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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

का उपयोग करते हुए निगरानी वृक्ष के समान सेल प्रवासन Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2, 1,2, 1,2
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

एमआरआई का उपयोग कोशिकाओं की ट्रैकिंग पिछले कुछ वर्षों में उल्लेखनीय ध्यान प्राप्त किया है. इस प्रोटोकॉल फ्लोरीन के साथ वृक्ष के समान कोशिकाओं की लेबलिंग का वर्णन (

Abstract

ऐसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के रूप में noninvasive इमेजिंग तौर तरीकों में निरंतर प्रगति बहुत जीवित जीवों में शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए हमारी क्षमता में सुधार हुआ है. एमआरआई भी vivo में प्रतिरोपित कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो रही है. एमआर विश्राम के समय को प्रभावित करने वाले एजेंटों के विपरीत एमआरआई किए गए प्रयोग के लिए प्रारंभिक सेल लेबलिंग रणनीतियों (T1, टी 2, टी 2 *) और लेबल की कोशिकाओं मौजूद हैं, जहां संकेत की एक वृद्धि (T1) या कमी (टी 2 *) के लिए नेतृत्व. टी 2 ऐसे ultrasmall लौह ऑक्साइड एजेंट (USPIO) के रूप में * वृद्धि एजेंट सेल प्रवास और कुछ भी नैदानिक ​​आवेदन के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है. टी 2 * एजेंटों की एक खामी ऐसे रक्त के थक्के, सूक्ष्म खून या हवा के बुलबुले के रूप में अन्य कलाकृतियों से लेबल कोशिकाओं के द्वारा बनाई संकेत विलुप्त होने का भेद करने में कठिनाई है. इस अनुच्छेद में, हम इन विवो में ट्रैकिंग कोशिकाओं के लिए एक उभरती हुई तकनीक का वर्णन है किफ्लोरीन (19 एफ) युक्त कणों के साथ कोशिकाओं लेबलिंग पर आधारित है. इन कणों perfluorocarbon (पीएफसी) यौगिकों पायसीकारी और फिर बाद में एमआरआई 19 एफ ने उतारी जा सकती है जो लेबल कोशिकाओं, के लिए इस्तेमाल के लिए तैयार हैं. विवो में शामिल हैं: (i) तो 19 एफ एमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा सेल संकेत यों को पृष्ठभूमि से मुक्त छवियों और पूरा सेल selectivityand (दो) संभावना पैदावार जो vivo में कार्बन वाली 19 एफ, के अभाव में सेल ट्रैकिंग के लिए PFCS की महत्वपूर्ण लाभ .

Introduction

vivo में कोशिकाओं की ट्रैकिंग biomedicine के कई क्षेत्रों में एक महत्वपूर्ण पहलू है. इसके लिए चुनिंदा समय की अवधि में कोशिकाओं स्थानीयकरण कर सकते हैं कि noninvasive इमेजिंग तकनीक अत्यंत मूल्यवान हैं. तीन आयामी चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के विकास के लिए पहले, प्रतिरक्षा सेल प्रवास के ट्रैकिंग सूक्ष्म विश्लेषण या ऊतक बायोप्सी के लिए सीमित था. एमआरआई की मदद से सेल ट्रैकिंग vivo में प्रतिरक्षा सेल व्यवहार का अध्ययन प्रतिरक्षाविज्ञानी के लिए ही नहीं, पिछले कुछ वर्षों में बहुत ध्यान प्राप्त की, लेकिन यह भी नैदानिक ​​और स्टेम कोशिका के शोधकर्ताओं के लिए किया गया है. मध्य 90 के दशक के दौरान, लोहे के आक्साइड पर पहला अध्ययन 1 एमआरआई के साथ ट्रैकिंग कोशिकाओं के लिए घटनाओं की एक झरना शुरू की नैनोकणों. आयरन ऑक्साइड के कणों लेबल की कोशिकाओं के एमआर विश्राम का समय (टी 2 *) छोटा और इस प्रकार एमआर छवियों में संकेत कमी का कारण. आयरन ऑक्साइड के कणों लेबल मैक्रोफेज 2, oligodendrocyte पी करने के लिए नियोजित किया गया हैrogenitors 3 और कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं. इन कणों से कुछ भी चिकित्सकीय मेलेनोमा रोगियों 4 में सेलुलर टीके लेबलिंग के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है. विवो या लोहे के आक्साइड के कणों के साथ कोशिकाओं के पूर्व vivo लेबलिंग में के बाद से टी 2 * संकेत का एक छोटा करने पर निर्भर करता है और बाद में भी, इस तरह के सूक्ष्म bleeds, लोहा जमा या हवा के बुलबुले के रूप में इन विवो संवेदनशीलता से संबंधित टी 2 * प्रभाव में द्वारा लाया जा सकता है यह अन्य पृष्ठभूमि से vivo में टी 2 * संकेत विलुप्त होने 5 लेबल की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है.

इस अनुच्छेद में, हम 19 एफ / 1 एच चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के द्वारा रोजगार vivo में वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) पर नज़र रखने के लिए एक तकनीक का वर्णन है. यह सेल ट्रैकिंग प्रौद्योगिकी केवल एमआरआई में 19 एफ के लिए पहले मान्यता प्राप्त आवेदनों 7 सूचित किया गया था कई वर्षों के बाद, 2005 में 6 में पेश किया गया था. एक महत्वपूर्ण उन्नत स्तरलोहे के आक्साइड के कण सेल लेबलिंग में 19 एफ के ntage ऊतक में 19 एफ से कम जैविक घटना है, यह मूल रूप से पृष्ठभूमि से मुक्त छवियों के साथ बहुत चुनिंदा कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए यह संभव बनाता है. इसके अलावा, यह पारंपरिक 1H एमआरआई से प्राप्त संरचनात्मक छवियों के साथ प्रतिरोपित कोशिकाओं लेबल से 19 एफ एमआर संकेत उपरिशायी करने के लिए संभव है. 19 एफ / 1 एच एमआरआई इसलिए vivo में सेल प्रवास की जांच के अध्ययन के लिए काफी प्रासंगिक है. इस विधि के साथ अध्ययन किया प्रकोष्ठों 19 एफ युक्त कणों के साथ लेबल रहे हैं. मुख्य रूप से कार्बन और फ्लोरीन परमाणुओं से मिलकर synthetically व्युत्पन्न perfluorocarbons (PFCS) सामान्यतः कणों को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन यौगिकों पानी में अघुलनशील हैं और इन विट्रो में या विवो में आवेदन करने से पहले emulsified करने की आवश्यकता है. एफ एमआरआई ट्रैकिंग प्रयोगों विवो 19 में के लिए अन्य समूहों द्वारा नियोजित किया गया है कि पीएफसी कणों के सामान्य आकार100 एनएम और 245 एनएम 6,8-10 के बीच पर्वतमाला. हम फिर भी पता चला है कि बढ़ती कण आकार (> 560 एनएम) के साथ perfluoro-15-ताज-5-ईथर (PFCE) कणों वृद्धि के साथ वृक्ष के समान कोशिकाओं लेबलिंग में दक्षता. 11

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं के निष्पादन से पहले स्थानीय संस्थागत पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. एमआर माप के दौरान संज्ञाहरण और शारीरिक निगरानी की एक पर्याप्त स्तर (शरीर का तापमान, सांस की दर) अनिवार्य आवश्यकताओं हैं.

1. माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

  1. C57BL से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं निकालें / 6 चूहों के रूप में पहले 12 में वर्णित है. इस प्रोटोकॉल वापस 1992 13 के लिए तारीखों और मूल राल्फ एम Steinman (1943-2011), वृक्ष के समान सेल 14 के आविष्कार के समूह द्वारा बताया गया था.
  2. संक्षेप में, चूहों का त्याग करने के बाद जल्द ही टिबिअ और fibula निकाल सकते हैं. लामिना का प्रवाह हुड (माइक्रोबियल संदूषण रोकने के लिए) के तहत कार्य करना, धोने मध्यम (5% FBS, RPMI में 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% HEPES) 12 के साथ एक छोटा सा पेट्री डिश में अस्थि मज्जा फ्लश.
  3. एक सेल रणनीति के माध्यम से सेल निलंबन स्थानांतरणiner (100 माइक्रोन जाल आकार, नायलॉन) एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में हड्डी और बचे हुए ऊतकों को हटाने के लिए. कई धोने कदम और एक सेल कदम के बाद 12, trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती.
  4. 400,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता संस्कृति के माध्यम में मिलीलीटर -1 में resuspend अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (RPMI 10% FBS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% HEPES और 1% एल glutamine) माउस ग्रानुलोच्य्ते के 75 एनजी मिलीलीटर -1 युक्त प्लाज्मिड एक माउस GMCSF साथ ट्रांसफ़ेक्ट 293FT HEK कोशिकाओं की supernatants से प्राप्त बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एमजीएम-सीएसएफ). पेट्री डिश में सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर (4 x 10 6 कोशिकाओं) (100 मिमी x 20 मिमी) स्थानांतरण और (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते. 3 दिन, 10 मिलीलीटर ताजा मध्यम (75 एनजी मिलीलीटर -1 में MGM-सीएसएफ के अंत एकाग्रता रखने) के साथ पुराने मध्यम भरपाई होगी. 6 दिन, पुराने माध्यम के 10 मिलीलीटर हटाने और फिर से भरना10 मिलीलीटर ताजा माध्यम से (एमजीएम-सीएसएफ अंत एकाग्रता = 75 एनजी मिलीलीटर -1). सुबह 8 पर, पुरानी माध्यम के 10 मिलीलीटर हटाने और 10 मिलीलीटर ताजा मध्यम (एमजीएम-सीएसएफ अंत एकाग्रता = 150 एनजी मिलीलीटर -1) के साथ फिर से भरना.
  5. दिन 10, 24 घंटा के लिए 1 ग्राम मिलीलीटर -1 lipopolysaccharide (LPS) के साथ भेदभाव डीसी परिपक्व.

2. 19 एफ युक्त कणों के साथ वृक्ष के समान कोशिकाओं की लेबलिंग

  1. 24 घंटा परिपक्वता कदम (1.5), लेबल डीसी के दौरान साथ 1 मिमी फ्लोरीन युक्त perfluoro-15-ताज-5-ईथर (PFCE) भी 24 घंटे के लिए कणों (500-560 एनएम). एक सेल में खलल न डालें टाइटेनियम sonotrode का उपयोग और 60 सेकंड के लिए एक सतत नाड़ी कार्यक्रम (आयाम 100%, बिजली = 250 डब्ल्यू) रोजगार (कुल मात्रा 2.5 मिलीग्राम) Pluronic एफ 68 में PFCE पायसीकारी द्वारा बड़े फ्लोरीन लेबल कणों को तैयार है.
  2. ऊपर ऊष्मायन कदम के बाद, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में एक टिशू कल्चर सेल खुरचनी, हस्तांतरण का उपयोग परिपक्व और फ्लोरीन लेबल डीसी फसल500 में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए × छ.
  3. किसी भी बचे हुए कणों और मृत कोशिकाओं को धोने के लिए, पाली एल lysine बर्तन पर पालन करने के लिए काटा कोशिकाओं छोड़ दें. इस कदम के लिए तैयार करने के लिए, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाली एल lysine (1 मिलीग्राम मिलीलीटर -1), के साथ कोट पेट्री डिश उसके बाद पीबीएस के साथ अनबाउंड पाली एल lysine से धो लो.
  4. सीरम मुक्त माध्यम में पाली एल lysine लेपित प्लेटों पर काटा कोशिकाओं ऊपर सेते हैं और (37 से कम 1 घंटा डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) कोशिकाओं का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. गैर पक्षपाती कोशिकाओं, शेष कणों और मृत कोशिकाओं को अलग कर दें और साथ तीन बार धोने के लिए मध्यम बंद धो पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस.
  6. Trypsin-EDTA के इलाज (0.25% trypsin-EDTA, 37 डिग्री सेल्सियस से कम 3 मिनट ऊष्मायन) द्वारा हार्वेस्ट पक्षपाती कोशिकाओं.
  7. एक और धोने centrifugation कदम के बाद, सीरम मुक्त बाँझ पीबीएस में परिपक्व डीसी के लिए आवश्यक राशि resuspend.
  8. कोशिकाओं को सफलतापूर्वक चिह्नित किया गया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, यह physicoche जांच की सिफारिश की हैप्रवाह cytometry (FACS) का उपयोग कोशिकाओं की mical विशेषताओं. पहले 11 के रूप में वर्णित बगल की ओर तितर बितर (एसएससी), इन कोशिकाओं में एक वृद्धि विघटन प्रकट करना चाहिए. यह भी fibroblasts के डीसी संस्कृतियों दूषित हो सकता है और भी समानांतर में 19 एफ कणों का समय लग सकता है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. इसलिए डीसी पवित्रता विवो आवेदन में से पहले (FACS का उपयोग कर CD11c + CD11b + कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने के द्वारा) मूल्यांकन किया जाना चाहिए.

3. 19 एफ लेबल वृक्ष के समान कोशिकाओं के विवो आवेदन में

  1. एक धारक में माउस स्थिति से intracutaneously एक C57BL 6 / माउस की हिंद अंग में 100 μl और ध्यान से त्वचा की ऊपरी परत में एक 26 साढ़े जी सुई डालने - 50 की एक मात्रा में - डीसी (10 7 10 6) प्रशासन पूर्व आवेदन करने के लिए (स्थायी रूप से संलग्न सुई के साथ प्रयोग के 0.5 मिलीलीटर टुबरकुलीन सीरिंज मृत मात्रा को कम करने के लिए). एक सुनिश्चित करने के लिएएन उपयुक्त intracutaneous आवेदन, यह सुई का डाला हिस्सा त्वचा के नीचे आंशिक रूप से दिखाई दे सकता है कि महत्वपूर्ण है. सुई किसी भी अधिक दिखाई नहीं देता है, तो सुई त्वचा की परतों में भी गहरी डाला गया है. अप्रशिक्षित व्यक्ति के लिए, intracutaneous आवेदन संज्ञाहरण के तहत किया जा सकता है.
  2. विवो फ्लोरीन में से छवि अंग (19 एफ) / प्रोटॉन (1 एच) एमआरआई (अगले अनुभाग देखें) 21 घंटा निम्नलिखित इंजेक्शन.

4. Vivo में 19 एफ / 1 एच चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

एमआर स्कैन की स्थापना के लिए विस्तृत निर्देश नियंत्रण सॉफ्टवेयर Paravison (संस्करण 5.1) का उपयोग कर एक Bruker एमआर स्कैनर को देखें. विक्रेता विशिष्ट कार्यों और आइटम की चर्चा करते हुए नाम इटैलिक में डाला गया है. अन्य एमआर स्कैनर के लिए ये कदम 'निर्माताओं के दिशा निर्देशों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.

  1. एक समर्पित करने के लिए उपयोग को व्यवस्थित करेंछोटे जानवर एमआर स्कैनर. रैपिड बायोमेड, वुर्जबर्ग, पर्याप्त छवि गुणवत्ता, 9.4 टेस्ला या अधिक और सिलवाया रेडियो आवृत्ति कॉयल (जैसे 1 एच / 19 एफ दोहरे ट्यून करने योग्य मात्रा आरएफ कुंडल, 35 मिमी भीतरी व्यास 50 मिमी लंबाई का एक चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के साथ एक प्रणाली के लिए जर्मनी) की सिफारिश की है.
  2. एमआरआई के लिए पहले, संज्ञाहरण और शारीरिक निगरानी के लिए एमआरआई स्कैनर का सेटअप तैयार करते हैं. पशु बिस्तर / धारक की सांस लेने मुखौटा isoflurane प्रणाली से जुड़ा है और तापमान जांच और सांस लेने पैड एक दूरदराज के पशु निगरानी प्रणाली (जैसे मॉडल 1025, एसए उपकरण इंक, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका) से जुड़े रहे हैं कि सुनिश्चित करें कि. हालांकि बाद में इस तरह के शरीर का तापमान और श्वसन के रूप में पशु की महत्वपूर्ण पैरामीटर पर नजर रखने के लिए कार्य करता है.
  3. एक isoflurane प्रणाली से जुड़े एक माउस कक्ष का उपयोग साँस लेना निद्रावहन द्वारा चूहों anesthetize. 0.2 एल मिनट -1 और 0.1 एल मिनट -1, क्रमशः पर हवा और ओ 2 के लिए प्रवाह दर को समायोजित करेंऔर संज्ञाहरण के अपेक्षित स्तर तक के बारे में 2 मिनट के लिए isoflurane के 3% (एक vaporizer से समायोजित) (कोई जवाब निम्नलिखित पैर के अंगूठे चुटकी) पर पहुंच गया है. इष्टतम प्रवाह दरों में इस्तेमाल किया जा रहा सेटअप के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. उच्च प्रवाह दरों निर्जलीकरण का कारण बन सकता है जागरूक बनो. उपरोक्त के रूप में 'जानवरों की स्थिति की सावधानी से निगरानी हर समय की आवश्यकता है.
  4. छोटे जानवर एमआर स्कैनर (चित्रा 1) के माउस बिस्तर / धारक पर प्रवण माउस रखें.
  5. हवा और ओ 2 के लिए निरंतर प्रवाह दर रखते हुए, 0.8 के लिए isoflurane vaporizer समायोजित - 1.5% एक इष्टतम सांस लेने पैटर्न तक पहुँच जाता है. 50 साल की एक श्वसन दर - प्रति मिनट 70 साँस की सिफारिश की है.
  6. एक गर्म पानी (या वैकल्पिक रूप से गर्म हवा) परिसंचरण तंत्र को रोजगार से प्रयोग के दौरान 36-37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें.
  7. माप के दौरान बाँझ नेत्र चिकनाई मरहम के साथ माउस नम की आँखों रखें.
  8. पशु हासिल करने के बादइमेजिंग धारक और निगरानी प्रणाली के लिए कनेक्शन पर, 1 एच / 19 एफ आरएफ तार (पशु स्कैनर चुंबक की isocenter पर तैनात है कि) के केंद्र के लिए धारक चाल.
  9. एक स्वचालित पद्धति (उदाहरण के लिए एक मोटर चालित पशु धारक के साथ संयुक्त एक स्थिति लेजर का उपयोग) के साथ या मैन्युअल धारक स्थानांतरित करने की जरूरत दूरी की गणना के द्वारा, या तो घुटने चुंबक की isocenter भीतर निहित है कि इस तरह के माउस की स्थिति निर्धारित करें चुंबक में isocenter तक पहुँचने के लिए.
  10. स्कैनर में जानवरों की सही स्थिति की पुष्टि करने और बाद में छवि टुकड़ा ज्यामिति (अंतरिक्ष में अर्थात् आकार, स्थिति और रोटेशन) की योजना बनाने के लिए, तेजी से और कम संकल्प छवि का उपयोग करते हुए तीन मानक झुकाव (बाण के समान, राज्याभिषेक, अक्षीय) में छवियों स्काउट अधिग्रहण अधिग्रहण के तरीके (एक फ्लैश पल्स अनुक्रम का उपयोग करता है जैसे TriPilot प्रोटोकॉल).
  11. 1 एच अनुनाद आवृत्ति आरएफ कुंडल ट्यून (जैसे. 400.1 9.4 टी के लिए मेगाहर्ट्ज) और 19 एफ अनुनाद आवृत्ति के लिए (जैसे 9.4 टी के लिए 376.3 मेगाहर्ट्ज) और पशु एमआर स्कैनर की ट्यूनिंग मॉनिटर का उपयोग कर 50 ओम के लिए कुंडली के विशिष्ट प्रतिबाधा मैच. ट्यूनिंग और मिलान पारेषण और संकेत स्वागत के लिए इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
  12. आरएफ आयाम (समायोजित करने के लिए माउस का Lamor आवृत्ति (जैसे ADJ_SF) और संदर्भ हासिल करने के लिए आरएफ धुन को ठीक धुन करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र (जैसे ADJ_SHIM), प्रणाली आवृत्ति समायोजन की एकरूपता shimming सहित आवश्यक स्वचालित प्रणाली सेटिंग्स प्रदर्शन करना जैसे ADJ_REFG). इन सभी सेटिंग्स संभव के रूप में सजातीय के रूप में ब्याज के क्षेत्र में स्थिर और चर आकर्षणविद्या क्षेत्रों (बी 0, बी 1) बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
  13. देखने के क्षेत्र (FOV) ऐसा है कि निचले अंगों दोनों की गिरफ्तारी समायोजित करने के बाद, तीन orthogonal के झुकाव के साथ स्काउट छवियों के एक दूसरे सेट (ऊपर के रूप में) का अधिग्रहणश्रोणि से पैर (LxWxH = 50x25x25 मिमी) को दिखाई ई. इन छवियों को अंतिम 3 डी 1 एच / 19 एफ स्कैन का झुकाव योजना के लिए काम करते हैं.
  14. टी.आर. / ते = 1500/53 मिसे, FOV = 50x25x25 मिमी, मैट्रिक्स = 400x200x200, दुर्लभ फैक्टर = 16 (. स्कैन समय लगभग 60 मिनट): 1 एच स्कैन के लिए एक TurboRARE 3 डी प्रोटोकॉल सेट करें. स्काउट छवियों की मदद से FOV समायोजित, (यातायात प्रकाश) स्कैन शुरू.
  15. कम से कम 1,000 मिसे के एक टी.आर. साथ एक नाड़ी खूंटी-अनुक्रम लोड. संपादित स्कैन खोलें और 19 को एफ नाभिक सेट साधन का संपादन विधि में स्वत संदर्भ लाभ निरस्त करके पुस्तिका लाभ सेटिंग्स का उपयोग करें.
  16. जीएसपी (सेटअप जाना) का उपयोग करके वास्तविक समय में एक एमआर संकेत प्रदर्शित करने के लिए डेटा रिकॉर्डिंग के बिना माप शुरू करो. अधिग्रहण खिड़की के भीतर 19 एफ वर्णक्रमीय संकेत बहुत कम है, संपादन विधि और / में अधिक औसत से जोड़ने के लिए या एक सी जब तक पल्स attenuator (TX0 या SP0 स्लाइडर) मिलानाgnal स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है. अधिग्रहण खिड़की में 0 हर्ट्ज से कम 19 एफ वर्णक्रमीय शिखर केंद्र के क्रम में बुनियादी आवृत्ति समायोजित करें. बुनियादी आवृत्ति और प्रेस रोक लगाओ. संज्ञाहरण के रूप में इस्तेमाल isoflurane के एक पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न हो सकता है ध्यान दें. 9.4 टेस्ला एमआरआई से कम 19 एफ युक्त कणों और isoflurane के बीच रासायनिक बदलाव 1,800 हर्ट्ज के बारे में है. उत्तेजना बैंडविड्थ 19 एफ लेबल कोशिकाओं या कणों के साथ रोमांचक isoflurane के साथ से बचने के लिए 3600 हर्ट्ज से छोटी है कि सुनिश्चित करें. बुनियादी आवृत्ति 19 एफ लेबल कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न संकेत पर सही ढंग से स्थापित किया जाना चाहिए. प्रयोगकर्ता फिट देखता है के रूप में वैकल्पिक रूप से, संज्ञाहरण का एक और तरीका इस्तेमाल किया जा सकता है.
  17. क्लोन (नकल) पिछले 1 एच स्कैन से TurboRARE 3 डी प्रोटोकॉल. विधि और अचयनित स्वत संदर्भ लाभ (ऊपर) के रूप में संपादित करने के लिए जाओ. संपादित स्कैन से 19 एफ नाभिक सेट करें. 128x64x64 को मैट्रिक्स बदलेंऔर कम से कम 40 (64 से ऊपर) के लिए दुर्लभ फैक्टर. एक टी.आर. / ते 1000/6 मिसे और 64 के औसत के लिए, स्कैन के समय लगभग 70 मिनट है. 101 (उपकरण बॉक्स) को रिसीवर लाभ सेट और GOP (पाइपलाइन जाना) का उपयोग कर किसी भी आगे के समायोजन के बिना स्कैन शुरू.
  18. स्कैन पूरा कर लें एमआर स्कैनर से माउस धारक वापस लेना. ध्यान धारक से माउस डिस्कनेक्ट. माउस पूर्व vivo विश्लेषण (जैसे ऊतक विज्ञान या स्पेक्ट्रोस्कोपी, नीचे देखें) के लिए बलिदान नहीं है, तो यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है जब तक सीधे एमआर माप के बाद बारीकी से निगरानी. शरीर का तापमान विनियमन संज्ञाहरण से प्रभावित है, तो वसूली प्रक्रिया के दौरान, एक गर्म तापमान विनियमित पैड पर रखा गया है कि एक अलग पिंजरे में माउस डाल दिया. माउस को पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया गया है, अपनी होल्डिंग पिंजरे और पशु कमरे के लिए यह वापसी.
  19. 19 एफ छवियों 1 एच छवियों को आच्छादित करने के लिए, दृश्य मेनू ओ का उपयोगएक ही सॉफ्टवेयर (Paravison) पर ption. बुनियाद समारोह सहसंबंधी के नीचे पाया जा सकता है. , बुनियाद सहेजें नई छवि लोड और मेज ऊपर देखो से एक नया रंग परिभाषित द्वारा 19 एफ परत पर प्रकाश डाला. 19 एफ और 1 एच स्कैन के बीच भेदभाव करने के लिए, 19 एफ संकेत चुना रंग और पृष्ठभूमि 1 एच छवि होगा कि इस तरह के स्केल में रहेगा (कटौती तालिका ऊपर देखो) चुना रंग के लिए सीमा में परिवर्तन. अन्य पोस्ट प्रोसेसिंग कार्यक्रमों (जैसे ImageJ) 1 एच / 19 एफ छवि ओवरले बनाने के लिए उपलब्ध हैं.
  20. 19 एफ संकेत के vivo मात्रा का एक आवश्यक होना चाहिए, जैसा कि पहले 15,16 वर्णित के रूप में एक सरल मात्रात्मक प्रोटोकॉल का पालन करें. संक्षेप में, मात्रा का ठहराव माउस के बगल FOV भीतर PFCE-पायस की एक ज्ञात एकाग्रता के साथ एक संदर्भ ट्यूब डाल द्वारा किया जा सकता है. एमआर छवियों, क्वान प्राप्त करने के बादक्षेत्र के हित (आरओआई) विश्लेषण का उपयोग करते हुए 19 एफ संकेतों की तीव्रता tify और चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में इन विट्रो अंशांकन वक्र में करने के लिए की तुलना करें.

5. लिम्फ नोड चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (मिसेज)

  1. माउस का त्याग करने के बाद, एक छोटे से 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में घुटने की चक्की लिम्फ नोड और जगह को हटाने और 2% पीएफए ​​के 100 μl जोड़ें.
  2. लिम्फ नोड युक्त एनएमआर ट्यूब आयोजित करने के लिए कम से कम 5 मिमी का उद्घाटन किया गया है जो एक 19 एफ स्पेक्ट्रोस्कोपी का तार (एक toroidal कुंडल जैसे) स्थापित करें.
  3. कुंडली के अंदर एनएमआर ट्यूब प्लेस और चुंबक की isocenter में कुंडल चाल.
  4. 19 एफ अनुनाद आवृत्ति (जैसे 9.4 टी के लिए 376.3 मेगाहर्ट्ज) के लिए आरएफ कुंडल ट्यून और पशु एमआर स्कैनर की ट्यूनिंग मॉनिटर का उपयोग कर 50 ओम के लिए कुंडली के विशिष्ट प्रतिबाधा मैच. ट्यूनिंग और मिलान पारेषण और संकेत के लिए इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैस्वागत.
  5. 0 से shimming साधन के भीतर सभी शिम पैरामीटर सेट और लागू दबाएँ. आमतौर पर यह नमूना की मात्रा अपेक्षाकृत छोटा है के बाद से shimming तरीकों को लागू करने के लिए आवश्यक नहीं है. एक पर्याप्त 19 एफ संकेत उपलब्ध है, तो स्वचालित तरीकों shimming, प्रणाली आवृत्ति और ऊपर वर्णित के रूप में रिसीवर लाभ के लिए लागू किया जा सकता है.
  6. कम से कम 1,000 मिसे के एक टी.आर. साथ एक नाड़ी खूंटी अनुक्रम लोड. स्कैन संपादित करें और 19 एफ के नाभिक सेट खोलें साधन का संपादन विधि में स्वत संदर्भ लाभ निरस्त करके पुस्तिका लाभ सेटिंग्स का उपयोग करें. 1 से औसत की संख्या निर्धारित करें.
  7. जीएसपी का उपयोग कर क्रम शुरू. अधिग्रहण खिड़की के भीतर 19 एफ वर्णक्रमीय संकेत बहुत कम है, संपादन विधि और / में अधिक औसत से जोड़ने के लिए या एक संकेत तक पल्स attenuator (TX0 या SP0 स्लाइडर) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है मिलाना. बुनियादी आवृत्ति समायोजित करें ताकि 19 एफ विशेषctral शिखर 0 हर्ट्ज पर अधिग्रहण खिड़की के केंद्र में है और बुनियादी आवृत्ति लागू होते हैं. 90 ° उत्तेजना तक पहुंचने के संकेत, अधिकतम करने के लिए फिर से पल्स attenuator समायोजित करें. संकेत अधिकतम प्रेस स्टॉप पर है.
  8. 64 और 256 के बीच संपादित विधि (या अधिक आवश्यक हो तो, संकेत पर निर्भर करता है) में औसत से सेट और GOP का उपयोग कर अधिग्रहण शुरू. पता चला संकेत के औसत की संख्या के साथ रैखिक संबद्ध करता है. मात्रा का ठहराव के दौरान पता चला संकेत एक औसत के लिए सामान्यीकृत है कि जरूरतों को ध्यान में रखना है. इसके अलावा, एक ज्ञात एकाग्रता या एक अंशांकन वक्र का एक अंशांकन मानक सामान्यीकृत 19 एफ संकेत (चित्रा 2) से कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए आवश्यक है.
  9. स्कैन के समाप्त हो जाने के बाद, नमूना हटाने अगले नमूना जगह और 5.3 कदम के साथ आगे बढ़ना.

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Representative Results

Intracutaneous आवेदन के बाद अठारह को इक्कीस घंटे, 19 एफ लेबल वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) draining घुटने की चक्की लिम्फ नोड में विस्थापित. draining politeal लिम्फ नोड में लसीका नलिकाओं के माध्यम से डीसी का आंदोलन 19 एफ डीसी छवियों (2A चित्रा) के साथ 1 एच संरचनात्मक छवियों overlaying द्वारा सराहना की जा सकती. हम पहले से vivo में इन कोशिकाओं के प्रवास, साथ ही तेज दक्षता 11 सहित डीसी immunobiology, पर 19 एफ कण आकार के प्रभाव पर सूचना दी है. लिम्फ नोड्स में डीसी प्रवास की हद तक यों के क्रम में, हम draining लिम्फ नोड्स निकालने के लिए और 19 एफ मिसेज (चित्रा 2 बी) का प्रदर्शन. हम परिणाम निकालना कर सकते हैं एक ही PFCE कणों (अंशांकन वक्र, चित्रा -2) के साथ लेबल डीसी की अलग नंबरों से प्राप्त 19 एफ संकेत के साथ प्रत्येक लिम्फ नोड से प्राप्त 19 एफ संकेत तुलनाdraining लिम्फ नोड तक पहुँचने कि 19 एफ लेबल डीसी की संख्या. आंकड़े 2A और 2 बी में दिखाया प्रतिनिधि प्रयोग में, हम प्रतिजन के साथ लोड नहीं किए गए 7.5 एक्स 10 4 डीसी सही लिम्फ नोड पर पहुंच गया, जबकि 3.6 एक्स 10 5 प्रतिजन लोड डीसी सही लिम्फ नोड पर पहुंच गया है कि परिणाम निकालना कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. छोटे जानवर एमआर स्कैनर के माउस धारक पर माउस की स्थिति.

चित्रा 2
चित्रा 2. 19 एफ मिसेज का उपयोग vivo में 19 एफ लेबल डीसी प्रवास की मात्रा. (ए) डीसी 1 मिमी 560 एनएम PFCE particl साथ लेबल रहे थे तों, साथ (सही) या (बाएं) प्रतिजन बिना भरी हुई है और पिछले अंग में intracutaneously दिलाई. पूरे चिकन ovalbumin (ओवीए) प्रतिजन के रूप में नियुक्त किया गया था, ओवीए 19 एफ कणों के साथ मिलकर डीसी के साथ incubated था. लिम्फ नोड्स और लसीका नलिकाओं 1 एच संरचनात्मक एमआर छवि (स्केल) में दिखाया जाता है जबकि वृक्ष के समान कोशिकाओं, 19 एफ एमआर संकेत (लाल) के रूप में दिखाया जाता है. छवियाँ गुंजयमान यंत्र एक 19 एफ / 1 एच दोहरे ट्यून करने योग्य मात्रा पिंजरा के साथ हासिल किया गया. (बी) माउस से लिम्फ नोड्स एक निकाला और एक एनएमआर ट्यूब में रखा गया में दिखाया गया है. 19 एफ संकेत 19 एफ मिसेज (प्रोटोकॉल पाठ देखें) और आयाम हासिल कर ली मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) की एक तेजी से फूरियर रूपांतरण (FFT) का प्रदर्शन द्वारा गणना की गई मापा गया था. (सी) 24 घंटे की अवधि के दौरान, विभिन्न डीसी की मात्रा में 1 मिमी 560 एनएम PFCE कणों के साथ लेबल रहे थे और 19 एफ संकेत बी के रूप में 19 एफ मिसेज द्वारा मापा गया थाएफई = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

19 एफ / 1 एच एमआरआई लिम्फ नोड में डीसी के आंदोलन का पालन करने के लिए रोजगार का यह तरीका vivo में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास पैटर्न का अध्ययन करने का अवसर देता है. वृक्ष के समान कोशिकाओं के तेजी से कस विशिष्ट substrates के लिए 17 पालन के बिना तीन आयामी संरचना के माध्यम से छल करने में सक्षम हैं कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं पलायन के उत्कृष्ट उदाहरण हैं. वर्णित तकनीक का कम स्थानिक संकल्प (माइक्रोन रेंज) इस तकनीक के साथ, multiphoton माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि उच्च संकल्प (एनएम रेंज) के साथ तुलनीय नहीं है हालांकि यह vivo में और अधिक सेल प्रवास की प्रकृति का अध्ययन करने के लिए अभी भी संभव है समय की एक लंबी अवधि. इसके अलावा, माइक्रोस्कोपी एक जीवित जीव के भीतर इमेजिंग बड़े क्षेत्रों के लिए यह वर्तमान में अनुपयुक्त बना रही है, एक सीमित गहराई पैठ और देखने का एक सीमित क्षेत्र है.

तकनीक की noninvasiveness के कारण, यह सोमवार के लिए संभव हैजांच के बाद माउस के बिना त्याग itor कई दिनों के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास. तकनीक का एक अन्य लाभ यह है कि संरचनात्मक 1 एच स्कैन के साथ पलायन कोशिकाओं पर कब्जा है कि 19 एफ छवियों, जिससे जीवित जीव के भीतर कोशिकाओं की एक सटीक स्थानीयकरण की अनुमति आच्छादित करने की संभावना है. इस तकनीक हमें डीसी प्रवास अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए सक्षम हो जाएगा. इन विट्रो प्रवास assays में ठेठ विपरीत, यह विधि एक शारीरिक 3 डी वातावरण में सेल प्रवास के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है.

मिसेज और एमआरआई में 19 एफ के संभावित आवेदन लंबे 7,18 मान्यता दी गई है. उच्च gyromagnetic अनुपात, उच्च स्पिन और प्राकृतिक समस्थानिक बहुतायत 19 एफ एमआर इमेजिंग 7 के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है. इसके अलावा, 19 एफ और 1 एच (उनके एनएमआर गुणों के बारे में) के बीच समानता टी के बीच एक सार्थक ओवरले के लिए एक शर्त हैवह लेबल कोशिकाओं की एमआरआई 19 एफ के साथ शारीरिक 1H एमआरआई. दरअसल अन्य 1 एच / एक्स नाभिक एमआरआई से अधिक एमआरआई 1 एच / 19 एफ से एक लाभ गुंजयमान यंत्र ही आरएफ 19 एफ और 1 एच नाभिक दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 19 एफ / 1 एच एमआरआई, एक मात्रा गुंजयमान यंत्र के लिए इस्तेमाल ज्यादातर आवेदनों में 19 एफ और 1 एच. दोनों को देखते जा सकता है कि कार्यरत है दोनों चैनलों के लिए लगभग समान बी 1 क्षेत्र, 19 एफ चैनल को 1 एच चैनल (कि मापने के लिए आसान है) से बिजली सेटिंग्स की एक हस्तांतरण के कारण इसलिए संभव है.

किसी भी आकार के कणों (अल्ट्रा छोटे से बड़े सूक्ष्म कण आकार के लिए) के साथ कोशिकाओं लेबलिंग माना जाता है जब एक महत्वपूर्ण कारक जैविक हेरफेर और विषाक्तता की क्षमता है. हमने हाल ही में लेबलिंग कणों का आकार बढ़ाने के द्वारा, हम डीसी 11 की परिपक्वता की स्थिति को बढ़ावा देने सकता है दिखाया है. एक संभवहमारे निष्कर्ष के लिए स्पष्टीकरण बल्कि endocytosis के 19 से phagocytosis द्वारा शुरू किए जाने वाले 500 एनएम से बड़े कणों के लिए प्रधानता है, पूर्व तेज तंत्र डीसी की प्रकृति को परिभाषित. अन्य शारीरिक विशेषताओं (जैसे कण आकार और सतह टोपोलॉजी) भी लेबल की कोशिकाओं के जैविक समारोह को बदल सकता है और यह भी ध्यान से 20 विचार किया जाना चाहिए. कणों के साथ डीसी की लेबलिंग की आवश्यकता है कि किसी भी प्रयोगात्मक स्थापना के लिए, यह इस प्रकार अत्यधिक ठेठ कोशिका जीव विज्ञान assays इन कोशिकाओं के जैविक गुणों पर कणों का कोई प्रभाव का निर्धारण / बाहर करने के लिए प्रयोग करने के लिए समानांतर में प्रदर्शन कर रहे हैं की सिफारिश की है. कई assays के सवाल में प्रयोगात्मक अध्ययन के आधार पर, प्रदर्शन किया जा सकता है. डीसी परिपक्वता पर प्रभाव छोड़ने के लिए, सेल सतह मार्कर (जैसे CD80, CD86) FACS द्वारा अभिव्यक्ति की माप की सिफारिश की है. प्रतिजन तेज और प्रस्तुति, phagocytosis अनुभव पर एक प्रभाव बाहर करने के लिएiments और क्रमशः टी सेल भड़काना प्रयोगों, सिफारिश कर रहे हैं. माइग्रेशन प्रयोगों के मामले में, केमोकाइन की अभिव्यक्ति (सीसी) रिसेप्टर्स (जैसे CCR7 के रूप में) और इन विट्रो प्रवास assays में सिफारिश कर रहे हैं.

19 एफ / 1 एच एमआरआई विशेष रूप से नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए सेल प्रवास के अध्ययन के लिए वादा धारण हालांकि, सीमाओं के एक नंबर वर्तमान में कर रहे हैं. ये (मैं) एक व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य precludes कि स्थानिक संकल्प, (दो) अपर्याप्त 19 एफ संवेदनशीलता (एक रॉय के भीतर कई 10 5 कोशिकाओं का पता लगाने सीमा), (ग) का एक परिणाम के रूप में स्कैन durations के वृद्धि की भरपाई के लिए औसत वृद्धि हुई शामिल बाजार पर 19 एफ आरएफ resonators और ऐसे isofluorane और polytetrafluoroethylene (PTFE) के भीतर एमआर हार्डवेयर घटकों (के रूप में अन्य फ्लोरीन युक्त तत्वों द्वारा (v) संभव अवांछनीय पृष्ठभूमि 19 एफ संकेत के पिछले सीमा के लिए, (चार) एक सीमित रेंजजैसे capacitors और जोड़ने केबल).

इसके अलावा इस तरह के चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और ढाल ताकत के रूप में कारकों से, स्थानिक संकल्प का स्तर तय है कि एक मुख्य निर्धारक गुंजयमान यंत्र 21 का इस्तेमाल किया रेडियो आवृत्ति की संवेदनशीलता (आरएफ) है. एमआरआई संकल्प बारीकी से संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) 21 से संबंधित है और स्थानिक संकल्प बढ़ाना voxel आकार को कम करने पर, SNR में एक नुकसान उम्मीद की जा रही है. है संकेत संवेदनशीलता समझौता किए बिना स्थानिक संकल्प को बढ़ाने के लिए एक तरह से थर्मल शोर 22 को कम करने से SNR को बढ़ावा कि cryogenically कूल्ड कुंडलियों को रोजगार के लिए है. एक क्रायोजेनिक प्रणाली का उपयोग करता है कि एक 1H सिर का तार की सहायता के साथ, हम हाल ही में विमान के संकल्प (35x35) माइक्रोन 2 23 में एक का उपयोग करने के बाद प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून इंसेफैलोमाईलिटिस में सेलुलर पैठ कल्पना कर सकता है. 19 एफ / 1 के लिए इस cryogenically ठंडा प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग एच एमआरआई एक सेशन होगाportunity सेल संकेत का पता लगाने और संकल्प के साथ जुड़े एमआरआई सीमाओं के कुछ काबू पाने के लिए.

एमआरआई द्वारा कोशिकाओं के vivo नज़र रखने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा एक जीवित जीव के भीतर एक विशेष स्थान में इन कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव है. इस के लिए यह 19 एफ मिसेज (5.1-5.9 देखें) प्रदर्शन करने के लिए संभव है. 19 एफ लेबल डीसी के विभिन्न संख्या के 19 एफ मिसेज माप से प्राप्त कर रहे हैं कि अंशांकन घटता काम करके, यह लिम्फ नोड तक पहुँचने कोशिकाओं की संख्या में परिणाम निकालना संभव है. लिम्फ नोड्स के 19 एफ मिसेज माप 19 एफ मिसेज डीसी अंशांकन वक्र की तुलना में किया जा सकता है. इसके अलावा, शुद्ध PFCE साथ डीसी सेल अंशांकन घटता से मिसेज डेटा की तुलना करके, हम यह लेबलिंग का पालन सेल के अनुसार लगभग 10 13 19 एफ spins का पता लगाने के लिए संभव है कि परिणाम निकालना कर सकते हैं. एमआर सिद्धांतों के अनुसार, न्यूनतम सीमा का पता लगाने voxel 24 प्रति 10 18 spins में है. इस प्रकार, हम एक 9.4 टी एमआरआई प्रयोग voxel के प्रति 10 5 डीसी की एक न्यूनतम संख्या का पता लगाने में सक्षम हैं कि ग्रहण कर सकते हैं.

संक्षेप में, हम यहाँ वर्णन है कि प्रोटोकॉल pathophysiological प्रक्रियाओं के दौरान सेल प्रवास का अध्ययन विवो जांच में के लिए फायदेमंद है. 1 एच संरचनात्मक छवियों पर लेबल की कोशिकाओं से 19 एफ छवियों को आच्छादित करने की क्षमता पलायन कोशिकाओं का इष्टतम और अत्यधिक चयनात्मक ट्रैकिंग को बढ़ावा देता है, तकनीक की noninvasiveness पशुओं की बड़ी संख्या को त्याग की आवश्यकता के बिना अनुदैर्ध्य अध्ययन में सक्षम बनाता है और 19 एफ मिसेज प्रदान करता है vivo में विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक अवसर है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस अध्ययन बर्लिन में आण्विक चिकित्सा और Charité मेडिकल संकाय के लिए केंद्र Delbruck प्रायोगिक और क्लीनिकल रिसर्च सेंटर, मैक्स की एक सहयोग से दप के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG वा 2804) और दप के लिए एक विश्वविद्यालय अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम अपनी प्रयोगशाला में अपने इंटर्नशिप के दौरान तकनीकी सहायता के लिए श्री रॉबर्ट Westphal धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice Charles River, Berlin
RPMI Gibco 21875-091
FBS Superior Biochrom AG S 0615
HEPES Gibco-Invitrogen 15630-056
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine Gibco 25030-024
Dulbecco's PBS Sigma Aldrich D8662
PFA Santa Cruz sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur 391-1996
Pluronic F-68 Sigma Aldrich P5556
Petri dishes (35 x 10 mm) VWR, Germany 391-1996
27 ½ G syringes VWR, Germany 612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh) VWR, Germany 734-0004
NMR tubes VWR, Germany 634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools FST
CO2 incubator Binder
Small animal MR system Bruker Biospin 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil Rapid Biomed, Würzburg, Germany 35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil in-house tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025 SA Instruments Inc., New York, USA

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