Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Telomerlængde og telomerase-aktivitet, A Yin og Yang celleældning

doi: 10.3791/50246 Published: May 22, 2013

Summary

En nøjagtig, korte, sofistikeret og billig metode er beskrevet, der vurderer telomer længde i flere væv og arter ved hjælp qRT-PCR. Derudover vil vi beskrive en enkel assay at vurdere telomerase-aktivitet som en supplerende rygrad test for telomer længde.

Abstract

Telomerer gentager DNA-sekvenser på spidsen ender af kromosomer, der er forskellige i længden og i mennesker kan nå en længde på 15.000 basepar. Telomer tjener som en biobeskyttende mekanisme af kromosom nedslidning ved hver celledeling. På en vis længde, bliver telomerer for kort til at tillade replikation, en proces, der kan føre til kromosom ustabilitet eller celledød. Telomerlængde reguleres af to modsatrettede mekanismer: nedslidning og forlængelse. Nedslidning optræder som hver celle deler. I modsætning hertil er forlængelse delvis moduleret af enzymet telomerase, som tilføjer gentagne sekvenser til enderne af kromosomer. På denne måde kunne telomerase muligvis vende en aldrende mekanisme og forynger celle levedygtighed. Det er afgørende elementer i at opretholde celle liv og anvendes til at vurdere cellulær aldring. I dette manuskript vil vi beskrive en præcis, kort, sofistikeret og billig metode til at vurdere telomer længde i multiple vævs og arter. Denne metode drager fordel af to hovedelementer, tandemgentagelsesregionen af ​​telomer sekvens og følsomheden af ​​QRT-PCR til påvisning af differentierede kopiantal af testede prøver. Derudover vil vi beskrive en enkel assay at vurdere telomerase-aktivitet som en supplerende rygrad test for telomer længde.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Telomerer gentager DNA hexamersekvenser (TTAGGG) sekvenser fundet i enderne af kromosomer. I hver celle replikation, er disse kromosom ender forkortes. Hvis de bliver for kort, kan kromosomer undergå telomer ende fusioner, afvigende rekombination, og nedbrydning. Derfor tilstrækkeligt telomer længde vedligeholdelse spiller en stor rolle i kromosom stabilitet og cellebeskyttelse 38.. Telomerlængde vedligeholdelse er også afgørende for gener, der findes nær enderne af kromosomer, da DNA-replikation ikke kan fortsætte til den bitre ende af kromosomerne 1-2. Derfor kan forebyggelse af telomer afkortning forbedre celle stabilitet.

Talrige undersøgelser har rapporteret, at telomer længde er korreleret med en organismes levetid og sygdomstilstand, såsom cancer 3-4, diabetes 5, og hjertekarsygdomme 6,7. Derudover har forkortede telomerer blevet forbundet med overdreven stress eller enusund livsstil 8, måske ved at fremme tidlig celle aldring og død 9.. På den anden side har nogle undersøgelser vist, at der ikke er signifikant forskel mellem telomer længde og levealder og aldersrelaterede sygdomme 39, 40, 41.

En af cellens medfødte mekanismer for beskyttelse fra telomer afkortning er ved at aktivere sin egen enzym telomerase revers transkriptase (TERT). Dette enzym og dets underenhed, telomerase RNA (TERC), en ikke-kodende RNA, bruge telomer som en skabelon til at tilføje telomer gentagelser til kromosom ender 10. Selvom telomerase-aktivitet er fraværende fra flere typer af celler og andre mekanismer er involveret i telomerlængde vedligeholdelse, er øget telomerase-aktivitet korreleret med øget telomer længde. Telomerase aktivering, er blevet etableret som en af ​​de mekanismer, som cellerne reagerer på skader og stress og undgå for tidlig ældning og død. For eksempel, te længerelomeres blev påvist i en population af Ashkenazi jøder med exceptionel levetid 11, har mutationer i TERC eller TERT vist sig at bidrage til dødelig sygdom 12, og epigenetisk regulering af telomerase har vist sig at have en virkning på aldersrelaterede sygdomme 13.. Siden opdagelsen har telomerlængde blevet foreslået som en biomarkør for sundhedstilstanden i forskellige dyremodeller samt hos mennesker, men disse tidlige undersøgelser var vanskelige at bredt replikere fordi den anvendte metode var kedelig, lang og dyr. I 2002 og yderligere tunet i 2009, foreslog cawthon og viste en ny, præcis, hurtig og enkel PCR-protokol til at vurdere telomerlængde og yderligere at undersøge sin rolle i forskellige aspekter af cellebiologi, aldring og sygdom 19..

At vælge den rigtige telomer målemetode for en undersøgelse er afgørende. I øjeblikket er der forskellige metoder, der anvendes til at måle telomer længde, hver med sin egenfordele og ulemper. Traditionelt er telomer længde måles ved hjælp af Southern blot-analyse af terminale restriktionsfragmenter (TRFs), som omfatter: en. fordøjelse af DNA'et med restriktionsenzymer, der ikke skåret i telomer gentagelser for at opnå TRFs, b.. Southern Blot af disse TRFs sker ved at bestemme den gennemsnitlige TRF længde ved hjælp af en telomeriske sonde 14., 37.. Selv om denne metode er meget præcis med en lille variationskoefficient, er et direkte mål, og kan være fordelagtige til at måle længden fordeling, TRF analyse er kostbar, arbejdskrævende og kræver mindst 3 ug DNA. Denne metode er også ufølsom over for korte telomerer og længde bestemmelse kan forveksles med subtelomeric DNA, som kan detekteres af føleren på grund af (TTAGGG) n lignende sekvenser, de indeholder 15, 42,.

En anden meget præcis metode til måling telomerlængde er Single Telomere Forlængelse Længde Analysis (STELA), et single molekyle PCR-metode, der kun kræver en lille mængde DNA. I denne metode, er primere til genkende G-rige overhæng ved slutningen af ​​kromosomer og til at binde til en unik subtelomeric sekvens på et kromosom, der forstærker telomer af en specifik kromosom. Den resulterende forstærkning er derefter visualiseret ved Southern Blot. Denne metode har den fordel af at være meget præcis og er i stand til at detektere korte outlier telomerer 16. Desværre, da ikke alle kromosomer har G-rige ender og en brugbar subtelomeric sekvens kan telomerlængde kun måles på specifikke kromosomer og disse målinger kan ikke repræsentere længden af alle telomerer i cellen 15..

En anden metode, der har været praktiseret, er brugen af ​​peptid nukleinsyre (PNA)-prober til påvisning af telomer længde. Kvantitative Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) giver os mulighed for at visualisere telomerer under metafase, hvor staining af telomerer med en PNA-probe i forhold til deres størrelse tillader sammenligning af telomerer mellem specifikke kromosomer. Selv om denne metode kan også anvendes til celler i interfase, her telomer længde til forskellige kromosomer kan ikke påvises, hvilket indfører en begrænsning ved måling telomer længde i ældede eller sjældent delende celler 17. Flow FISK stedet bruger flowcytometri og er i øjeblikket den mest følsom metode til måling af telomer længde af blodceller i kliniske omgivelser, men kræver højt kvalificerede teknikere 18..

I øjeblikket er den standardmetode til måling af gennemsnitlig telomer længde i vores laboratorium drager fordel af præcision, følsomhed og nem kvantitativ real-time PCR. Denne metode blev gjort muligt for måling telomer længde ved udvikling af nye primere, der undgår syntesen af ​​primer-dimer-afledte produkter, som ellers ville være blevet produceret i somtandard assay på grund af den gentagne karakter af telomerer. Til dette assay, er målingen af ​​telomer længde repræsenteret ved T / S forhold, telomer repeat kopitallet til enkelt-kopigen nummer. Da der er en direkte proportionelt forhold mellem telomer længde og antallet af mærkede telomer primere binder til DNA i begyndelsen stadier af PCR, T / S-forholdet er direkte proportional med telomer længde. T / S forhold måles ved at sammenligne forskellen i Ct, fraktioneret cyklus nummer hvor prøven akkumulerede fluorescens krydser en tærskelværdi, der er flere standardafvigelser over baseline fluorescens, mellem prøverne med telomer primere og SCG primere 19.. Denne metode er blevet kritiseret for sin indirekte måling af telomer længde, hvilket kan føre til unøjagtige målinger, for eksempel i tilfælde af kromosom overlapninger eller kopital variationer 15. Også sammenligning mellem undersøgelser er ofte difficult, men standard oligomerer er blevet udviklet til at måle absolut telomer længde 20. Denne metode blev fremmet forbedret ved cawthon, ved hjælp af en monokrom multiplex qPCR assay. I dette assay blev PCR kørt ved lavere temperaturer i de første par cyklusser for at undgå primer-dimer bindende og telomer og kontrol-genet blev analyseret i den samme PCR-rør til yderligere at undgå fejl. De resulterende telomer længde målinger stærkt korreleret med telomer længde målt ved Southern blot-analyse af TRFs og havde højere nøjagtighed 15, 19, 36. I øjeblikket er QRT-PCR er den eneste praktisk metode til rådighed for afprøvning store prøvestørrelser og kræver kun en lille mængde af DNA til at udføre. En afgørende del af denne metode er omfattende kvalitetskontrol, så når det er gjort ordentligt, kan denne metode give værdifulde sammenlignelige oplysninger om telomerlængde. Derudover var denne metode blevet tilpasset til brug over leukocytter til målingtelomer længde i en række forskellige væv 42.

Derudover, for yderligere at forstå biologien bag telomer længde vedligeholdelse og interaktioner mellem de to modsatrettede virkninger (dvs. telomer afkortning under replikation og forlængelse af telomerase enzymet), ledsaget vi telomer længde metoden med et ekstra forsøg, der måler telomeraseaktivitet.

Til dette formål anvendte vi en telomeriske Gentag Amplifikationsprotokol, et in vitro-assay. Kort fortalt lyseret, konserveret, enzymatisk aktive celler syntetiseret telomere gentagelser på et oligonukleotid underlaget med telomerase, og produkterne blev amplificeret under anvendelse af PCR i nærværelse af SYBR Green. Resultaterne blev derefter analyseret ved at sammenligne prøve og kontrol-Ct-tærskelværdier. Da telomerase er et varmefølsomt enzym, en yderligere varmebehandlet kontrol køres sideløbende hver prøve 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Telomerlængde Protokol 19

  1. DNA-isolering

De fleste DNA-isolering metoder kan anvendes. Vores Lab foretrækker Qiagen DNeasy Kit (# 69.506) for blod kilder. Afhængigt af kilden til DNA, såsom buccale eller andre kilder, kan en anden isolation metode.

  1. Primere:

Alle primere er fortyndet til en stamkoncentration på 100pmoles/μl i PCR-kvalitet vand og opbevaret ved -20 ° C, indtil der. Working lagre af primere er lavet frisk og opbevares ved 20 ° C i en kort periode (et par måneder.) Standard primere blev anvendt til telomerer og β-globin, SCG, som beskrevet i O'Callaghan et al. 20. .

Primersekvenser:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Bemærk: Primere fortyndes til en fungerende koncentration af 10pmoles/μl, før tilsætning til reaktionsblandingen.

  1. Seriefortynding af genomisk DNA:

Serielle fortyndinger af genomisk DNA for Telo og Single Copy Gene (SCG) er skabt til at generere en standard Ct-værdi kurve for assayet. Det genomiske anvendte DNA blev ekstraheret fra lymfocytter fra blodprøver. Disse fortyndinger er skabt ved at fortynde DNA med PCR-kvalitet H 2 0 til hver koncentration ved en faktor på 1,68 til opnåelse af de to sæt seriefortyndinger anvender samme genomisk DNA. De startende koncentrationer er optimeret baseret på trial and error, og skal muligvis justeres, når du bruger forskellige reagenser, instrumenter, DNA fra andre arter, celletyper og SCG brugt.

Bemærk: Seriel fortynding ved genomisk DNA fremstilles ved at blande forsigtigt og venter på mindst 15 minutter til en time before at tage DNA for den næste fortynding. Hver fortynding kræver tid for genomisk DNA til at dissociere. Til langtidsopbevaring, alikvote seriefortyndinger til PCR strips til opbevaring ved -80 ° C. Hver PCR strimmel optøs og anvendes en gang for at undgå fryse tø der kan beskadige DNA.

  1. Reaktion setup for RT-PCR

Anvendte instrument: Roche480 Light Cycler

Reagens: Roche Light variator SYBR-green

Fortynd test DNA-prøver til en endelig koncentration på 10 ng / ul. Vi tester koncentration hjælp NanoDrop eller Qubit. Vi yderligere fortynde DNA fra 10ng/μl til den endelige 5ng/μl. Vi tester ikke koncentrationen igen.

Reaktionskomponenter:

TELO 1x SCG 1x
H 2 0 </ Td> 6 pi H20 6 pi
Telo 1 0,2 gl SCG 1 0,6 gl
Telo 2 1,8 gl SCG 2 1.4 pi
Rxn mix 10 ul Rxn mix 10 ul
DNA eller seriel fortynding 2 pi DNA eller seriel fortynding 2 pi

Bemærk: Master Mix er lavet uden DNA og med et overskud på 5% til 10%.

Både Telo og SCG køres sammen på den samme plade ved hjælp af følgende program. For at teste for præcision, mindst tre gentagelser af hver prøve og kontrol skal køres. Variationer i de anvendte primere kan påvirke resultaterne. Vores protokol er blevet optimeret til at arbejde som følger på Roche480 Light Cycler og vores primere.

Iførste omgang blot denaturere
10 min denaturere 95 ° C
Cykling
95 ° C 10 sek hold
60 ° C 5 sek hold
72 ° C 11 sek hold og single erhvervelse
Gentag 45-55 gange som nødvendigt

2.. Kvantitative Telomerase Detection (QTD) Protokol (Baseret på QTD Kit fra Allied Biotech, Inc. kat. Nr. MT3012)

Uddrag Forberedelse

  1. Pellet celler eller væv.
  2. Vask en gang med 1x PBS.
  3. Repellet og fjerne 1x PBS. *
  4. Resuspender cellepelleten i 200 pi 1 x lysisbuffer for hver 10 5 -10 6 celler eller 40-100 mg af væv.
  5. Inkuber på is i 30 min.
  6. Spin ned prøven ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
  7. Overfør 160 ul af supernatanten i et frisk rør og bestemme proteinkoncentration.
  8. Alikvot og quick-fryse resterende ekstrakt på tøris / ethanol, opbevares ved -80 ° C.

* I thans tilstand, telomerase i frosne celler eller væv er stabil i mindst et år. Når optøet til brug, cellerne straks i 1 x lysisbuffer.

2.1. Assay Controls

Varmeinaktivering kontrol: For hver prøve, behandle en ekstra kontrol ekstrakt ved inkubering ved 85 ° C i 10 minutter før telomeraseaktivitet assay varme.

Standardkurve for TSR kontrol-template: Udfør kvantitativ real-time PCR under anvendelse af fortyndinger af TSR, et oligonukleotid med en lignende sekvens til telomer primere følger med kittet for at generere en standardkurve.

  1. Forbered 01:05 serielle fortyndinger af bestanden TSR koncentration (0,5 amoles / ul) med Lysis Buffer
  2. Udfør telomerase afsløring standard under anvendelse 1 ml af hver TSR fortynding, herunder stamkoncentration. Disse fortyndinger kan opbevares ved 4 ° C i mindst 2 uger.

2.2. Telomerase Activity Assayhjælp QTD Real-Time PCR

  1. For hver prøve, skal du tilføje følgende i et PCR-rør eller tyndvæggede PCR plade (samlet volumen 25,0 ul):
    • 12,5 pi 2 x QTD Premix
    • 1,0 pi celle eller vævsekstrakt
    • 11,5 pi PCR kvalificeret Vand
  2. Bland grundigt
  3. Program real-time PCR Detection Systems i henhold til nedenstående program:
    - 25 ° C i 20 minutter (telomerase reaktion)
    - 95 ° C i 10 min (PCR første aktivering trin)
    35-40 cykler af:
    - 95 ° C i 30 sekunder (denaturering)
    - 60 ° C i 30 sek (annealing)
    - 72 ° C i 30 sek (udvidelse)
  4. Anbring PCR rør på den termiske cykler og påbegynde cyklussen programmet.
  5. Saml tærsklen cyklus eller C T værdi efter cyklusser finish. Den tærskel cyklus er den cyklus, ved hvilken en statistisk signifikant stigning i ΔRn der først registreres.

2.3. Dataanalyse

  1. Generereea standardkurve ved hjælp af C T aflæsninger og sammenligne telomerase-aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et eksempel på en telomer længde QRT-PCR analyse er vist i figur 1.. Øverst til venstre panel, repræsenterer prøverne mærket i rødt og grønt placeringen af ​​de testede emner på 96-brønds plade. Øverst til højre panel, er forstærkning kurve demonstreret. Hvert individ testes ved to assays (Telomer og Single Copy Gene), hvilket sker i triplikater. På grund af forskellige DNA-kopier fremstillet i de to analyser af udvalgte personer, antallet af cykler indtil fluorescens detektion når sin eksponentielle kurve varierer mellem assays. I højere kopital rør (dvs. Telomer assay), mængden af fluorescens detektion når sin eksponentielle kurve efter 27 cyklusser. Det andet sæt linjer repræsenterer Single Copy Gene (SCG), der kun har én kopi i genomet, og derfor har meget mindre kopier end telomer prøver og når sit eksponentialkurve først efter 31 cyklusser. De brune linier repræsenterer standardkurve, der er baseret på en seriel fortynding af kendte prøvernes koncentrationer. Den nederste højre panel repræsenterer logaritmen til koncentrationen af ​​standardkurven punkter (en lige linie viser en optimal seriefortynding). Denne lineære kurve bliver brugt til at beregne koncentrationen af ​​de testede rør (nederste venstre panel). De qRT-PCR resultater, først i cawthon hænder 19 og gentaget af os og andre, har vist sig at være korreleret med dem, der opnås af terminalen restriktionsfragmentlængde assay. Et T / S forhold enhed (QRT-PCR cyklusser af telomer sigt i QRT-PCR cyklusser af SCG løb) svarer til en gennemsnitlig telomer længde af 4,270 bp leukocytter 42. Dividere de QRT-PCR-cycler for Telomer assay af SCG-assayet i vores eksempel resulterede i et forhold på 0,87, hvilket svarer til et gennemsnit på 3.715 bp. Denne måling består af telomer længde alene og omfatter ikke subtelomeric regioner.

Den qRT-PCR demonstreret her involveret meget lidt prøveforberedelse. I dette eksempel (figur 1), blev der kvalitative såvel som kvantitative forskelle (repræsenteret ved seriefortynding og overensstemmelse mellem de tre eksemplarer), observeret mellem de to analyser. Resultaterne beregnes ud fra denne test viser mellemliggende telomer længde for en 65-årig emne.

Et eksempel på telomerase-aktivitet analyseresultater og den mulige sammenhæng mellem telomerase-aktivitet og telomer længde påvises ved figur 2.. Vores foreløbige resultater viser, at en længere telomer længde kan være forbundet med øget telomeraseaktivitet.

Figur 1
Figur 1.. Figur 1 repræsenterer den typiske output fra aqRT-PCR assay for Telomer længde. Øverste venstre hjørne viser prøverne anbragt i en 96-brønds plade i tre eksemplarer. Nederste venstre hjørne viser de beregnede koncentrationer og Ct-værdier for hver prøve, der anvendes til at beregne T / S-værdier. Den øverste højre er en graf over forstærkning kurven (antal cyklusser versus fluorescens påvist fra CYBR grøn), der anvendes til at visualisere resultaterne. Nederst til højre er standardkurven for Log koncentration versus CT værdien af ​​den serielle fortynding kontrol tegnes. En lige linje bekræfter, at fortyndingen nøjagtigt blev målt og indlæst. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Brug foreløbige resultater fra qRT-PCR assay for telomerase aktivitet og telomerase længde <strong> Figur 2 viser en direkte, signifikant sammenhæng (p = 0,008) mellem telomer længde, målt ved T / S forhold, og telomerase-aktivitet, målt ved Ct-værdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Telomer længde giver en unik cellulær markør for at studere den stressede og aldrende celle og giver indsigt i mekanismerne af aldring. Siden sin rolle i aldring først var blevet foreslået, har et væld af undersøgelser er blevet udført vedrørende telomerlængde alder, levetid, aldersrelaterede sygdomme, kræft og stress. I årtier var guldstandarden telomerlængde målinger terminal restriktionsfragmentanalyse hjælp Southern hybridisering. Men for nylig en overkommelig, hurtig og let at udføre metode cawthon har udviklet sig. Brug kvantitativ real-time PCR, cawthon tilbudt et nyttigt alternativ til at måle telomerlængde, foretage undersøgelser for store stikprøvestørrelser muligt.

Brug QRT-PCR, har mange undersøgelser blevet udført for at undersøge forholdet mellem telomer længde og en lang række forskellige resultater, især aldersrelaterede sygdomme. Mere specifikt har denne metode tillod forskerne at udføre store epidemiologiske studør på befolkningen, der viser eller nægte en korrelation mellem telomer længde og en lang række sygdomme. For at nævne et par stykker, iskæmisk hjertesygdom 7, Alzheimers sygdom 22 osteocarcoma hos kvinder 23, lungekræft blandt rygere 24, familiær kræft i skjoldbruskkirtlen 25 har diabetes 5, blodtryk 26, aldring 27 og demens 28 blevet korreleret med kortere telomerlængde , mens aldersrelateret makuladegeneration 7, kolorektal cancer 43 og død fra infektionssygdomme, cancer, hjerte-eller cerebrovaskulær sygdom 44 har vist sig at have nogen signifikant sammenhæng med telomer længde. Derudover har visse spændinger blevet vist at falde sammen med kortere telomer længde, for eksempel en øget mængde af inflammatoriske markører, TNF-α og IL-6, er blevet korreleret med kortere telomer længder i leukocytter 29. Også stressende lifestyles grund tidskrævende arbejde tidsplaner, skifteholdsarbejde, eller karakteren af ​​det arbejde, især en vicevært position for en kronisk sygt barn, har været forbundet med forskelle i telomerlængde. Dette tyder på, at stress kan forårsage for tidlig ældning ved hjælp af telomer afkortning uden tilstrækkelig genopretning 30, 31. I en nylig undersøgelse, er at have færre sociale relationer også forbundet med kortere telomerer 32. Forebyggelse af telomerlængde afkortning har også vist sig at korrelere med sunde livsvalg, såsom at tage en daglig multivitamin og ikke ryge 24, 33. Derudover disse undersøgelser viste mulige kliniske anvendelser for måling telomerer, for eksempel som en non-invasiv screening test for mulig udvikling af skrumpelever 34.. I andre tilfælde, lignende undersøgelser, hvor har ikke vist nogen signifikant sammenhæng (eller en beskeden korrelation) mellem en sygdom og telomerlængde har forskerne blevet tilskyndet til at study andre nye mekanismer til cellulær tilbagegang og den syge tilstand 7.

Disse undersøgelser har styrke i antal og har demonstreret nytten af ​​at måle telomerlængde som et af de første skridt i at decifrere aldringsprocessen. Cawthon s QRT-PCR-metode var anvendelige til dette formål, fordi det kan sammenligne et stort antal mennesker, kræver minimal DNA, og kan give pålidelig dokumentation til et forhold mellem telomer længde og celle sundhed. Disse undersøgelser bidrager til at styre den fremtidige aldring forskningsindsatsen til visse gener, væv og cellulære processer.

Uundgåeligt, efter en betydelig forskel i telomerlængde bemærkes, er en forklaring forespørges. Til svar på disse spørgsmål, undersøgelser af telomerase har enzymet involveret i telomer vedligeholdelse og dens regulering, blevet etableret. PCR telomerase-aktivitet protokoller er blevet tilbudt, hvilket giver yderligere oplysninger i retning af: a. fastlæggelse af contributions af nedbrydningen af ​​telomerer, og b.. svigt af en vellykket telomerlængde vedligeholdelse af telomerase, hvilket giver endnu et kapitel til historien om aldring som en helhed, især celleældning.

Selvom qRT-PCR detekterer gennemsnitlige telomer længde, og ikke på et individuelt kromosom basis, denne metode er et kraftfuldt værktøj til bevismateriale over hvordan cellen reagerer på aldring og stress og giver en præambel til historien om, hvordan vi ældes. Interessant nok har denne information allerede ført til telomerlængde måling i klinikken til at anslå biologiske alder, og vil fremme vores forståelse af aldringsprocessen og uundgåeligt føre til forebyggelse eller forsinkelse og screening af aldring og aldersrelaterede sygdomme.

Navn på reagenset Company Katalognummer
Kvantitative Telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69.506
LightCycler 480 SYBR Green I Mester, Klar-til-brug hot start reaktion mix for SYBR Green I-baseret real-time PCR ved hjælp af LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantitative Telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350, (6319), 569-573 (1991).
  2. Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92, (4), 321-326 (2010).
  3. Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
  4. Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
  5. Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365, (1-2), 343-350 (2012).
  6. Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6, (5), 639-647 (2007).
  7. Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, (3), 822-829 (2011).
  8. Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7, (5), e38374 (2012).
  9. Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. In Press (2012).
  10. Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315, (5820), 1850-1853 (2007).
  11. Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
  12. Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5, (9), e13048 (2010).
  13. Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3, (2), 164-170 (2012).
  14. Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5, (9), 1596-1607 (2010).
  15. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730, (1-2), 59-67 (2012).
  16. Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33, (2), 203-207 (2003).
  17. O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
  18. Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47, (2), 89-99 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30, (10), e47 (2002).
  20. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13, (1), 3 (2011).
  21. Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17, (1), 1-15 (1995).
  22. Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47, (2), 160-163 (2012).
  23. Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2, (1), (2011).
  24. Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73, (2), 133-137 (2011).
  25. Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, (10), 3950-3957 (2008).
  26. Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14, (2), 124-132 (2012).
  27. Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61, (8), 871-873 (2006).
  28. Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32, (11), 1055-1060 (2011).
  29. O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6, (5), e19687 (2011).
  30. Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68, (8), 582-589 (2011).
  31. Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101, (49), 17312-17315 (2004).
  32. Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. In Press (2012).
  33. Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89, (6), 1857-1863 (2009).
  34. Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. In Press (2012).
  35. Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. In Press (2012).
  36. Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
  37. Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610, (3), 245-261 (2010).
  38. Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3, (8-9), 979-998 (2004).
  39. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8, (8), 860-864 (2009).
  40. Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A, (8), 792-799 (2010).
  41. Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
  42. Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, (8), 809-812 (2008).
  43. Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18, (8), 2280-2282 (2009).
  44. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A, (8), 860-864 (2009).
Telomerlængde og telomerase-aktivitet, A Yin og Yang celleældning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence. J. Vis. Exp. (75), e50246, doi:10.3791/50246 (2013).More

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence. J. Vis. Exp. (75), e50246, doi:10.3791/50246 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter