De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Summary

El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor (

Abstract

Continuos avances en las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética (RM) han mejorado en gran medida nuestra capacidad para estudiar los procesos fisiológicos o patológicos en los organismos vivos. Resonancia magnética también está demostrando ser una herramienta valiosa para la captura de las células trasplantadas in vivo. Iniciales estrategias de etiquetado celulares para uso MRI hecho de agentes de contraste que influyen en los tiempos de relajación MR (T1, T2, T2 *) y conducen a una mejora (T1) o agotamiento (T2 *) de señal en la que están presentes las células marcadas. T2 * Agentes de mejora tales como agentes ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO) se han empleado para estudiar la migración celular y algunos también han sido aprobados por la FDA para su aplicación clínica. Un inconveniente de los agentes de T2 * es la dificultad de distinguir la extinción de la señal creada por las células marcadas de otros artefactos, como coágulos de sangre, hemorragias micro o burbujas de aire. En este artículo se describe una nueva técnica para el seguimiento de las células in vivo queestá basada en el etiquetado de las células con flúor ⁽¹⁹ F)-partículas ricas. Estas partículas se preparan mediante emulsión de perfluorocarbono (PFC) y compuestos entonces se utiliza para marcar células, que posteriormente se pueden obtener imágenes por resonancia magnética F ^19. Ventajas importantes de PFC para el rastreo de células in vivo incluyen (i) la ausencia de carbono enlazado a ¹⁹ F in vivo, lo que proporciona entonces libres fondo-imágenes y completo de células selectivityand (ii) la posibilidad de cuantificar la señal de la célula por espectroscopía ¹⁹ F MR .

Introduction

El rastreo de las células in vivo es un aspecto crucial en varios campos de la biomedicina. Para ello, las técnicas de imagen no invasivas que selectivamente puede localizar células en un período de tiempo son extremadamente valiosos. Antes del desarrollo de tres dimensiones de imágenes de resonancia magnética (MRI), el seguimiento de la migración de células inmunes se limitan a los análisis microscópicos o biopsias de tejidos. Seguimiento de la célula con la ayuda de resonancia magnética ha ganado la atención inmenso en los últimos años, no sólo para los inmunólogos que estudian el comportamiento celular inmune in vivo, sino también para los investigadores clínicos y de células madre. Durante mediados de los 90, los primeros estudios sobre el óxido de nanopartículas de hierro ¹ inició una cascada de acontecimientos para que las células de seguimiento con IRM. Partículas de óxido de hierro acortar el tiempo de relajación MR (T2 *) de las células marcadas y por lo tanto causar el agotamiento de la señal en imágenes de RM. Partículas de óxido de hierro se han empleado para la etiqueta ² macrófagos, p oligodendrocyterogenitors ³ y muchos otros tipos celulares. Algunas de estas partículas también han sido clínicamente aprobado por la FDA para el etiquetado de vacunas celulares en ⁴ pacientes con melanoma. Dado que in vivo o ex vivo etiquetado de las células con partículas de óxido de hierro se basa en un acortamiento de la señal * T2 y el segundo podría ser también provocada por in vivo relacionados con la susceptibilidad-T2 * efectos tales como hemorragias, micro depósitos de hierro, o burbujas de aire, podría ser difícil de identificar células marcadas in vivo de fondo otro T2 * extinciones de señal ^5.

En este artículo, se describe una técnica para el seguimiento de las células dendríticas (DC) in vivo mediante el empleo de ¹⁹ F / ¹ H formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Esta tecnología de rastreo celular se introdujo en 2005 ^6, varios años después de las primeras aplicaciones reconocidas para ¹⁹ F en la RM se habían notificado ^7. Una importante Advantage de ¹⁹ F sobre el etiquetado de óxido de hierro de células de partícula es la baja aparición biológica de ¹⁹ F en el tejido, lo que hace posible el seguimiento de las células de forma muy selectiva con imágenes básicamente libres de fondo-. Además, es posible superponer la señal de MR ¹⁹ F a partir de las células trasplantadas etiquetados con imágenes anatómicas obtenidas de RM convencional 1H. ¹⁹ F / ¹ H RMN es por lo tanto considerablemente relevantes para los estudios que investigan la migración celular in vivo. Células estudiadas con este método se etiquetan con ¹⁹ F-partículas ricas. Perfluorocarbonos sintéticamente derivados (PFC) que consisten principalmente de carbono y átomos de flúor se utiliza comúnmente para preparar las partículas. Estos compuestos son insolubles en agua y deben ser emulsionado antes de la aplicación in vitro o in vivo. El tamaño habitual de las partículas de PFC que han sido empleados por otros grupos en vivo ¹⁹ F-RMN experimentos de seguimientooscila entre 100 nm y 245 nm ^6,8-10. Sin embargo, hemos demostrado que la eficiencia en el etiquetado de las células dendríticas con perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) las partículas aumenta con el aumento del tamaño de partícula (> 560 nm). ¹¹

Protocol

Todos los animales procedimientos deben ser aprobados por el comité local institucional bienestar de los animales antes de la ejecución. Durante las mediciones de RM un nivel adecuado de anestesia y monitorización fisiológica (temperatura corporal, la frecuencia respiratoria) son requisitos indispensables.

1. Generación de hueso de médula de ratón derivados de células dendríticas

1. Extraer células de médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones como se describió previamente ^12. Este protocolo se remonta a 1992 ¹³ y fue descrito originalmente por el grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descubridor de la célula dendrítica ^14.
2. Brevemente, se extrae la tibia y el peroné poco después de sacrificar los ratones. Trabajando bajo la campana de flujo laminar (para evitar la contaminación microbiana), enjuagar la médula ósea en una pequeña placa de Petri con medio de lavado (5% de FBS, HEPES 1% de penicilina / estreptomicina y 1% en RPMI) ^12.
3. Transferir la suspensión celular a través de una estra célulainer (100 micras de malla, nylon) en un tubo de centrífuga estéril de 50-ml con el fin de retirar el hueso y el tejido sobrante. Después de varias etapas de lavado y un ¹² lisis de paso, contar las células viables usando azul de tripano y un hemocitómetro a.
4. Volver a suspender las células de médula ósea a una concentración de 400.000 células ml ^-1 en medio de cultivo (RPMI suplementado con FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, HEPES 1% y 1% de L-glutamina) que contenía 75 ng ml ^-1 del ratón granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias (MGM-CSF) obtenido a partir de sobrenadantes de 293FT células HEK transfectadas con un plásmido GMCSF ratón. Transferir 10 ml de suspensión celular (4 x 10 ⁶ células) en placas Petri (100 mm x 20 mm) y se incuban en una incubadora de CO ₂ (37 ° C, 5% de CO _2). El día 3, reponer el medio viejo con 10 ml de medio fresco (manteniendo la concentración final de mGM-CSF a 75 ng ml ^-1). El día 6, eliminar 10 ml de medio viejo y reponercon 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 75 ng ml ^-1). El día 8, eliminar 10 ml de medio viejo y reponer con 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 150 ng ml ^-1).
5. El día 10, el DC madurar diferenciada con 1 mg ml ^-1 lipopolisacárido (LPS) durante 24 horas.

2. El marcaje de las células dendríticas con ¹⁹ F-partículas ricas

1. Durante la etapa de maduración hr 24 (1,5), la etiqueta de la DC con 1 mM flúor-rico perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) partículas (500-560 nm) también durante 24 horas. Preparar grandes partículas marcadas con flúor por emulsificación de PFCE en Pluronic F-68 (volumen total 2,5 ml) utilizando un sonotrodo celular interrumpiendo titanio y empleando un programa de pulso continuo (100% de amplitud, potencia = 250 W) durante 60 seg.
2. Después de las etapas de incubación anteriores, cosechar el maduro y flúor etiquetados-DC usando un raspador de células de cultivo de tejidos, transferencia en un tubo de centrífuga de 50-ml y centrifugara 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Para lavar cualquier partícula de restos y células muertas, deje células recolectadas a adherirse en poli-L-lisina platos. Para prepararse para este paso, capa placas de Petri con poli-L-lisina (1 mg ml ^-1) a 37 ° C durante 1 hora, después lavar el no unido poli-L-lisina con PBS.
4. Incubar por encima de las células cosechadas en las placas de poli-L-lisina en medio libre de suero y permitir que las células se adhieran (1 hora a 37 ° C, 5% CO _2).
5. Lavar el medio para desechar las células no adheridas, partículas restantes y las células muertas y se lava tres veces con pre-calentado (37 ° C) PBS.
6. Cosecha de células adherentes por la tripsina-EDTA tratamiento (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubación a 37 ° C).
7. Después de otro paso de centrifugación lavado, resuspender la cantidad requerida de DC maduras en suero libre de PBS estéril.
8. Para determinar si las células han sido correctamente etiquetada, se recomienda comprobar la physicocheMical características de las células por medio de citometría de flujo (FACS). La dispersión lateral (SSC) debería revelar un aumento de la granularidad en estas células, como se ha descrito previamente ^11. Debe también tenerse en cuenta que los fibroblastos pueden contaminar los cultivos de corriente continua y también podría llevar hasta los ¹⁹ partículas F en paralelo. Por lo tanto la pureza DC debe evaluarse (por la medición del porcentaje de CD11c ⁺ CD11b ⁺ células usando FACS) antes de la aplicación in vivo.

3. Aplicación in vivo de ¹⁹ F-etiquetados células dendríticas

1. Administrar DC (06 ^10-julio 10) en un volumen de 50 a 100 l intracutánea en las extremidades traseras de un ratón C57BL / 6 colocando el ratón en un soporte y cuidadosamente inserción de una aguja G 26 ½ en las capas superiores de la piel antes de la aplicación (uso jeringas de tuberculina 0,5 ml con agujas permanentemente conectados a reducir al mínimo el volumen muerto). Para asegurar unan aplicación intracutánea adecuado, es importante que la parte insertada de la aguja sea parcialmente visible debajo de la piel. Si la aguja no es ya visible, la aguja se ha insertado demasiado profundo en las capas de la piel. Para el individuo no entrenado, la aplicación intracutánea podría realizarse bajo anestesia.
2. Imagen de los miembros de flúor en vivo ⁽¹⁹ F) / protón ⁽¹ H) MRI (véase la sección siguiente) 21 hr inyección siguiente.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H resonancia magnética

Las instrucciones detalladas para la configuración de las exploraciones de RM se refieren a un escáner Bruker MR utilizando el software de control Paravison (versión 5.1). Los nombres que se refieren a las funciones específicas de los proveedores y los elementos se han destacado en letra cursiva. Para otros escáneres MR estos pasos pueden tener que ser ajustados de acuerdo con las directrices de los fabricantes.

1. Organizar el acceso a un dedicadoanimal pequeño MR escáner. Para una calidad de imagen adecuada, un sistema con una intensidad de campo magnético de 9,4 Tesla o más y adaptado de bobinas de radiofrecuencia (por ejemplo, ¹ H / F ¹⁹ de doble bobina de RF sintonizable volumen, 35 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud; Rapid Biomed, Würzburg, Alemania) se recomiendan.
2. Antes de la resonancia magnética, preparar la instalación del escáner MRI para anestesia y monitorización fisiológica. Asegúrese de que la máscara de respiración del animal cama / soporte está conectado al sistema de isoflurano y que la sonda de temperatura y la almohadilla de respiración están conectados a un sistema animal de monitorización remota (por ejemplo, modelo 1025, SA Instruments Inc., Nueva York, EE.UU.). Este último sirve para monitorizar los parámetros vitales del animal, tales como la temperatura del cuerpo y la respiración.
3. Anestesiar a ratones por narcosis por inhalación usando una cámara de ratón conectado a un sistema de isoflurano. Ajuste el caudal de aire y O ₂ a 0,2 L min ^-1 y 0,1 L min ^-1, respectivamentey 3% de isoflurano (ajustar de un vaporizador) por alrededor de 2 min hasta que el nivel deseado de anestesia se alcanza (no pellizco respuesta dedo siguiente). Las tasas óptimas de flujo puede variar dependiendo de la configuración que se utiliza. Tenga en cuenta que las altas tasas de flujo puede conducir a la deshidratación. Monitoreo cuidadoso de las condiciones de los animales se requiere en todo momento como se mencionó anteriormente.
4. Coloque el ratón boca abajo en la cama ratón / titular del animal pequeño MR escáner (Figura 1).
5. Mientras se mantiene la velocidad de flujo de aire y O ₂ constante, ajustar el vaporizador de isoflurano al 0,8 - 1,5% hasta un patrón de respiración óptima se alcanza. Una frecuencia respiratoria de 50 a 70 respiraciones por minuto se recomienda.
6. Mantener la temperatura corporal a 36-37 ° C durante el experimento mediante el empleo de un agua caliente (o alternativamente aire caliente) sistema de circulación.
7. Mantener los ojos del ratón húmedo con ungüento lubricante estéril ojo durante la medición.
8. Después de asegurar que el animalen el soporte de imágenes y las conexiones con el sistema de supervisión, mover el soporte hasta el centro de la ¹ H / ¹⁹ F bobina de RF (que se coloca en el isocentro del imán escáner animal).
9. Ajuste de la posición del ratón de tal manera que la rodilla se encuentra dentro del isocentro del imán, ya sea con un método automatizado (por ejemplo, utilizando un láser de posicionamiento en combinación con un soporte de animales accionado por motor) o manualmente por el cálculo de la distancia del soporte necesita ser movido en el imán para alcanzar el isocentro.
10. Para confirmar la correcta colocación del animal en el escáner y la posterior planificación de la geometría de corte de imagen (es decir, tamaño, posición y rotación en el espacio), adquirir explorar imágenes en tres orientaciones estándar (axial, coronal, sagital) utilizando la imagen de resolución rápida y de bajo métodos de adquisición (por ejemplo TriPilot protocolo, que utiliza una secuencia de pulsos FLASH).
11. Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia ¹ H (por ejemplo,. 400,1 MHz para 9,4 T) y a la frecuencia de resonancia F ¹⁹ (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y recepción de la señal.
12. Realizar los ajustes necesarios automáticas del sistema, incluyendo cuñas para ajustar la homogeneidad del campo magnético (por ejemplo ADJ_SHIM), los ajustes del sistema de frecuencia para sintonizar la RF a la frecuencia de Lamor el ratón (por ejemplo ADJ_SF) y la ganancia de referencia para ajustar la amplitud de RF ( por ejemplo ADJ_REFG). Todos estos parámetros son importantes para hacer que los campos magnéticos estáticos y variables (B _0, B ₁₎ en la región de interés lo más homogénea posible.
13. Adquirir un segundo conjunto de imágenes Scout (como anteriormente) a lo largo de las tres orientaciones ortogonales, después de ajustar el campo de visión (FOV) de tal manera que los dos miembros inferiores are visible desde la pelvis hasta los pies (LxAxH = 50x25x25 mm). Estas imágenes sirven para planificar las orientaciones de los últimos scans 3D F ¹ H / ^19.
14. Establecer un protocolo TurboRARE 3D por ¹ H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Factor RARE = 16 (. Aprox tiempo de exploración de 60 min). Ajustar FOV con la ayuda de las imágenes de scouts, inicie el escaneo (semáforo).
15. Carga de un solo pulso FID-secuencia con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Scan Editar y establecer núcleo a ¹⁹ F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas.
16. Iniciar la medición sin el registro de datos para mostrar una señal de RM en tiempo real mediante el uso de GSP (ir de configuración). Si la señal F ¹⁹ espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta un SIgnal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica con el fin de centrar el pico espectral F ¹⁹ a 0 Hz en la ventana de adquisición. Aplicar frecuencia básica y pulse Stop. Tenga en cuenta que el isoflurano utiliza como anestesia puede generar una señal de fondo. A 9,4 Tesla MRI del desplazamiento químico entre los ¹⁹ que contienen F-partículas y el isoflurano es de aproximadamente 1.800 Hz. Asegúrese de que el ancho de banda de excitación es menor que 3.600 Hz para evitar la emocionante junto con isoflurano las células ^F-19 marcadas o partículas. La frecuencia básica debe establecerse correctamente en la señal generada por las células ^F-19 marcadas. Alternativamente, otro método de la anestesia podría ser utilizado como el experimentador crea conveniente.
17. Clone (duplicar) el protocolo TurboRARE 3D desde el anterior análisis ¹ H. Vaya a Edición Método y anule la selección de la ganancia automática de referencias (como el anterior). Set ¹⁹ F núcleo de Edit Scan. Cambiar la matriz de 128x64x64y el. RARAS Factor de por lo menos 40 (hasta 64) Para una mseg TR / TE 1000/6 y 64 promedios, el tiempo de ciclo es de aproximadamente 70 min. Ajuste la ganancia del receptor al 101 (caja de herramientas) e inicie el escaneo sin necesidad de ajustes adicionales utilizando GOP (ir pipeline).
18. Cuando los análisis terminado retraer el soporte de ratón desde el escáner de MR. Desconectar el ratón cuidadosamente del soporte. Si el ratón no se sacrifica para el análisis ex vivo (por ejemplo, la histología o la espectroscopia, ver más abajo) directamente después de las mediciones RM, vigilar de cerca hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Regulación de la temperatura del cuerpo se ve afectado por la anestesia, así que durante el proceso de recuperación, poner el ratón en una jaula separada que se coloca en una tibia de temperatura regulada almohadilla. Una vez que el ratón se ha recuperado totalmente de la anestesia, devolverlo a su jaula explotación ya la sala de animales.
19. Para superponer las ¹⁹ imágenes de F a H ^{1 imagenes,} utilice el menú Ver opción en el mismo software (Paravison). La función Underlay se puede encontrar bajo correlativas. Guarde el documento de base, cargar la nueva imagen y destacar la capa F ^19, definiendo un nuevo color de la tabla de consulta. Para discriminar entre los ¹⁹ F y ¹ exploraciones H, alterar el umbral para el color seleccionado (corte tabla de consulta) de tal manera que la señal F ¹⁹ tendrá el color elegido y el fondo ¹ H imagen permanecerá en escala de grises. Otros programas de post-procesamiento (por ejemplo, ImageJ) están disponibles para crear las ¹ H / F ¹⁹ superposiciones de imágenes.
20. En caso de una cuantificación in vivo de la señal F ¹⁹ ser necesario, siga un protocolo simple cuantitativo como se ha descrito anteriormente ^15,16. En breve, la cuantificación puede realizarse mediante la colocación de un tubo de referencia con una concentración conocida de PFCE-Emulsión dentro del FOV al lado del ratón. Tras la adquisición de las imágenes de RM, quantificar las intensidades de las señales ¹⁹ F usando región de interés (ROI) y comparar con la curva de calibración en vitro como se muestra en la Figura 2.

5. Nodo linfático Espectroscopia de Resonancia Magnética (MRS)

1. Después de sacrificar el ratón, quite el ganglio linfático poplíteo y el lugar en un pequeño tubo de RMN de 5 mm y añadir 100 ml de 2% PFA.
2. Instalar una bobina F ¹⁹ espectroscopía (por ejemplo, una bobina toroidal) que tiene una abertura de al menos 5 mm para sujetar el tubo de RMN que contiene el ganglio linfático.
3. Colocar el tubo de RMN en el interior de la bobina y mover la bobina en el isocentro del imán.
4. Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia F ¹⁹ (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y la señalrecepción.
5. Establezca todos los parámetros calza dentro de la caja de herramientas Nivelación a 0 y pulse Aplicar. Normalmente no es necesario aplicar métodos Shimming ya que el volumen de la muestra es relativamente pequeña. Si una señal suficiente ¹⁹ F está disponible, los métodos automatizados se puede aplicar para la frecuencia calzando sistema, y la ganancia del receptor como se describió anteriormente.
6. Carga de un solo pulso secuencia FID con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Editar Scan y establecer el núcleo a ¹⁹ F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas. Establecer el número de promedios a 1.
7. Inicie la secuencia utilizando SGP. Si la señal F ¹⁹ espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta que una señal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica a fin de que la ¹⁹ F espeCtral pico está en el centro de la ventana de adquisición en 0 Hz y aplicar frecuencia básica. Ajuste el atenuador de pulso de nuevo para maximizar la señal, para llegar a 90 ° excitación. Cuando la señal es en la parada máximo de la máquina.
8. Establecer los promedios en el método de edición entre 64 y 256 (o más si es necesario, dependiendo de la señal) y comenzar la adquisición utilizando GOP. La señal detectada se correlaciona linealmente con el número de promedios. Durante cuantificación tener en cuenta que la señal detectada debe ser normalizado a uno promedio. Además, un estándar de calibración de una concentración conocida o una curva de calibración es necesario calcular el número de células a partir de la señal normalizada F ¹⁹ (Figura 2).
9. Una vez que la exploración haya terminado, retire la muestra, coloque la siguiente muestra y continúe con el paso 5.3.

Representative Results

Dieciocho a veintiún horas después de la aplicación intracutánea, ¹⁹ F-etiquetados células dendríticas (DC) migran hacia el ganglio linfático poplíteo de drenaje. El movimiento de DC a través de los conductos linfáticos en el ganglio linfático de drenaje politeal puede ser apreciado por una superposición de las imágenes ¹ H anatómicas con las imágenes ¹⁹ F CC (Figura 2A). Hemos reportado previamente en la migración de estas células in vivo, así como el impacto de la ^F-19 de tamaño de partícula en DC inmunobiología, incluyendo la eficiencia de absorción ^11. Con el fin de cuantificar la magnitud de la migración de CC en los ganglios linfáticos, se extraen los ganglios linfáticos de drenaje y realizar ¹⁹ F MRS (figura 2B). Cuando se compara la señal F ¹⁹ obtenido de cada ganglio linfático con la señal F ¹⁹ obtenido a partir de diferentes números de DC etiquetados con las mismas partículas PFCE (curva de calibración, la Figura 2C) podemos deducirel número de ¹⁹ F marcado con DC que alcanzar el ganglio linfático de drenaje. En el experimento representativo se muestra en las Figuras 2A y 2B, se puede deducir que 3,6 x 10 ⁵ antígeno-cargado DC alcanzado el nodo linfático derecho, mientras que 7,5 x 10 ⁴ DC que no se han cargado con el antígeno alcanzado el nodo linfático derecho.

Figura 1. Posición del ratón en el soporte de ratón del animal pequeño escáner de MR.

Figura 2. La cuantificación de ¹⁹ F marcado con la migración de DC in vivo utilizando ¹⁹ F MRS. (A) DC fueron marcadas con 1 mM 560 nm PFCE particl es, cargado con (derecha) o sin (izquierda) y el antígeno administrado intracutánea en las extremidades posteriores. Ovoalbúmina de pollo (OVA) se empleó como antígeno; OVA se incubó con el DC junto con las partículas ¹⁹ F. Las células dendríticas se muestran como ¹⁹ MR señal F (rojo), mientras que los ganglios linfáticos y los conductos linfáticos se muestran en la imagen anatómica ¹ H MR (escala de grises). Las imágenes fueron adquiridas con un ¹⁹ F / ¹ birdcage H volumen de doble resonador sintonizable. (B) Los ganglios linfáticos de ratón se muestra en A se extrajeron y se colocaron en un tubo de RMN. La señal F ¹⁹ se midió por ¹⁹ F MRS (véase el texto Protocol) y la amplitud se calculó mediante la realización de una transformación rápida de Fourier (FFT) de la decadencia de inducción libre adquirida (FID). (C) Durante un período de 24 h, diferente cantidades de DC fueron etiquetados con 1 mM de 560 nm partículas PFCE y ^{19 de} señal F se midió por ¹⁹ F MRS como en B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Discussion

Este método de emplear ¹⁹ F / ¹ H RMN para seguir el desplazamiento de CC en el nodo de linfa ofrece la oportunidad de estudiar los patrones de migración de las células inmunes in vivo. Las células dendríticas son excelentes ejemplos de la rápida migración de las células inmunes que son capaces de maniobrar a través de las estructuras tridimensionales sin fuertemente adherido a sustratos específicos ^17. Aunque la baja resolución espacial (rango de micras) de la técnica descrita no es comparable con la alta resolución (rango de nM) que se puede lograr con microscopía multifotónica, con esta técnica todavía es posible para estudiar la naturaleza de la migración celular in vivo y más un período de tiempo más largo. Además, la microscopía tiene una penetración de profundidad limitada y un campo de visión limitado, lo que actualmente no aptas para áreas de imagen grandes dentro de un organismo vivo.

Debido a la no invasividad de la técnica, es posible lunitor la migración de células inmunes durante varios días sin sacrificar el ratón después de la investigación. Otra ventaja de la técnica es la posibilidad de superponer las imágenes de F ¹⁹ que capturan las células que migran con anatómicas ¹ exploraciones H, lo que permite una localización precisa de las células en el organismo vivo. Esta técnica nos permitirá estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la migración DC. A diferencia típica en los ensayos de migración in vitro, este método permite el estudio de la migración de células en un entorno 3D fisiológica.

La aplicación potencial de ¹⁹ F en MRS y la RM han sido reconocidos ^7,18. La elevada proporción giromagnética, spin y abundancia isotópica natural hace ¹⁹ F en un candidato ideal para la RM ^7. Además, la similitud entre ¹⁹ F y H ¹ (con respecto a sus propiedades RMN) es un requisito previo para obtener una superposición significativa entre tél anatómica 1H RMN con los ¹⁹ F de resonancia magnética de células marcadas. De hecho, una ventaja de ¹ H / F ¹⁹ MRI sobre otros núcleos MRI ¹ H / X es que el resonador RF mismo puede ser utilizado tanto para ¹⁹ F y ¹ H núcleos. En la mayoría de las aplicaciones utilizadas para ¹⁹ F / ¹ H RMN, un volumen del resonador se emplea que puede ajustarse tanto a ¹⁹ F y H. ¹ Debido a la casi idéntica B ₁ campo para ambos canales, una transferencia de ajustes de potencia desde el canal ¹ H (que es más fácil de medir) para el canal F ¹⁹ es por lo tanto posible.

Un factor importante a considerar al etiquetar las células con partículas de cualquier tamaño (de ultra pequeño a grande de tamaño micro partículas) es el potencial de la manipulación biológica y la toxicidad. Recientemente hemos demostrado que al aumentar el tamaño de las partículas de etiquetado, que podría promover el estado de maduración de DC ^11. Una posibleexplicación de nuestro hallazgo es la preponderancia de partículas mayores de 500 nm a ser absorbidos por fagocitosis en lugar de endocitosis ^19, el mecanismo de captación de ex definir la naturaleza de DC. Otras características físicas (por ejemplo, forma de partícula y la topología de la superficie) también podría alterar la función biológica de las células marcadas y también se debe considerar cuidadosamente ^20. Para cualquier configuración dada experimental que requiere el etiquetado de DC con partículas, por lo que es altamente recomendable que los típicos ensayos de biología celular se realizan en paralelo para el experimento para determinar / excluir cualquier influencia de las partículas sobre las propiedades biológicas de estas células. Existen varios análisis se puede realizar, según el estudio experimental en cuestión. Para excluir una influencia sobre la maduración de DC, las mediciones de marcador de superficie celular (por ejemplo, CD80, CD86) por la expresión de FACS se recomienda. Para excluir una influencia en la captación y presentación de antígenos, exper fagocitosismentos y los experimentos de facilitación de células T, respectivamente, se recomienda. En el caso de los experimentos de migración, la expresión de quimioquinas (CC), los receptores (tales como CCR7) e in vitro los ensayos de migración se recomiendan.

Aunque ¹⁹ F / ¹ H RMN es muy prometedora para el estudio de la migración celular en particular con fines clínicos, en la actualidad hay una serie de limitaciones. Estas incluyen (i) una resolución espacial que se opone a la visualización directa de las células individuales, (ii) insuficiente sensibilidad F ¹⁹ (límite de detección de varios 10 ⁵ células dentro de una ROI), (iii) aumento de las duraciones de exploración como resultado de un aumento promedio para compensar para la limitación anterior, (iv) una serie limitada de ¹⁹ F resonadores de RF en el mercado y (v) posible de fondo no deseados ¹⁹ de señal F por otros elementos que contienen flúor tales como isofluorano y politetrafluoroetileno (PTFE) dentro de los componentes de hardware (MRpor ejemplo, condensadores y cables de conexión).

Además de factores tales como la intensidad del campo magnético y los puntos fuertes de gradiente, un determinante principal que dicta el nivel de resolución espacial es la sensibilidad de la frecuencia de radio (RF) utilizado resonador ^21. Resolución MRI está estrechamente relacionada con la relación de señal-a-ruido (SNR) ²¹ y sobre la reducción de tamaño de vóxel para amplificar la resolución espacial, una pérdida en SNR es de esperar. Una forma de aumentar la resolución espacial sin comprometer la sensibilidad de la señal es el empleo de bobinas criogénicamente enfriados que aumentan la SNR mediante la reducción de ruido térmico ^22. Con la ayuda de una bobina de cabeza 1H que utiliza un sistema criogénico, recientemente se pudo visualizar infiltrados celulares en la encefalomielitis autoinmune experimental después de usar un avión en la resolución de (35x35) micras ^{2 23.} La aplicación de esta tecnología criogénicamente enfriado para ¹⁹ F / ¹ H RMN sería una optunidad para superar algunas de las limitaciones asociadas con la detección de MRI de la señal celular y resolución.

Una cuestión importante en el seguimiento in vivo de las células por RM es la cuantificación de estas células en un lugar particular dentro de un organismo vivo. Para ello, es posible llevar a cabo ¹⁹ F MRS (ver 5.1 hasta 5.9). Mediante el empleo de curvas de calibración que se obtienen de ¹⁹ F medidas de MRS de diferentes números de DC ¹⁹ F-etiquetados, es posible deducir el número de células que llegan al nodo de linfa. Las medidas de MRS ¹⁹ F de los ganglios linfáticos puede ser comparada con la curva de calibración ¹⁹ F MRS DC. Además, al comparar los datos de MRS de las curvas de calibración de CC celulares con el PFCE puro, se puede deducir que es posible detectar aproximadamente 10 ^{13 19} F giros por célula después de etiquetado. De acuerdo con los principios de MR, el límite más bajo de detección es de 10 ¹⁸ giros por voxel ²⁴. Por lo tanto, podemos asumir que somos capaces de detectar un número mínimo de 10 ⁵ DC por vóxel con un 9,4 T MRI.

En resumen, el protocolo que se describe aquí es beneficioso para las investigaciones in vivo que estudian la migración celular durante los procesos fisiopatológicos. La invasividad de la técnica permite estudios longitudinales sin la necesidad de sacrificar un gran número de animales; la capacidad de superponer F ¹⁹ imágenes de las células marcadas en ¹ H imágenes anatómicas promueve seguimiento óptimo y altamente selectiva de las células que migran, y proporciona ¹⁹ F MRS una oportunidad de estimar el número de células de localización para áreas anatómicas específicas in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-glutamine	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Petri dishes (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G syringes	VWR, Germany	612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh)	VWR, Germany	734-0004
NMR tubes	VWR, Germany	634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools	FST
CO2 incubator	Binder
Small animal MR system	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil	Rapid Biomed, Würzburg, Germany		35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil	in-house		tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system	Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA