Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251

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Helmar Waiczies^1,2, Martin Guenther^1,2, Julia Skodowski^1,2, Stefano Lepore^1,2, Andreas Pohlmann², Thoralf Niendorf^1,2, Sonia Waiczies^1,2

¹Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, ²Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Rastreamento de células usando MRI ganhou notável atenção nos últimos anos. Este protocolo descreve a marcação das células dendríticas com flúor (

Abstract

Avanços contínuos nos métodos de imagem não invasivos, como a ressonância magnética (RM) tem melhorado muito a nossa capacidade de estudar os processos fisiológicos ou patológicos em organismos vivos. MRI também está provando ser uma ferramenta valiosa para capturar células transplantadas in vivo. Estratégias de rotulagem de células iniciais para utilização de agentes de contraste de MRI que influenciam os tempos de relaxação de RM (T1, T2, T2 *) e conduzem a um acessório (T1) ou depleção (T2 *) do sinal onde células marcadas estão presentes. T2 * agentes de melhoramento tais como ultrasmall agentes de óxido de ferro (USPIO) foram utilizados para estudar a migração de células e alguns têm sido aprovados pela FDA para uso clínico. A desvantagem de T2 * agentes é a dificuldade de distinguir a extinção do sinal criado pelas células rotuladas de outros artefatos, como coágulos de sangue, micro hemorragias ou bolhas de ar. Neste artigo, descrevemos uma técnica emergente para as células de monitoramento in vivo quebaseia-se na marcação das células com flúor ^(19F) ricos em partículas. Estas partículas são preparadas por emulsão de perfluorocarbono compostos (PFC) e, em seguida, utilizado para as células de etiqueta, que, posteriormente, pode ser visualizada, por ¹⁹ F RM. Vantagens importantes de PFC para o rastreamento de células in vivo incluem (i) a ausência de carbono ligado a ¹⁹ C, in vivo, o que proporciona então as imagens de fundo e livres de células completo selectivityand (ii) a possibilidade de quantificar o sinal de células por ¹⁹ F MR espectroscopia .

Introduction

O rastreamento de células in vivo é um aspecto crucial em vários campos da biomedicina. Para isso, as técnicas de imagem não invasivas, que pode selectivamente células localizam ao longo de um período de tempo são extremamente valiosos. Antes do desenvolvimento de tridimensional ressonância magnética (IRM), o seguimento da migração de células imunitárias foi limitado a análises microscópicas ou biópsias de tecidos. Rastreamento celular com a ajuda da ressonância magnética ganhou imensa atenção nos últimos anos, não só para estudar o comportamento de células imunologistas imune in vivo, mas também para investigadores clínicos e de células estaminais. Durante meados dos anos 90, os primeiros estudos sobre as nanopartículas de óxido de ferro ¹ iniciada uma cascata de acontecimentos para as células de rastreamento com ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro reduzir o tempo de relaxamento MR (T2 *) das células marcadas e, assim, causar depleção de sinal em imagens por ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro têm sido empregadas para rotular macrófagos ^2, oligodendrocyte progenitors ³ e muitos outros tipos de células. Algumas destas partículas também têm sido clinicamente aprovado pela FDA para a rotulagem de vacinas celulares em pacientes com melanoma ^4. Desde in vivo ou ex vivo de células rotulagem com partículas de óxido de ferro se baseia em um encurtamento do sinal T2 *, a qual pode ser também provocada por in vivo relacionados com susceptibilidade T2 * efeitos, tais como micro-hemorragias, depósitos de ferro ou bolhas de ar, pode ser difícil de identificar células marcadas in vivo a partir de outro fundo T2 * extinções de sinal ^5.

Neste artigo, descreve uma técnica para rastrear as células dendríticas (DC), in vivo, através do emprego de ¹⁹ F / ¹ A imagiologia por ressonância magnética (MRI). Esta tecnologia de rastreamento de celular só foi introduzido em 2005, ⁶ anos após as primeiras aplicações reconhecidas para ¹⁹ F em MRI foram notificados ^7. Uma adva importantentage de ¹⁹ F sobre óxido de ferro marcação celular partícula é a baixa ocorrência biológica de ¹⁹ F no tecido, o que torna possível rastrear células muito seletiva com imagens, basicamente, background-livres. Além disso, é possível sobrepor a F sinal MR ¹⁹ a partir de células marcadas transplantados com imagens anatómicas obtidas a partir de ressonância magnética convencional 1H. ^19F / ¹ H RM é, assim, bastante relevante para os estudos que investigam a migração de células in vivo. As células estudadas com este método são etiquetados com ^19-F de partículas ricas. Perfluorocarbonetos sinteticamente derivados (PFC) que consistem principalmente de carbono e átomos de flúor são normalmente usados ​​para preparar as partículas. Estes compostos são insolúveis em água e devem ser emulsionados antes da aplicação in vitro ou in vivo. O tamanho habitual das partículas do PFC que tenham sido utilizados por outros grupos para in vivo de ¹⁹ experiências de acompanhamento F-RMvaria entre 100 nm e 245 nm ^6,8-10. Temos, porém, que a eficiência de marcação das células dendríticas com perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas aumenta com o aumento do tamanho de partícula (> 560 nm) ^11.

Protocol

Todos os procedimentos com animais devem ser aprovados pelo comitê institucional local, bem-estar animal antes da execução. Durante as medições MR um nível adequado de anestesia e de monitorização fisiológica (temperatura corporal, freqüência respiratória) são requisitos indispensáveis.

1. Geração de Rato derivadas da medula óssea células dendríticas

1. Extrair as células da medula óssea de ratinhos C57BL / 6, como previamente descrito ^12. Esse protocolo remonta a 1992 e ¹³ foi originalmente descrito por um grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descobridor da célula dendrítica ^14.
2. Resumidamente, extrai tíbia e fíbula logo após sacrificar ratinhos. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar (para evitar a contaminação microbiana), lave a medula óssea em uma pequena placa de Petri com meio de lavagem (5% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% HEPES em RPMI) ^12.
3. Transferência da suspensão de células através de uma célula de estrainer (tamanho de malha de 100 um, de nylon) em um tubo de centrífuga estéril de 50 ml, a fim de remover restos de osso e tecido. Depois de várias etapas de lavagem e uma de ¹² etapas de lise, a contagem das células viáveis ​​utilizando azul de tripano e um hemocitômetro.
4. Ressuspender as células da medula óssea a uma concentração de 400.000 células ml ^-1 em meio de cultura (RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de HEPES e 1% de L-glutamina) contendo 75 ng ^{mL-1 de} rato de granulócitos macrófago factor estimulante de colónias (mGM-CSF), obtida a partir de sobrenadantes de células HEK 293FT transfectadas com um plasmídeo de GMCSF rato. Transferem-se 10 ml de suspensão de células (4 x 10 ⁶ culas) em placas de Petri (100 mm x 20 mm) e incubadas num incubador de _CO2 (37 ° C, 5% de CO _2). No dia 3, reabastecer meio de idade com 10 ml de meio fresco (mantendo a concentração final da MGM-CSF em 75 ng ml ^-1). No dia 6, remover 10 ml do meio velho e reconstituircom 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 75 ng ml ^-1). No dia 8, remover 10 ml do meio velho e reabastecer com 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 150 ng ml ^-1).
5. No dia 10, a amadurecer diferenciada CC com 1 ug ^mL1 lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 horas.

2. Marcação de células dendríticas com ¹⁹ Partículas F-ricos

1. Durante a etapa de maturação 24 hr (1,5), com o rótulo do CD 1 mM de flúor rico perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas (500-560 nm), também por 24 hr. Prepara grandes partículas flúor-rotulados por emulsionar PFCE em Pluronic F-68 (volume total de 2,5 mL) utilizando uma célula de desregulação sonotrodo titânio e empregando um programa de pulso contínua (100% de amplitude, potência = 250 W) durante 60 segundos.
2. Após os passos de incubação acima, recolher o DC maduras e flúor marcado utilizando um raspador de células de cultura de tecidos, a transferência para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugara 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Para lavar as partículas de sobra e células mortas, deixa as células colhidas a aderir em pratos de poli-L-lisina. Para se preparar para este passo, placas de Petri com revestimento de poli-L-lisina (1 mg ^mL-1) a 37 ° C durante 1 hora, em seguida lavar o não ligado a poli-L-lisina com PBS.
4. Incubar as células colhidas de cima das placas de poli-L-lisina em meio isento de soro e permitir que as células a aderir (1 hr a 37 ° C, 5% de CO _2).
5. Lavar o meio para descartar as células não aderentes, as partículas remanescentes e células mortas e lavar três vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS.
6. Colheita de células aderentes por um tratamento tripsina-EDTA (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubação a 37 ° C).
7. Seguindo um outro passo de centrifugação de lavagem, ressuspender a quantidade necessária de CD maduras no soro livre de PBS estéril.
8. Para determinar se as células foram marcadas com êxito, é recomendado verificar a physicochemicos características das células por citometria de fluxo (FACS). A dispersão lateralmente (SSC) deve revelar um aumento na granularidade nestas células, como previamente descrito ^11. Deve também ser mantido em mente que os fibroblastos podem contaminar as culturas DC e também pode assumir as partículas ¹⁹ F em paralelo. Por conseguinte, o grau de pureza DC devem ser avaliados (por medição da percentagem de células CD11c ⁺ CD11b ⁺ utilizando FACS) antes da aplicação in vivo.

3. Aplicação in vivo de ¹⁹ F-marcadas Células Dendríticas

1. Administrar DC (junho ^{10 -} julho 10) num volume de 50-100 ul intracutaneamente nos membros posteriores de um ratinho C57BL / 6, posicionando o rato num suporte e cuidadosamente inserindo uma agulha G 26 ½ nas camadas superiores da pele antes da aplicação (uso de seringas de 0,5 ml de tuberculina com agulhas permanentemente conectados para minimizar volume morto). Para garantir umn aplicação intradérmica apropriada, é importante que a parte inserida da agulha seja parcialmente visível por baixo da pele. Se a agulha não é mais visível, a agulha foi inserida demasiado profunda nas camadas da pele. Para o indivíduo não treinado, a aplicação intradérmica pode ser realizada sob anestesia.
2. Imagem membros por em flúor vivo ⁽¹⁹ F) / prótons ⁽¹ H) MRI (veja a próxima seção) 21 horas após a injecção.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H Ressonância Magnética

As instruções detalhadas para configurar os exames de RM referem-se a um scanner MR Bruker usando o software de controle Paravison (versão 5.1). Nomes referentes a funções e itens específicos do fornecedor foram destacadas em itálico. Para outros scanners MR estes passos pode ter de ser ajustada de acordo com as orientações dos fabricantes.

1. Organizar o acesso a um dedicadopequeno scanner de ressonância magnética animal. Para qualidade de imagem adequada, um sistema com uma intensidade de campo magnético de 9,4 Tesla ou mais e bobinas de radiofreqüência sob medida (por exemplo, ^um H / ¹⁹ F bobina dupla ajustável volume de RF, 35 mm de diâmetro interno, 50 mm de comprimento; rápida Biomed, Würzburg, Alemanha) são recomendados.
2. Antes de ressonância magnética, preparar a instalação do aparelho de ressonância magnética para anestesia e monitorização fisiológica. Assegure-se que a máscara respiratória do leito / detentor animal é ligado ao sistema de isoflurano e que a sonda de temperatura e uma almofada de respiração está conectado a um sistema de monitorização remota de animais (por exemplo, Modelo 1025, SA Instruments Inc., Nova Iorque, EUA). Este último serve para monitorar os parâmetros vitais do animal, tais como a temperatura do corpo e da respiração.
3. Anestesiar ratos narcose por inalação através de uma câmara de mouse conectado a um sistema de isoflurano. Ajustar o fluxo de ar e O ₂ em 0,2 L min ^-1 e 0,1 L min ^-1, respectivamentee 3% de isoflurano (ajustados a partir de um vaporizador) durante cerca de 2 min, até que o nível desejado de anestesia é alcançado (sem resposta seguinte pitada tep). Taxas de fluxo óptimas podem variar dependendo da configuração que está sendo usado. Esteja ciente de que altas taxas de fluxo pode levar à desidratação. A monitorização cuidadosa das condições dos animais é necessária em todos os momentos, como mencionado acima.
4. Posicione o mouse propenso na cama mouse / detentor do pequeno animal MR scanner (Figura 1).
5. Mantendo a taxa de fluxo de ar constante e S _2, ajustar o vaporizador isoflurano para 0,8-1,5%, até um padrão de respiração óptima é alcançada. Recomenda-70 respirações por min - A freqüência respiratória de 50.
6. Mantenha a temperatura do corpo a 36-37 ° C durante o experimento, empregando uma água morna (ou, alternativamente, ar quente) sistema de circulação.
7. Mantenha os olhos do úmido mouse com estéril olho pomada lubrificante durante a medição.
8. Depois de garantir que o animalno suporte de imagem e as ligações ao sistema de monitorização, mova o suporte para o centro do ¹ H / ¹⁹ F ampliada da bobina (que está posicionado no isocentro do íman scanner para animais).
9. Definir a posição do rato de modo que o joelho encontra-se dentro do isocentro do íman, ou com um método automático (por exemplo, usando um laser de posicionamento combinado com um suporte de animais motorizado) ou manualmente, por meio do cálculo da distância do suporte precisa ser movido para o íman para atingir o isocentro.
10. Para confirmar o posicionamento correto do animal no scanner e, posteriormente, o planejamento da geometria fatia de imagem (ou seja, tamanho, posição e rotação no espaço), adquirir explorar imagens em três orientações padrão (axial, coronal, sagital), utilizando resolução de imagem rápida e de baixo métodos de aquisição (por exemplo, protocolo TriPilot, que usa uma seqüência de pulsos flash).
11. Ajustar a bobina RF ao H frequência de ressonância ¹ (p.ex.. 400,1 MHz para 9,4 T) e para a frequência de ressonância de ¹⁹ F (por exemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão e recepção do sinal.
12. Realize as configurações do sistema automático necessárias, incluindo calços para ajustar a homogeneidade do campo magnético (por exemplo ADJ_SHIM), ajustes de freqüência do sistema para ajustar a RF à freqüência Lamor do mouse (por exemplo ADJ_SF) e ganho de referência para ajustar a amplitude RF ( por exemplo ADJ_REFG). Todas essas configurações são importantes para tornar os campos magnéticos estáticos e variável (B _0, B _1), na região de interesse, o mais homogéneo possível.
13. Adquirir um segundo conjunto de imagens agente (como acima) ao longo das três orientações ortogonais, após ter regulado o campo de visão (FOV) de tal modo que ambos os membros inferiores ARe visível a partir da pelve de pé (CxLxA = 50x25x25 mm). Estas imagens servem para planejar as orientações das 3D ¹ H / ¹⁹ F exames finais.
14. Estabelecer um protocolo 3D TurboRARE para ^um H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Fator RARE = 16 (. Tempo de varredura de aproximadamente 60 min). Ajuste FOV com a ajuda das imagens de escoteiros, iniciar a digitalização (semáforo).
15. Carregar um único pulso-FID de sequência com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir núcleo a ¹⁹ F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas.
16. Inicie a medição sem a gravação de dados para exibir um sinal de MR em tempo real usando GSP (ir setup). Se o sinal espectral ^19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante) até um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica para o centro de pico espectral ¹⁹ F em 0 Hz na janela de aquisição. Aplicar freqüência básica e pressione Parar. Note-se que o isoflurano utilizada como anestésico pode gerar um sinal de fundo. De 9,4 Tesla MRI o deslocamento químico entre os ¹⁹ partículas F contendo eo isoflurano é de cerca de 1800 Hz. Assegure-se que a largura de banda de excitação é menor do que 3.600 Hz para evitar a excitação do isoflurano em conjunto com as células ou partículas de ¹⁹ F-etiquetados. A freqüência básica deve ser definido corretamente no sinal gerado pelos ¹⁹ células F-marcadas. Alternativamente, outro método de anestesia pode ser usado como o experimentador entender.
17. Clone (duplicado) o protocolo TurboRARE 3D a partir do anterior ¹ H digitalização. Vá em Edit Método e desmarque o ganho de referência automático (como acima). Set ¹⁹ F núcleo de edição de digitalização. Mudar a matriz de 128x64x64ea RARE-Factor, pelo menos, 40 (até 64). Para uma TR / TE 1000/6 ms e 64 médias, o tempo de verificação é de aproximadamente 70 min. Defina o ganho do receptor para 101 (caixa de ferramentas) e iniciar a digitalização sem quaisquer ajustes usando GOP (ir gasoduto).
18. Quando os exames terminar retrair o titular do mouse a partir do scanner MR. Desligue o rato cuidadosamente do titular. Se o mouse não é sacrificado para análise ex vivo (por exemplo, histologia ou espectroscopia, veja abaixo) diretamente após as medidas de RM, acompanhar de perto até que ele esteja completamente recuperado da anestesia. Regulação da temperatura corporal é afetada pela anestesia, por isso durante o processo de recuperação, coloque o rato em uma gaiola separada, que é colocada sobre uma almofada de temperatura regulada quente. Uma vez que o mouse esteja completamente recuperado da anestesia, devolvê-lo à sua gaiola exploração e à sala do animal.
19. Para sobrepor as imagens para ¹⁹ F ¹ imagens H, utilize o Menu Exibir oPÇÃO no mesmo software (Paravison). A função Underlay pode ser encontrado em Correlacionar. Salve o underlay, carregue a nova imagem e destacar a camada de ¹⁹ F, definindo uma nova cor a partir do olhar para cima da tabela. A discriminar entre os ¹⁹ e F ¹ H scans, alterar o limite para a cor escolhida (corte Olhe para cima de mesa) de tal forma que o sinal de ¹⁹ F terá a cor escolhida ea imagem H fundo ^uma permanecerão em escala de cinza. Outros programas de pós-processamento (por exemplo, ImageJ) estão disponíveis para criar as ^{1 h} / ¹⁹ F sobreposições de imagem.
20. No caso de uma quantificação em vivo do sinal ^19F ser necessário, seguir um protocolo quantitativa simples como anteriormente descrito ^15,16. Em resumo, a quantificação pode ser feita através da colocação de um tubo de referência com uma concentração conhecida de PFCE-emulsão no FOV lado do rato. Depois de adquirir as imagens MR, quantificar as intensidades dos sinais de ^F-19, utilizando região de interesse análise (ROI) e comparar com a curva de calibração in vitro, como mostrado na Figura 2.

5. Linfonodo Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS)

1. Depois de sacrificar o mouse, remova o linfonodo poplíteo e coloque em um pequeno tubo NMR 5 mm e adicionar 100 ml de 2% PFA.
2. Instalar uma bobina de espectroscopia de ¹⁹ F (por exemplo uma bobina toroidal), que tem uma abertura de pelo menos 5 mm, para segurar o tubo de RMN contendo o nódulo linfático.
3. Colocar o tubo de NMR no interior da bobina e mover a bobina ao isocentro do magneto.
4. Ajustar a bobina de RF com a frequência de ressonância ^19F (376,3 MHz, por exemplo, para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão de sinal erecepção.
5. Defina todos os parâmetros de correção dentro do Toolbox calçar a 0 e pressione aplicar. Normalmente, não é necessário aplicar métodos shimming vez que o volume da amostra é relativamente pequena. Se um sinal ¹⁹ F suficiente estiver disponível, os métodos automatizados pode ser aplicada para calçar, a frequência do sistema e o ganho do receptor, conforme descrito acima.
6. Carregar uma única sequência de impulsos FID com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir o núcleo de ¹⁹ F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas. Defina o número de médias a 1.
7. Comece a seqüência usando GSP. Se o sinal espectral ^19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante), até que um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica de modo que o ¹⁹ F SPEpico ctral está no centro da janela de aquisição a 0 Hz e aplicar frequência de base. Ajustar o pulso atenuador de novo para maximizar o sinal, para alcançar 90 ° excitação. Quando o sinal é na Parada máximo de imprensa.
8. Definir as médias no Método Editar entre 64 e 256 (ou mais, se necessário, dependendo do sinal) e de iniciar a aquisição usando GOP. O sinal detectado correlaciona linearmente com o número de médias. Durante quantificação ter em mente que o sinal detectado deve ser normalizada para uma média. Além disso, é necessário calcular o número de células a partir do sinal normalizado ¹⁹ F (figura 2) um padrão de concentração conhecida de um ou de uma curva de calibração de calibração.
9. Uma vez que a verificação for concluída, remova a amostra, coloque a próxima amostra e prosseguir com o passo 5.3.

Representative Results

Dezoito de 21 horas após a aplicação intradérmica, ¹⁹ células dendríticas F-rotulada (DC) migram para o nó de linfa poplíteos de drenagem. O movimento de CC através dos canais linfáticos para o nó de linfa de drenagem politeal pode ser apreciado por sobrepondo as imagens anatómicas H ¹ com as imagens DC ¹⁹ F (Figura 2A). Temos anteriormente relatado na migração dessas células in vivo, bem como o impacto de ¹⁹ tamanho de partícula em F-CC imunobiologia, incluindo eficiência de absorção ^11. A fim de quantificar a extensão da migração DC para os linfonodos, extraímos os linfonodos de drenagem e realizar ¹⁹ F MRS (Figura 2B). Quando se compara o sinal F de ¹⁹ obtido a partir de cada nó de linfa com o sinal de ^19F obtido a partir de diferentes números de DC marcadas com as mesmas partículas PFCE (curva de calibração, a Figura 2C), podemos deduziro número de ¹⁹ F-rotulado DC que atingem o linfonodo de drenagem. Na experiência representativa mostrada nas Figuras 2A e 2B, pode-se deduzir que 3,6 x 10 ⁵ de antigénio carregado DC atingido o nó de linfa para a direita, enquanto 7,5 x 10 ⁴ DC que não foram carregados com antigénio atingido o nó de linfa para a direita.

Figura 1. Posição do mouse sobre o titular do rato do pequeno scanner de ressonância magnética animal.

Figura 2. Quantificação de ^F-19 marcadas migração DC in vivo utilizando ^19F MRS. (A) DC foram marcadas com 1 mM de 560 nm PFCE particl es, carregado com (direita) ou sem (esquerda) e antígeno administrado intracutânea no membro posterior. Ovalbumina de frango inteiro (OVA) foi utilizada como antigénio; OVA foi incubada com a DC, juntamente com as partículas de ¹⁹ F. As células dendríticas são mostrados como ^19F sinal MR (vermelho), enquanto que os gânglios linfáticos e ductos linfáticos são mostrados na imagem de RM H anatómica ¹ (escala de cinzentos). As imagens foram adquiridas com uma ¹⁹ F / ¹ H volume de gaiola dupla sintonizável ressonador. (B), gânglios linfáticos de rato mostrada na A foi extraída e colocada num tubo de RMN. O sinal ^19F foi medida por MRS ^19F (ver protocolo de texto) e a amplitude foi calculada através da realização de uma transformação rápida de Fourier (FFT) do decaimento de indução livre adquirida (FID). (C) Durante um período de 24 horas, diferente quantidades de DC foram rotulados com 1 mm de 560 partículas PFCE nm e ¹⁹ F sinal foi medido por ¹⁹ F MRS como em B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver a figura maior.

Discussion

Este método de empregar ¹⁹ F / ¹ H MRI para seguir o movimento de CC no nó de linfa dá a oportunidade de estudar os padrões de migração de células imunitárias in vivo. As células dendríticas são excelentes exemplos de rápida migração de células do sistema imunológico que são capazes de manobrar através de estruturas tridimensionais sem fortemente aderidos a substratos específicos ^17. Embora a resolução espacial baixa (gama im) da técnica descrita não é comparável com a que pode ser obtida com microscopia multifóton, com esta técnica, o de alta resolução (gama nm) ainda é possível estudar a natureza da migração de células in vivo e sobre o um longo período de tempo. Além disso, a microscopia tem uma profundidade de penetração limitada e um campo de visão limitado, tornando-o inadequado para imagiologia actualmente grandes áreas dentro de um organismo vivo.

Devido ao método não invasivo da técnica, é possível monItor a migração das células imunitárias durante vários dias, sem sacrificar o rato após investigação. Outra vantagem da técnica é a possibilidade de sobrepor as ¹⁹ imagens F que capturam as células que migram com ^uma anatómicas H scans, permitindo, assim, uma localização precisa das células no organismo vivo. Esta técnica nos permite estudar os mecanismos moleculares subjacentes à migração DC. Ao contrário típico em ensaios in vitro de migração, este método permite o estudo da migração celular em um ambiente fisiológico 3D.

O potencial de aplicação de ¹⁹ F na MRS e ressonância magnética têm sido reconhecidos ^7,18. A relação gyromagnetic, de alta rotação e abundância isotópica natural faz ¹⁹ F um candidato ideal para RM ^7. Além disso, a semelhança entre os dias ¹⁹ e F ¹ H (em relação às suas propriedades de RMN) é um pré-requisito para uma sobreposição significativa entre tele anatômica 1H MRI com os ¹⁹ F ressonância magnética de células marcadas. De facto, uma vantagem de ¹ H / ^19F MRI durante outra ¹ H / X núcleos RM é o mesmo que o ressonador de RF pode ser utilizado tanto para ¹⁹ F e ¹ H núcleos. Na maioria das aplicações utilizadas para ¹⁹ F / ¹ H RM, um volume ressonador é empregue que pode ser sintonizado para ambos ^{de 19} F e ¹ H. Devido a _um campo B quase idêntica para ambos os canais, a transferência de valores da potência do canal de ¹ H (que é mais fácil de medir) para o canal ¹⁹ F é portanto possível.

Um factor importante a ser considerado quando marcação das células com partículas de qualquer tamanho (a partir de ultra-pequenos a grandes micro-partículas de tamanho) é o potencial de manipulação biológica e toxicidade. Mostrámos recentemente que, ao aumentar o tamanho das partículas de etiquetagem, que poderiam promover o estado de maturação de DC ^11. Uma possívelexplicação para o resultado encontrado é a preponderância de partículas maiores que 500 nm a serem tomadas por fagocitose, em vez de endocitose ^19, o primeiro mecanismo de captação de definir a natureza da DC. Outras características físicas (por exemplo, a forma da partícula e da topologia de superfície) também poderia alterar a função biológica das células marcadas e devem também ser considerados cuidadosamente ^20. Para qualquer configuração experimental que exige a rotulagem de DC com as partículas, é, portanto, altamente recomendado que os ensaios típicos de biologia celular são realizados em paralelo com a experiência para determinar / excluir qualquer influência das partículas sobre as propriedades biológicas destas células. Vários ensaios podem ser realizados, consoante o estudo experimental em questão. Para excluir uma influência sobre a maturação de DC, as medições do marcador da superfície celular (por exemplo, CD80, CD86) por FACS expressão é recomendada. Para excluir uma influência sobre a absorção de antígenos e apresentação, exper fagocitoseiments e experimentos de iniciação das células T, respectivamente, são recomendados. No caso de ensaios de migração, a expressão de receptores de quimiocina (CC) (tais como CCR7) e em ensaios in vitro de migração são recomendados.

Embora ¹⁹ F / ¹ H MRI é uma promessa para estudar a migração de células particularmente para fins clínicos, há atualmente uma série de limitações. Estas incluem: (i) uma resolução espacial que impede a visualização direta de células individuais, (ii) insuficiente ¹⁹ sensibilidade F (limite de detecção de vários 10 ⁵ células dentro de uma ROI), (iii) aumento da duração de digitalização como resultado do aumento da média para compensar para a limitação anterior, (iv) uma gama limitada de ¹⁹ F ressonadores de RF no mercado e (v) possível indesejável fundo ¹⁹ sinais F por outros elementos que contêm flúor, como (PTFE) dentro de componentes de hardware MR isofluorano e politetrafluoretileno (por exemplo, capacitores e cabos de conexão).

Para além dos factores tais como a intensidade do campo magnético e as forças de gradiente, um determinante principal que determina o nível de resolução espacial é a sensibilidade do rádio frequência (RF) ressonador usado ^21. A RM está intimamente relacionado com a relação sinal-ruído (SNR) de ²¹ e sobre a redução do tamanho de voxel para amplificar resolução espacial, uma perda de SNR é de se esperar. Uma maneira de aumentar a resolução espacial sem comprometer a sensibilidade do sinal é empregar bobinas criogenicamente resfriado que aumentam SNR, reduzindo o ruído térmico ^22. Com o auxílio de uma bobina de cabeça 1H que utiliza um sistema criogénico, podemos visualizar recentemente infiltrados celulares na encefalomielite autoimune experimental após o uso de um plano de resolução de (35x35) ^{2 23} mM. A aplicação desta tecnologia criogenicamente resfriado por ¹⁹ F / ¹ H MRI seria uma optunidade para superar algumas das limitações de ressonância magnética associados à detecção de sinal de celular e resolução.

Uma questão importante no rastreamento de células in vivo por ressonância magnética é a quantificação destas células em um determinado local dentro de um organismo vivo. Para isso, é possível a realização de ^19F MRS (ver 5.1-5.9). Ao empregar as curvas de calibração, que são obtidos a partir de ¹⁹ F MRS medições de diferentes números de ^19F-rotulado DC, é possível deduzir o número de células alcance no nódulo linfático. As medições ^19F MRS dos linfonodos pode ser comparado com o F MRS curva de calibração ¹⁹ DC. Além disso, comparando os dados de MRS as curvas de calibração celulares de DC com o PFCE puro, pode-se deduzir que é possível a detecção de aproximadamente 10 ^{13 19} F rotações por célula na sequência de rotulagem. De acordo com princípios de MR, o limite mais baixo de detecção é de 10 ¹⁸ rotações por voxel ²⁴. Assim, podemos assumir que somos capazes de detectar um número mínimo de 10 ⁵ DC por voxel usando uma T MRI 9.4.

Em resumo, o protocolo que se descrevem aqui é benéfico para investigações in vivo em estudar a migração de células durante os processos patofisiológicos. O método não invasivo da técnica permite estudos longitudinais, sem a necessidade de sacrificar um grande número de animais, a capacidade para sobrepor imagens ¹⁹ F a partir das células marcadas em ¹ H imagens anatómicas promove seguimento óptimo e altamente selectivo das células migratórias, e ^19F MRS fornece uma oportunidade para estimar o número de células localizatórios para áreas anatómicas específicas in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-glutamine	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Petri dishes (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G syringes	VWR, Germany	612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh)	VWR, Germany	734-0004
NMR tubes	VWR, Germany	634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools	FST
CO2 incubator	Binder
Small animal MR system	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil	Rapid Biomed, Würzburg, Germany		35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil	in-house		tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system	Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA