjertelen (milten lapp på 8 uker) vises som en størrelse referanse. Den viste lapp havner 2490 insulin uttrykker holmer som β-celle volum utgjør 0,89% av den totale lobular volum. Den pancreata er farget med GP anti-insulin etterfulgt av Alexa594 konjugert geit anti-GP (mus) og IRDye 680 konjugert Donkey anti-GP (rotte) antistoffer hhv. Prøvene i (AC) er avbildet i målestokk og skalaen bar i (C) tilsvarer 2 mm.

Figur 6. CLAHE forenkler påvisning av holmer i murine bukspyttkjertelen ved OPT bildebehandling. AC, Representative iso-overflate gjengitt OPT bilder av en C57BL / 6 mus bukspyttkjertelen (milten lapp på 8 uker) merket for insulin. Iso-overflate rekonstruksjoner av OPT bildene ble utført før (A, pseudo farget grønn) og etter CLAHE protokollen ble brukt (B, pseudo farget rød). C, Overlay av de ikke-normaliserte data i (A) og de CLAHE bearbeidede data i (b). C'-C ", representant høy forstørrelse overlegg av de ikke-normaliserte (A) og CLAHE bearbeidet (B) bilder. Som vist ved nærvær av" red-only "holmer, letter CLAHE skriptet påvisning av små og lavt signal intensitet holmer. I dagens eksempel avbildet prøven (etter CLAHE prosessering) næret 2419 holmer med et volum på 1,74 mm ³ (Tall basert på de tilsvarende ubearbeidede projeksjon data var 1057 holmer with et volum på 1,77 mm ^3). D og E, Eksempel data fra kontroll (D) og ob / ob mus modell for type 2 diabetes ¹² (E) i 6 måneder iverksetter CLAHE protokollen. Legg merke til den massive generell økning i holme størrelse i ob / ob bukspyttkjertelen (E). I (D) og (E) i bukspyttkjertelen omriss (grå) er basert på signalet fra vev autofluorescens. Målestokk i C er 500 mikrometer i AC. Målestokk i C "tilsvarer 200 mikrometer i C 'og C''. Skalalinje i E svarer til 1 mm i (D) og (E). Bilder i (AC) er tilpasset fra Hörnblad m.fl. ³ og ble generert ved hjelp av Bioptonics 3001 skanner.

Figur 7. Prøveholderen for festing av OPT prøver. Prøven sikret ved å sette nåler gjennom agarose spacer via forborede hullene i flensene. Holderen er hengslet til stepper motor via ensterk magnet som ligger i basen. Dette oppsettet utelater bruken av ustabile lim og hindrer uønskede bevegelser av prøven under skanning.

Discussion

De beskrevne teknikker for OPT avbildning muliggjør utvinning av romlige og kvantitative parametere hele volumet av den murine bukspyttkjertelen. På grunn av begrensninger i oppnåelig oppløsning for denne type mesoskopisk avbildning det bør bemerkes at, som for de fleste imaging modaliteter, jo større prøven jo lavere oppløsning (Selv om bruken av en høyere oppløsning CCD bør øke oppløsningen til OPT skanning) . Derfor, for vurdering av intakte bukspyttkjertelen mus lobes, gjør teknikken i dag ikke gi enkelt celle oppløsning selv om nær (ca. 15-20 mikrometer) ^7. Likevel, for utvinning av BCM distribusjon i musen bukspyttkjertelen protokollene har gitt data som mer enn godt matche de oppnådd ved f.eks punkt telle morfometri ^3,13 Det bør bemerkes at selv om gjennomføringen av CLAHE protokollen åpner for påvisning av signifikant flere holmer , disse holmer er generelt mindre og ikke bidragte vesentlig til den totale β-celle volum.

De immunhistokjemiske protokoller som er involvert er relativt lang (opptil to uker), men de faktiske hendene på tid for prøven forberedelse er kort og derfor teknikken er godt egnet for studiet av store årskull av dyr ^9. Dersom potensialet for heterogent fordelingsmønstre er et fokus for etterforskningen, bør det understrekes at forsiktighet bør utvises i trinnene om fiksering og montering for å unngå at bukspyttkjertelen vev blir løst i en ugunstig måte, og en flat ("spredt ut" ) mount av vevet bør tilstrebes å legge til rette slike vurderinger.

En viktig sak når du utfører OPT er at prøven er COM er satt til rotasjonsaksen og at det ikke beveger seg, enten vertikalt eller horisontalt, under skanning prosedyren. Derfor er det viktig å ha en stabil mekanisk oppsett og et velfungerende system for attaching prøven. Vi løste dette problemet ved å bygge en ny mount (figur 7).

Parallell geometri var ikke sant for vår NIR-OPT eller Bioptonics 3001 skanner, som ble oppdaget som en vertikal forskyvning mellom foran og bak posisjoner perifere objekter i projeksjonsknappene bilder som er tatt. Ved å justere objektet til kilden avstand i loggfilen for den aktuelle skanneren (se 2.3.1) kan vi forbedre kvaliteten på våre data og korrigere for geometriske forvrengninger På langt kanter av projeksjon bilder, som er av spesiell betydning når vurdere større prøver.

I den gjeldende protokollen, gir vi et forslag av filter sett som tillater visualisering av tre ulike spesifikke kanaler og en "anatomi" kanal i vurderinger av intakte bukspyttkjertelen forberedelser. Tydeligvis disse innstillingene kan være modulert å tilpasses fluorokromer benyttes for en gitt studie men som med alle former for fluorescerendeprosent mikroskopi, bør den potensielle faren for signal blø-through vurderes nøye. Studiet av insulin merket holmer med fluorokromer som er glade over 750 nm har ennå ikke vært mulig av oss med metallhalogen lampe som vår satt opp benytter. Det er mulig at et kamera med enda høyere Quantum effektiviteten i de relevante bølgelengder i kombinasjon med alternative lyskilder (f.eks diode lasere) kan øke potensialet for NIR-OPT videre og gi rom for bildebehandling på enda høyere bølgelengder.

OPT imaging er en svært allsidig teknikk for romlige og kvantitative vurderinger av biomedisinsk prøven på mm-cm skala. Selv om protokoller som presenteres her er utviklet for hovedformålet med bukspyttkjertelen / diabetes forskning de bør være mulig å oversette til forskning på andre arter, prøvetypene og markører. Av potensialet til å visualisere flere forskjellige kanaler i intakte pancreatic preparater, NIR-OPT avbildning further har potensial som et verktøy for å evaluere opptaket spesifisitet av kontrastmidler beregnet for ikke-invasive vurderinger av andre bildediagnostikk, så lenge disse kontrastmidler kan være utformet for å bære også en fluorofor påvises ved OPT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Scharlau	ME03162500
30% H2O2	Scharlau	HI01362500
Benzyl Alcohol	Scharlau	AL01611000
Benzyl Benzoate	Scharlau	BE01851000
Low-meltingpoint agarose	LONZA	50100
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787
Mouse anti-aSMA-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	Primary antibody
Rabbit anti-CD3	Sigma-Aldrich	C7930	Primary antibody
Guinea Pig anti-Ins	DAKO	A0564	Primary antibody
Donkey anti GP-IRDye680	LI-COR Biosciences	926-32421	Secondary antibody
Goat anti Rb-DyeLight750	Thermo Scientific	35570	Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594	Molecular Probes	A-11076	Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa488	Molecular Probes	A-11008	Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594	Molecular Probes	A-11012	Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa680	Molecular Probes	A-21076	Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa750	Molecular Probes	A-21039	Secondary antibody
OPT Skyscan 3001	Bioptonics		OPT-Scanner
Leica MZ FLIII	Leica Microsystems		Stereomicroscope
Leica Objective 0.5x	Leica Microsystems	10446157
Leica Camera adapter 1.0x	Leica Microsystems	10445930
EL6000 Metal Halide		11504115	Lightsource
Liquid Light Guide		11504116
Cuvette	Hellma Analytics	6030-OG	55 x 55 x 52.5 mm
Mirror	Edmund Optics	F68-334	50 x 50 mm
Andor Ikon-M	Andor Technology	DU934N-BV	Back-illuminated CCD
Filterset	Chroma Technology	41021-MZFLIII	TXR, Alexa-594, Cy3
Filterset	Chroma Technology	41022-MZFLIII	IRDye680, Alexa-680
Filterset	Chroma Technology	49037-MZFLIII	Dylight750, Alexa-750
ProteinG-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0618-01	Protein G Sepharose 4 Fast Flow
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591	Sodium azide 0.1 M solution