Övervakning dendritceller Migration hjälp Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Helmar Waiczies^1,2, Martin Guenther^1,2, Julia Skodowski^1,2, Stefano Lepore^1,2, Andreas Pohlmann², Thoralf Niendorf^1,2, Sonia Waiczies^1,2

¹Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, ²Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Spårning av celler med hjälp av MRI har fått anmärkningsvärd uppmärksamhet under de senaste åren. Detta protokoll beskriver märkning av dendritiska celler med fluor (

Abstract

Kontinuerliga framsteg inom icke-invasiv imaging modaliteter såsom magnetisk resonanstomografi (MRT) har förbättrats avsevärt vår förmåga att studera fysiologiska eller patologiska processer i levande organismer. MRT är också visat sig vara ett värdefullt verktyg för att fånga transplanterade celler in vivo. Initiala cellmärkning strategier för MRT gjort användning av kontrastmedel som påverkar MR relaxationstider (T1, T2, T2 *) och leda till en förbättring (T1) eller utarmning (T2 *) av signal där märkta celler är närvarande. T2 * förstärkande medel såsom ultrasmall järnoxid medel (USPIO) har använts för att studera cell migration och en del har också godkänts av FDA för klinisk tillämpning. En nackdel med T2 * agenter är svårigheten att särskilja signalen utdöende skapas av de märkta cellerna från andra artefakter såsom blodproppar, mikro blöder eller luftbubblor. I den här artikeln beskriver vi en ny teknik för att spåra celler in vivo sombygger på märkning av cellerna med fluor ⁽¹⁹ F)-rika partiklar. Dessa partiklar framställes genom emulgering av perfluoriderat kolväte (PFC)-föreningar och sedan används för att märka celler som sedan kan avbildas genom ¹⁹ F MRI. Viktiga fördelar av PFC för cell tracking in vivo inkluderar (i) avsaknaden av kol-bundet ¹⁹ F in vivo, vilket sedan ger bakgrund-fria bilder och komplett cell selectivityand (ii) möjligheten att kvantifiera cell signal med ¹⁹ F MR-spektroskopi .

Introduction

Spårning av celler in vivo är en viktig aspekt i flera områden av biomedicin. För detta, noninvasive avbildningstekniker som selektivt kan lokaliserar celler under en tidsperiod är ytterst värdefulla. Före utvecklingen av tre-dimensionell magnetisk resonanstomografi (MRI), var spårning av immun cellmigration begränsad till mikroskopiska analyser eller vävnadsbiopsier. Cell spårning med hjälp av MRI har fått enorm uppmärksamhet i de senaste åren, inte bara för immunologer studerar immunceller beteende in vivo, men också för kliniska och stamceller forskare. Under mitten av 90-talet, nanopartiklar de första studierna på järnoxid ¹ inledde en kaskad av utvecklingen för att spåra celler med MRI. Järnoxidpartiklar förkorta MR relaxationstid (T2 *) av de märkta cellerna och därmed orsaka signal utarmning i MR-bilder. Järnoxidpartiklar har använts för att märka makrofager ^2, oligodendrocyt progenitors ³ och många andra celltyper. Några av dessa partiklar har också varit kliniskt godkänt av FDA för märkning cellulära vacciner i melanompatienter ^4. Sedan in vivo eller ex vivo märkning av celler med järnoxidpartiklar åberopat en förkortning av T2 *-signalen och den senare kan även åstadkommas genom in vivo mottaglighet-relaterade T2 * effekter såsom mikro blödningar, inlåning järn eller luftbubblor, det kan vara svårt att identifiera märkta celler in vivo från andra bakgrund T2 *-signalen utdöenden ^5.

I den här artikeln beskriver vi en teknik för att spåra dendritiska celler (DC) in vivo genom att anställa ¹⁹ F / ¹ H magnetisk resonanstomografi (MRT). Denna cell tracking teknologi infördes först 2005 ^6, flera år efter de första erkända ansökningar för ¹⁹ F i MRI hade rapporterats ^7. En viktig Advantage av ¹⁹ F över järnoxidpartikel cellmärkning är den låga biologiska förekomsten av ¹⁹ F i vävnad, vilket gör det möjligt att spåra celler mycket selektivt med grunden bakgrund-fria bilder. Dessutom är det möjligt att överlagra ¹⁹ F MR-signalen från de märkta transplanterade cellerna med anatomiska bilder som kommer från konventionell 1H MRI. ¹⁹ F / ¹ H MRI är därför betydligt relevant för studier som undersöker cell migration in vivo. Celler studeras med denna metod är märkta med ¹⁹ F-rika partiklar. Syntetiskt-härledda perfluorkolväten (PFC) i första hand består av kol-och fluoratomer används ofta för att framställa partiklarna. Dessa föreningar är olösliga i vatten och måste emulgeras före applicering in vitro eller in vivo. Den vanliga storleken på PFC partiklar som har varit anställda av andra grupper för in vivo ¹⁹ F-MRI spårning experimentvarierar mellan 100 nm och 245 nm ^6,8-10. Vi har dock visat att effektiviteten i märkning dendritiska celler med perfluor-15-kron-5-eter (PFCE) partiklar ökar med ökande partikelstorlek (> 560 nm). ¹¹

Protocol

Alla djurförsök måste godkännas av den lokala institutionella djurskydd kommitté före exekvering. Under MR mätningarna en tillräcklig bedövning och fysiologisk övervakning (kroppstemperatur, andningsfrekvens) är oumbärliga kraven.

Ett. Generering av mus benmärgshärledda dendritiska celler

1. Utdrag benmärgsceller från C57BL / 6 möss som tidigare beskrivits ^12. Detta protokoll från 1992 ¹³ och beskrevs ursprungligen av den grupp av Ralph M. Steinman (1943-2011), upptäckare av den dendritiska cellen ^14.
2. Kortfattat, extrahera skenben och vadben snart efter att offra möss. Att arbeta under huv med laminärt flöde (för att förhindra mikrobiell kontaminering), spola benmärgen i en liten petriskål med tvättmedium (5% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 1% HEPES i RPMI) ^12.
3. Överför cellsuspensionen genom en cell strateIner (100 ^ m maskstorlek, nylon) i en steril 50-ml centrifugrör för att avlägsna ben och överbliven vävnad. Efter flera tvättsteg och en lyssteget ^12, räkna de livsdugliga celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
4. Resuspendera benmärgsceller vid en koncentration av 400 tusen celler ml ^-1 i odlingsmedium (RPMI kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 1% HEPES och 1% L-glutamin) innehållande 75 ng ml ^-1 av musen granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (mGM-CSF) erhölls från supernatanter av 293FT HEK-celler transfekterade med en mus GMCSF plasmid. Överför 10 ml cellsuspension (4 x 10 ⁶ celler) i petriskålar (100 mm x 20 mm) och inkubera i en _CO2 inkubator (37 ° C, 5% _CO2). På dag 3, fylla gammalt medium med 10 ml färskt medium (hålla slutkoncentration av mGM-CSF vid 75 ng ml ^-1). På dag 6, ta bort 10 ml gammalt medium och fyllamed 10 ml färskt medium (mGM-CSF slutkoncentration = 75 ng ml ^-1). På dag 8, ta 10 ml gammalt medium och fylla med 10 ml färskt medium (MGM-CSF end koncentration = 150 ng ml ^-1).
5. På dag 10, mogna differentierade DC med 1 mikrogram ml ^-1 lipopolysackarid (LPS) under 24 timmar.

2. Märkning av dendritiska celler med ¹⁹ F-rika partiklar

1. Under 24 hr mognad steg (1,5), etikett DC med en mM fluor-rika perfluor-15-kron-5-eter (PFCE) partiklar (500-560 nm) även för 24 tim. Förbered stora fluor-märkta partiklar genom emulgering PFCE i Pluronic F-68 (total volym 2,5 ml) med användning av en cell-störa titan sonotrode och med användning av en kontinuerlig puls-programmet (amplitud 100%, effekt = 250 W) under 60 sek.
2. Efter ovanstående inkubationssteg, skörda den mogna och fluor-märkt likström från en vävnadsodling cellskrapa, överföring till en 50-ml centrifugrör och centrifugeravid 500 x g under 5 min vid rumstemperatur.
3. För att tvätta bort alla överblivna partiklar och döda celler, lämna skördade celler att hålla sig på poly-L-lysin rätter. För att förbereda sig för detta steg, coat petriskålar med poly-L-lysin (1 mg ml ^-1) vid 37 ° C under 1 timme, tvätta därefter bort den obundna poly-L-lysin med PBS.
4. Inkubera ovan skördade cellerna på poly-L-lysin-belagda plattor i serumfritt medium och tillåta cellerna att vidhäfta (1 h vid 37 ° C, 5% _CO2).
5. Tvätta bort mediet att göra sig av icke vidhäftande celler, kvarvarande partiklar och döda celler och tvätta tre gånger med förvärmd (37 ° C) PBS.
6. Harvest vidhäftande celler genom trypsin-EDTA-behandling (0,25% trypsin-EDTA, 3 min inkubation vid 37 ° C).
7. Efter ytterligare en tvätt centrifugering steg, suspendera den erforderliga mängden mogna DC i serum-fri steril PBS.
8. För att bestämma om cellerna framgångsrikt har märkt, rekommenderas att kontrollera physicocheMical egenskaper hos celler med användning av flödescytometri (FACS). Den sideward scatter (SSC) bör avslöja en ökad granularitet i dessa celler, som tidigare beskrivits ^11. Det bör också hållas i minnet att fibroblaster kan förorena DC kulturerna och kunde också ta upp de ¹⁹ F partiklarna parallellt. Därför DC renheten bör bedömas (genom att mäta andelen CD11c ⁺ CD11b ⁺ celler med FACS) innan in vivo-applikation.

Tre. Applicering in vivo av ¹⁹ F-märkta dendritiska celler

1. Administrera DC (Juni ^{10 -} Juli 10) i en volym 50 - 100 l intrakutant i bakbenen av en C57BL / 6 mus genom att placera musen i en hållare och försiktigt föra en 26 ½ G nål i de övre hudlagren före applicering (använd 0,5 ml tuberkulin sprutor med permanent fastsatta nålar för att minimera död volym). För att säkerställa enn lämplig intrakutan ansökan är det viktigt att den införda delen av nålen vara delvis synlig under huden. Om nålen inte syns längre, har nålen satts in för djupt in i hudlagren. För den otränade individen skulle intrakutan ansökan utföras under narkos.
2. Bild lemmarna genom in vivo-fluor ⁽¹⁹ F) / proton ^(1H) MRT (se nästa avsnitt) 21 h efter injektion.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H Magnetic Resonance Imaging

De detaljerade instruktioner för inställning av MR avser en Bruker MR skanner med styrprogram Paravison (version 5.1). Namn som hänvisar till leverantör-specifika funktioner och objekt har markerats med kursiv stil. För andra MR skannrar dessa steg kan behöva justeras enligt tillverkarens anvisningar.

1. Arrange tillgång till en särskildlitet djur MR-scannern. För tillräcklig bildkvalitet, ett system med en magnetisk fältstyrka på 9,4 Tesla eller mer och skräddarsydda radio spolar frekvens (t.ex. ¹ H / ¹⁹ F dual-avstämbara volym RF-spole, 35 mm innerdiameter, 50 mm längd, Rapid Biomed, Würzburg, Tyskland) rekommenderas.
2. Före MRI, förbereda installationen av magnetkamera för anestesi och fysiologisk övervakning. Kontrollera att andningsmasken av djuret säng / hållare är ansluten till isofluran systemet och att temperatursonden och andning pad är anslutna till en avlägsen djur övervakningssystem (t ex modell 1025, SA Instruments Inc., New York, USA). Den senare tjänar till att övervaka djurets vitala parametrar såsom kroppstemperatur och respiration.
3. Söva möss genom inandning narkos med en mus kammare ansluten till en isofluran systemet. Justera flödeshastigheten för luft och _O2 på 0,2 L min ^-1 och 0,1 L min ^-1, respektiveoch 3% isofluran (justeras från en förångare) i ca 2 minuter tills önskad nivå av anestesi nås (inget svar efter tå nypa). Optimala flödeshastigheter kan variera beroende på konfiguration som används. Var medveten om att höga flöden kan leda till uttorkning. Noggrann övervakning av djurens förhållanden krävs vid alla tillfällen som nämnts ovan.
4. Placera musen benägna på musen bädd / innehavare av små djur MR scanner (Figur 1).
5. Medan hålla flödeshastigheten för luft och _O2 konstant, justera isofluran Vaporizer till 0,8-1,5% tills en optimal andningsmönster uppnås. En andningsfrekvensen av Är 50 - 70 andetag per minut rekommenderas.
6. Håll kroppstemperaturen vid 36-37 ° C under experimentet genom att använda en varm vatten (eller alternativt varm luft) cirkulationssystem.
7. Håll ögonen på musen fuktigt med steril ögat smörjande salva under mätningen.
8. Efter att ha säkrat djuretom avbildning hållaren och anslutningarna till övervakningssystemet, flytta hållaren till mitten av ¹ H / ¹⁹ F RF-spole (som är placerad vid isocentret av djuret scanner magneten).
9. Ställ in positionen på musen så att knäet ligger inom isocentret av magneten, antingen med en automatiserad metod (t.ex. med hjälp av en positionering laser kombinerad med en motordriven djur hållare) eller genom att manuellt beräkna avståndet innehavaren behöver flyttas in i magneten att nå isocentret.
10. För att bekräfta den korrekta positioneringen av djuret i skannern och senare planering av bilden slice geometri (dvs. storlek, position och rotation i rymden), förvärvar spana bilder i tre vanliga orienteringar (axial, frontal, sagittal) med snabb och låg upplösning förvärv metoder (t.ex. TriPilot protokoll, som använder en FLASH pulssekvens).
11. Ställ in RF-spolen till ^ett H resonansfrekvensen (t.ex.. 400,1 MHz för 9.4 T) och till ¹⁹ F resonansfrekvens (t.ex. 376,3 MHz för 9.4 T) och matcha den karakteristiska impedansen hos spolen till 50 Ohm med tuning monitorn av djuret MR-scannern. Tuning och matchning är nödvändigt för att uppnå optimala förhållanden för sändning och mottagning.
12. Utför de nödvändiga automatiska systeminställningar, inklusive mellanlägg för att finjustera den homogenitet magnetfält (t.ex. ADJ_SHIM), systemet frekvensjusteringar att ställa in RF till Lamor frekvensen av musen (t.ex. ADJ_SF) och referens gain att justera RF amplitud ( t.ex. ADJ_REFG). Alla dessa inställningar är viktigt att göra de statiska och variabla magnetics fält (B _0, B ₁₎ i det intressanta området så homogen som möjligt.
13. Skaffa en andra uppsättning spana bilder (såsom ovan) längs de tre ortogonala orienteringar, efter att ha justerat synfältet (FOV), så att båda benen ARe synlig från bäckenet till fots (LxBxH = 50X25X25 mm). Dessa bilder tjänar till att planera riktlinjerna i de slutliga 3D ¹ H / ¹⁹ F genomsökningar.
14. Inrätta en TurboRARE 3D protokoll för ^1H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50X25X25 mm, Matrix = 400x200x200, SÄLLSYNT Factor = 16 (. Scan tid ca 60 min). Ställ FOV med hjälp av scout bilderna, starta skanningen (trafik-ljus).
15. Ladda en enda puls FID-sekvens med en TR på minst 1,000 msek. Öppna Redigera Scan och ställa kärnan till ¹⁹ F. Använd manuella förstärkarinställningar genom att avmarkera den automatiska hänvisningen vinst i Redigera Metod för verktygslådan.
16. Starta mätningen utan registrering av data för att visa en MR-signal i realtid med hjälp av GSP (go setup). Om ¹⁹ F spektrala signalen inom förvärvet fönstret är för låg, lägga till fler medelvärden i Edit Metod och / eller modulera pulsen dämpare (TX0 eller SP0 reglaget) tills en signal syns tydligt. Justera grundläggande frekvensen för att centrera ¹⁹ F spektraltoppen vid 0 Hz i förvärvet fönstret. Tillämpa grundläggande frekvens och tryck på Stopp. Observera att isofluran används som anestesi kan generera en bakgrund signal. Vid 9,4 Tesla MR det kemiska skiftet mellan ¹⁹ F-haltiga partiklar och isofluran är ca 1800 Hz. Se till att excitation bandbredd är mindre än 3600 Hz för att undvika spännande isofluran tillsammans med de ¹⁹ F-märkta celler eller partiklar. Den grundläggande frekvens ställas in korrekt på den signal som genereras av ¹⁹ F-märkta celler. Alternativt kan en annan metod för anestesi användas som försöksledaren finner lämpligt.
17. Klon (kopiera) den TurboRARE 3D-protokollet från föregående ^1H scan. Gå till Redigera metod och avmarkera den automatiska referens förstärkningen (som ovan). Set ¹⁹ F kärna från Edit Scan. Ändra matrisen till 128x64x64och RARE-faktor till minst 40 (upp till 64). För en TR / TE 1,000 / 6 ms och 64 medelvärden, är det tid för skanning ca 70 min. Ställ mottagarens förstärkning till 101 (verktygslåda) och startar skanningen utan några ytterligare justeringar med GOP (gå pipeline).
18. När genomsökningar är klar dra musen hållare från MR-scannern. Koppla bort musen försiktigt ur hållaren. Om musen inte offras för ex vivo analys (t.ex. histologi eller spektroskopi, se nedan) direkt efter MR mätningar, noga övervaka tills det har helt återhämtat sig från anestesi. Kroppens temperaturreglering påverkas av anestesi, så under återställningsprocessen, sätta musen i en separat bur som är placerad på en varm temperatur-reglerad pad. När musen har helt återhämtat sig från anestesi, returnera den till innehavet bur och djuret rummet.
19. Att överlagra de ¹⁹ F bilder till ^en H bilder, använd menyn Visa option på samma mjukvarumedium (Paravison). Underlaget Funktionen finns under Korrelera. Spara underlaget, fyller den nya bilden och markera ¹⁹ F lagret genom att definiera en ny färg från Look up table. För att skilja mellan de ¹⁹ F och ¹ H-skanningar, ändra tröskelvärdet för den valda färgen (klipp look up table), så att ¹⁹ F-signalen kommer att ha den valda färgen och bakgrunden ^1H bilden förblir i gråskala. Andra efterbehandling program (t.ex. ImageJ) finns tillgängliga för att skapa ^en H / ¹⁹ överlägg F-bild.
20. Skulle en in vivo kvantifiering av ¹⁹ F-signalen vara nödvändig, följ en enkel kvantitativ protokoll som tidigare beskrivits ^15,16. I korthet kan kvantifiering ske genom att placera en referens rör med en känd koncentration av PFCE-Emulsion inom FOV bredvid musen. Efter förvärvet av MR bilder, quantifiera intensiteterna hos de ¹⁹ F signaler med hjälp av regionen av intresse (ROI)-analys och jämför med in vitro kalibreringskurvan såsom visas i fig. 2.

Fem. Lymph Node Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)

1. Efter offra musen, ta bort knävecket lymfkörtel och plats i en liten 5 mm NMR-rör och tillsätt 100 l av 2% PFA.
2. Installera en ¹⁹ spole F-spektroskopi (t.ex. en toroidspole) som har en öppning på minst 5 mm för att hålla NMR röret med lymfkörtel.
3. Placera NMR-röret inuti spolen och flytta spolen in isocentret av magneten.
4. Ställ in RF-spolen till ¹⁹ F resonansfrekvensen (t.ex. 376,3 MHz för 9,4 T) och matcha den karakteristiska impedansen hos spolen till 50 Ohm med användning av tuning monitorn av djuret MR-scannern. Tuning och matchning är nödvändigt för att uppnå optimala förhållanden för sändning och signalmottagning.
5. Ställ alla shims parametrar inom kompensationsplattan Toolbox till 0 och tryck på Verkställ. Vanligtvis är det inte nödvändigt att tillämpa mellanlägg metoder eftersom volymen av provet är relativt liten. Om en tillräcklig ¹⁹ F-signal är tillgänglig, kan automatiserade metoder användas för mellanlägg, systemets frekvens och mottagarens förstärkning som beskrivits ovan.
6. Ladda en enda puls FID-sekvens med en TR på minst 1,000 msek. Öppna Redigera Scan och ställa kärnan till ¹⁹ F. Använd manuella förstärkarinställningar genom att avmarkera den automatiska hänvisningen vinst i Redigera Metod för verktygslådan. Ställ in antalet medelvärden till 1.
7. Starta sekvensen med GSP. Om ¹⁹ F spektrala signalen inom förvärvet fönstret är för låg, lägga till fler medelvärden i Edit Metod och / eller modulera pulsen dämpare (TX0 eller SP0 reglaget) tills en signal syns tydligt. Justera grundläggande frekvensen så att ¹⁹ F spectral topp är i centrum av förvärvet fönstret vid 0 Hz och tillämpa grundläggande frekvens. Justera pulsen dämparen igen för att maximera signal, för att nå 90 ° excitation. När signalen är vid maximalt tryck på Stop.
8. Ställ medelvärdena i Redigera Metod mellan 64 och 256 (eller mer om så behövs, beroende på signalen) och starta förvärvet med GOP. Den detekterade signalen korrelerar linjärt med antalet medelvärden. Under kvantifiering ihåg att den detekterade signalen måste normaliseras till ett genomsnitt. Vidare är en kalibreringsstandard av en känd koncentration eller en kalibreringskurva nödvändigt att beräkna antalet celler från den normaliserade ¹⁹ F-signal (Figur 2).
9. När genomsökningen är klar, ta bort provet, placera nästa prov och fortsätt med steg 5.3.

Representative Results

Arton till tjugoen timmar efter intrakutan applikation, ¹⁹ F-märkta dendritiska celler (DC) vandrar in i dränerande popliteal lymfkörtel. Förflyttning av DC via lymfatiska gångarna till dränerande politeal lymfkörtel kan inses genom att överlagra de ¹ H anatomiska bilder med ¹⁹ F DC-bilder (Figur 2A). Vi har tidigare rapporterat om migration av dessa celler in vivo, samt effekterna av ¹⁹ F-partikelstorlek på DC Immunobiology, inklusive upptag effektivitet ^11. För att kvantifiera omfattningen av DC migration till lymfkörtlarna, extrahera vi de dränerande lymfkörtlarna och utför ¹⁹ F MRS (Figur 2B). När vi jämför de ¹⁹ F-signalen från varje lymfkörtel med ¹⁹ F som erhålls från olika antal DC märkta med samma PFCE partiklar (kalibreringskurva, figur 2C) kan vi härledaantalet ¹⁹ F-märkt DC som når dränerande lymfkörteln. I det representativt försök visas i figurerna 2A och 2B, kan vi dra slutsatsen att 3,6 x 10 ⁵ antigen-loaded DC nått rätt lymfkörtel medan 7,5 x 10 ⁴ DC som inte laddades med antigen nått rätt lymfkörtel.

Figur 1. Placering av musen på musen innehavaren av det lilla djuret MR-scannern.

Figur 2. Kvantifiering av ¹⁹ F-märkt DC migration in vivo med ¹⁹ F MRS. (A) DC märktes med 1 mM 560 nm PFCE partik es, lastad med (höger) eller utan (vänster)-antigen och administrerades intrakutant i bakbenet. Hel kyckling ovalbumin (OVA) användes som antigen, OVA inkuberades med DC tillsammans med de ¹⁹ F partiklarna. Dendritiska celler visas som ¹⁹ F MR-signalen (röd), medan lymfkörtlar och kanaler lymfatiska visas i ^en H anatomisk MR bild (gråskala). Bilder förvärvades med en ¹⁹ F / ¹ H dual-avstämbara volym fågelbur resonator. (B) Lymfknutor från musen som visas i A extraherade var och placerades i ett NMR-rör. Den ¹⁹ F-signalen mättes genom ¹⁹ F MRS (se protokoll text) och amplituden beräknades genom att utföra en snabb Fourier-transformation (FFT) i den förvärvade fria induktion sönderfall (FID). (C) under en period av 24 timmar, olika mängder DC märktes med 1 mm 560 partiklar nm PFCE och ¹⁹ F-signalen mättes genom ¹⁹ F MRS som i B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Denna metod för att anställa ¹⁹ F / ¹ H MRI för att följa flödet av likström i lymfkörteln ger möjlighet att studera flyttmönster immunceller in vivo. Dendritiska celler är utmärkta exempel på snabbt migrera immunceller som kan manövrera genom tredimensionella strukturer utan tätt följa specifika substrat ^17. Även den låga rumsliga upplösningen (im intervall) av den beskrivna tekniken är inte jämförbart med hög upplösning (nm) som kan uppnås med multiphoton mikroskopi, med denna teknik är det fortfarande möjligt att studera vilken typ av cell migration in vivo och över en längre tidsperiod. Dessutom har mikroskopi ett begränsat djup penetration och ett begränsat synfält, vilket gör det närvarande olämpligt för avbildning stora områden inom en levande organism.

På grund av den noninvasiveness av tekniken, är det möjligt att monitor migration av immunceller i flera dagar utan att offra mus efter undersökningen. En annan fördel med tekniken är möjligheten att överlagra de ¹⁹ F bilder som fångar den vandrande celler med anatomiska ^1H skanningar, vilket möjliggör en exakt lokalisering av cellerna i den levande organismen. Denna teknik gör det möjligt för oss att studera molekylära mekanismer bakom DC migration. Till skillnad från vanliga in vitro migration analyser, gör denna metod att studera cell migration i en fysiologisk 3D-miljö.

Den potentiella tillämpningen av ¹⁹ F i MRS och MRI har länge varit erkänt ^7,18. Den höga gyromagnetic ratio, hög spinn och naturliga isotophalten gör ¹⁹ F en idealisk kandidat för MR-avbildning ^7. Dessutom är likheten mellan ¹⁹ F och ¹ H (om deras NMR egenskaper) en förutsättning för en meningsfull överlagring mellan than anatomiska 1H MRI med de ¹⁹ F MRI av märkta celler. Verkligen en fördel med ^ett H / ¹⁹ F MRI över andra ¹ H / X kärnor MRI är att samma RF resonator kan användas för både ¹⁹ F och ^1H kärnor. I de flesta tillämpningar för ¹⁹ F / ¹ H MRI, en volym resonator används som kan anpassas till både ¹⁹ F och ¹ H. På grund av den nästan identiska B ₁ fält för båda kanalerna, en överföring av makt inställningar från ¹ H-kanalen (som är lättare att mäta) till ¹⁹ F-kanalen är därför möjligt.

En viktig faktor som bör beaktas vid märkning av celler med partiklar av vilken storlek som helst (från ultra-små till stora mikropartiklar) är potentialen av biologisk manipulation och toxicitet. Vi har nyligen visat att genom att öka storleken på de märkningskrav partiklarna, kan vi främja mognaden status DC ^11. En möjligförklaring till vår slutsats är det övervikt för partiklar större än 500 nm som skall tas upp av fagocytos stället endocytos ^19, fd upptagsmekanism definiera arten av DC. Andra fysikaliska egenskaper (t.ex. kornform och yta topologi) kan också ändra den biologiska funktionen av de märkta cellerna och bör också noga övervägas ^20. För varje given experimentuppställning som kräver märkning av DC med partiklar, är det således starkt rekommenderat att typiska cellbiologiska analyser utförs parallellt med experiment för att bestämma / utesluta något inflytande av partiklarna på de biologiska egenskaperna hos dessa celler. Flera analyser kan utföras, beroende på den experimentella studien i fråga. För att utesluta en påverkan på DC mognad, är mätningar av cellytan markör (t.ex. CD80, CD86) uttryck genom FACS rekommenderas. För att utesluta en påverkan på antigenupptag och presentation, fagocytos expertisiments och T-cell experiment priming, respektive, rekommenderas. I fråga om migration experiment in vitro migration analyser uttrycket av kemokinen (CC)-receptorer (såsom CCR7) och rekommenderas.

Även ¹⁹ F / ¹ H MRI har förutsättningar för att studera cell migration särskilt för kliniska ändamål, finns det för närvarande ett antal begränsningar. Dessa inkluderar (i) en rumslig upplösning som utesluter direkt visualisering av enskilda celler, (ii) otillräcklig ¹⁹ F-känslighet (detektionsgräns av flera 10 ⁵ celler inom en ROI), (iii) ökad scan löptider som en följd av ökad genomsnitt att kompensera för den tidigare begränsningen, (iv) ett begränsat utbud av ¹⁹ F RF resonatorer på marknaden och (v) eventuell oönskad bakgrund ¹⁹ F signal med andra fluor-innehållande element såsom isofluorane och polytetrafluoreten (PTFE) inom MR maskinvarukomponenter (t.ex. kondensatorer och anslutningskablar).

Bortsett från faktorer såsom magnetisk fältstyrka och styrkor lutning, är en huvudsaklig faktor som bestämmer graden av spatial upplösning känsligheten för radiofrekvens (RF) resonator används ^21. MRI upplösning är nära relaterad till signal-till-brusförhållandet (SNR) ²¹ och vid minska voxelstorlek att amplifiera rumslig upplösning, är en förlust i SNR kan förväntas. Ett sätt att öka rumsliga upplösningen utan att kompromissa signal känslighet är att använda kryogeniskt kylda spolar som ökar SNR genom att minska termiskt brus ^22. Med hjälp av en 1H huvudspole som använder ett kryogeniskt system skulle vi visualisera nyligen cellulära infiltrat i experimentell autoimmun encefalomyelit efter att ha använt en i planet upplösning av (35x35) xm ^{2 23.} Tillämpningen av denna cryogenically-kylda teknik för ¹⁹ F / ¹ H MRT skulle vara en ophet att övervinna några av de MRI begränsningar förknippade med cell signaldetektering och upplösning.

En viktig fråga för in vivo-spårning av celler genom MRT är kvantifieringen av dessa celler på en viss plats inom en levande organism. För detta är det möjligt att utföra ¹⁹ F MRS (se 5,1-5,9). Genom att använda kalibreringskurvor som erhålles från ¹⁹ F MRS mätningar av olika antal ¹⁹ F-märkt DC, är det möjligt att härleda antalet celler som når lymfkörtel. De ¹⁹ F MRS mätningar av lymfkörtlarna kan jämföras med ¹⁹ F MRS DC kalibreringskurva. Vidare, genom att jämföra MRS data från DC kurvor cell kalibrering med den rena PFCE, kan vi dra slutsatsen att det är möjligt att detektera ca 10 ^{13 19} F spins per cell efter märkningen. Enligt MR principer, är den lägsta detektionsgränsen 10 ¹⁸ spins per voxel ²⁴. Därmed kan vi anta att vi kan upptäcka ett minsta antal 10 ⁵ DC per voxel med en 9,4 T MR.

Sammanfattningsvis är det protokoll som vi beskriver här fördelaktigt för in vivo-undersökningar studerar cell migration under patofysiologiska processer. Den noninvasiveness av tekniken möjliggör longitudinella studier utan att behöva offra ett stort antal djur, förmågan att överlagra ¹⁹ F bilder från de märkta cellerna på ^ett H anatomiska bilder främjar optimal och mycket selektiv spårning av migrerande celler, och ¹⁹ F MRS ger en möjlighet att uppskatta antalet celler lokalisera till specifika anatomiska områden in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-glutamine	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Petri dishes (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G syringes	VWR, Germany	612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh)	VWR, Germany	734-0004
NMR tubes	VWR, Germany	634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools	FST
CO2 incubator	Binder
Small animal MR system	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil	Rapid Biomed, Würzburg, Germany		35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil	in-house		tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system	Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA