Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות Published: March 20, 2013 doi: 10.3791/50251
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2, 1,2, 1,2
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

מעקב של תאים באמצעות MRI זכה לתשומת לב ראויה לציון בשנים האחרונות. פרוטוקול זה מתאר את התיוג של תאים דנדריטים עם פלואור (

Abstract

התקדמות רציפה בשיטות הדמיה בלתי פולשניות כגון הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) השתפרה מאוד היכולת שלנו ללמוד תהליכים פיסיולוגיים או פתולוגי ביצורי חיים. MRI גם הוא להוכיח להיות כלי רב ערך עבור לכידת תאים מושתלים בגוף חי. אסטרטגיות תיוג תא ראשוניות לשימוש שנעשה MRI של סוכנים בניגוד המשפיעים על זמני ההרפיה MR (T1, T2, T2 *) ולהוביל לשיפור (T1) או דלדול (T2 *) של אות שבו תאים שכותרתו הם הווה. T2 * סוכני שיפור כגון סוכני תחמוצת ברזל (ultrasmall USPIO) להיות מועסקים ללמוד נדידת תאים וחלקם גם אושרו על ידי ה-FDA ליישום קליני. חסרון של T2 * סוכנים הוא הקושי להבחין הכחדת האות שנוצרה על ידי התאים שכותרתו מחפצים אחרים, כגון קרישי דם, מדמם מיקרו או בועות אוויר. במאמר זה, אנו מתארים טכניקה המתעוררות לתאי מעקב in vivo כיהוא מבוסס על סימון התאים עם פלואור (19 F) עשירים בחלקיקים. חלקיקים אלה הוכנו על ידי emulsifying perfluorocarbon (PFC) ולאחר מכן תרכובות המשמשים לתאי תווית, אשר לאחר מכן ניתן הדמיה על ידי 19 F-MRI. יתרונות חשובים של PFCs למעקב אחר תאי in vivo כולל (ט) היעדרות של פחמן בכריכת 19 F in vivo, אשר לאחר מכן מניב תמונות ללא רקע ולהשלים תא selectivityand (ii) את האפשרות לכמת את אות התא על ידי 19 F MR ספקטרוסקופיה .

Introduction

המעקב של תאי in vivo הוא היבט חיוני בכמה תחומים של ביו. לשם כך, שיטות הדמיה בלתי פולשניות באופן סלקטיבי יכול למקם תאים על פני תקופה של זמן הן יקרים מאוד. לפני הפיתוח תלת ממדי התהודה מגנטית (MRI), המעקב של נדידת תאים החיסונית היה מוגבל לניתוחים מיקרוסקופים או ביופסיות רקמות. מעקב סלולרי בעזרת MRI זכה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות, לא רק לאימונולוגים לימוד התנהגות תא חיסון in vivo, אלא גם לחוקרי תאי גזע וקליניים. במהלך אמצע שנתי ה -90, המחקרים הראשונים על חלקיקי תחמוצת ברזל 1 יזם מפל של התפתחויות לתאי מעקב עם MRI. חלקיקי תחמוצת ברזל לקצר את זמן הרגיעה MR (T2 *) של התאים שכותרתו ובכך לגרום לדלדול באות תמונות MR. חלקיקי תחמוצת ברזל להיות מועסקים לתווית מקרופאגים 2, עמ 'oligodendrocyterogenitors 3 והרבה סוגי תאים אחרים. חלק מחלקיקים אלה גם אושרו קליני על ידי ה-FDA לתיוג חיסונים הסלולר בחולים מלנומה 4. מאז in vivo או תיוג vivo לשעבר של תאים עם חלקיקי תחמוצת ברזל מסתמך על קיצור של האות * T2 וזה אחרון יכול להיות גם הביא על ידי הבקשורות לרגישות T2 * השפעת vivo כגון דימומי מיקרו, מרבצי ברזל או בועות אוויר, זה עלול להיות קשה לזהות תאים שכותרתו in vivo מהרקע אחר T2 * הכחדות אות 5.

במאמר זה, אנו מתארים טכניקה למעקב אחר תאים דנדריטים (DC) in vivo על ידי העסקת נ 19/1 דימות בתהודה מגנטית H (MRI). טכנולוגיית מעקב תא זה הוצגה רק בשנת 2005 6, כמה שנים אחרי שכבר דווחו היישומים הוכרו לראשונה ל19 F-MRI ב7. אדוה אחד חשובntage של 19 F מעל תיוג תא חלקיקי תחמוצת ברזל הוא התופעה הביולוגית הנמוכה של 19 F ברקמה, זה מאפשר לעקוב אחר תאים באופן סלקטיבי מאוד עם תמונות בעצם ללא רקע. יתר על כן, זה אפשרי לכיסוי אות נ 19 MR מהתאים המושתלים שכותרתו עם תמונות אנטומיות המתקבלות מהקונבנציונלי 1H-MRI. נ 19/1 H-MRI הוא אפוא רלוונטי במידה ניכרת למחקרים חוקרים נדידת תאים בגוף חי. תאים שנבדקו בשיטה זו מסומנים עם 19 חלקיקים ה-F-עשירים. perfluorocarbons סינטטי הנגזר (PFCs) עיקרם פחמן ואטומי פלואור משמש בדרך כלל כדי להכין את החלקיקים. תרכובות אלה הן מסיסים במים וצריכים להיות emulsified לפני היישום במבחנה או בגוף חי. גודל חלקיקי PFC הרגיל שהועסקו על ידי קבוצות אחרות לin vivo 19 ניסויי מעקב ה-F-MRIנע בין 100 ננומטר ו 245 ננומטר 6,8-10. עם זאת יש לנו הראינו כי היעילות בתיוג תאים דנדריטים עם עליות חלקיקי perfluoro-15-כתר-5-אתר (PFCE) עם חלקיקים בגודל הולך וגדל (> 560 ננומטר). 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נהלי כל החיה חייבים להיות מאושרים על ידי ועדת רווחת בעלי החיים המוסדית המקומית לפני ההוצאה להורג. במהלך מדידות MR רמה נאותה של הרדמה וניטור פיסיולוגי (טמפרטורת גוף, קצב נשימה) הן דרישות הכרחיות.

1. דור של עכבר מח עצם שמקורם בתאים דנדריטים

  1. לחלץ תאי מח עצם מעכברי C57BL / 6 כפי שתוארו לעיל 12. פרוטוקול זה שתחילתה עד 1992 13 ותואר לראשונה על ידי הקבוצה של ראלף מ 'שטיינמן (1943-2011), שגילה את התאים דנדריטים 14.
  2. בקצרה, לחלץ עצמות שוק זמן קצר לאחר הקרבת עכברים. עבודה מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית (על מנת למנוע זיהום חיידקים), שטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי קטנה עם מדיום לשטוף (5% FBS, HEPES 1% פניצילין / סטרפטומיצין ושל 1% בRPMI) 12.
  3. מעבירים את ההשעיה התא דרך Stra תאINER (100 מיקרומטר גודל רשת, ניילון) לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל על מנת להסיר שאריות עצם ורקמות. לאחר כמה צעדים לשטוף ו12 צעד תמוגה, לספור את תאי קיימא באמצעות trypan הכחול וhemocytometer.
  4. תאי מח עצם Resuspend בריכוז של 400,000 תאי מ"ל -1 במדיום התרבות (RPMI בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, HEPES ו 1% L-גלוטמין 1%) המכילים 75 ng מ"ל -1 של granulocyte העכבר גורם מגרה מקרופאג'ים מושבה (MGM-CSF) המתקבל supernatants של תאי HEK 293FT transfected עם GMCSF עכבר פלסמיד. העבר את 10 מ"ל של השעיה תא (4 x 10 6 תאים) בצלחות פטרי (מ"מ x 20 מ"מ 100) ו דגירה בCO 2 באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). ביום 3, לחדש את המדיום ישן עם 10 מיליליטר מדיום חדש (שמירה על ריכוז סוף MGM-CSF ב75 ng מיליליטר -1). ביום 6, להסיר 10 מ"ל של מדיום ישן ולחדשעם מדיום טרי 10 מ"ל (ריכוז סוף MGM-CSF = 75 ng מיליליטר -1). ביום 8, להסיר 10 מ"ל של מדיום ישן ולחדש עם מדיום חדש 10 מ"ל (ריכוז סוף MGM-CSF = 150 מיליליטר ng -1).
  5. ביום 10, בוגרת DC הבדיל עם מיקרוגרם lipopolysaccharide -1 1 מ"ל (LPS) למשך 24 שעות.

2. תיוג של תאי דנדריטים עם 19 חלקיקים ה-F-עשירים

  1. במהלך שלב התבגרות 24 שעות (1.5), תווית DC עם 1 מ"מ פלואור עשיר perfluoro-15-כתר-5-אתר (PFCE) חלקיקים (500-560 ננומטר) גם למשך 24 שעות. הכן את חלקיקי פלואור שכותרתו גדולים על ידי emulsifying PFCE בPluronic ה-F-68 (סה"כ נפח 2.5 מ"ל) באמצעות טיטניום sonotrode תא לשבש והעסקת תכנית דופק רציפה (משרעת 100%, כוח = 250 וואט) למשך 60 שניות.
  2. ביצוע שלבי הדגירה לעיל, למסוק DC הבוגר ופלואור שכותרתו באמצעות תרבית רקמת תא מגרד, להעביר לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ו צנטריפוגותב500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. כדי לשטוף את כל חלקיקים ושאריות תאים מתים, להשאיר את תאים שנקטפו לדבוק במנות פולי-L-ליזין. כדי להתכונן לצעד הזה, מנות מעיל פטרי עם פולי-L-ליזין (1 מ"ג מיליליטר -1) על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לאחר מכן לשטוף את מאוגדות פולי-L-ליזין עם PBS.
  4. דגירה מעל תאים שנקטפו על הצלחות פולי-L-ליזין המצופים במדיום סרום ללא ולאפשר לתאים לדבוק (שעת 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  5. לשטוף את המדיום להשליך תאים שאינם חסיד, חלקיקים הנותרים ותאים מתים ולשטוף שלוש פעמים עם מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS.
  6. קציר תאים חסיד ידי טריפסין-EDTA טיפול (0.25% טריפסין-EDTA, דגירה 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס).
  7. בעקבות צעד צנטריפוגה לשטוף אחר, resuspend את הכמות הנדרשת של DC הבוגר בסרום ללא סטרילי PBS.
  8. כדי לקבוע אם התאים סומנו בתווית בהצלחה, מומלץ לבדוק את physicocheמאפייני יכל של התאים באמצעות cytometry הזרימה (FACS). פיזור הצידה (SSC) צריך לחשוף גרעיניות מוגברת בתאים אלה, כפי שתואר לעיל 11. זה צריך להישמר גם לזכור כי fibroblasts עלול לזהם את תרבויות DC וגם יכול לקחת עד 19 החלקיקים F במקביל. לכן טוהר DC יש לבחון (על ידי מדידת אחוז CD11c + CD11b + התאים באמצעות FACS) לפני ביישום vivo.

3. ביישום Vivo של 19 תאי דנדריטים F-שכותרתו

  1. לנהל DC (יוני 10 - יולי 10) בנפח של 50 - 100 μl intracutaneously לתוך הגפיים האחוריות של עכבר C57BL / 6 על ידי מיקום העכבר בבעל והחדרת מחט G 26 וחצי בזהירות לתוך השכבות העליונות של העור לפני היישום (שימוש 0.5 מ"ל מזרקים טוברקולין באופן קבוע עם מחטים-מצורפות כדי למזער את הנפח מת). על מנת להבטיחהיישום המתאים intracutaneous n, חשוב שהכניס חלק מהמחט באופן חלקי גלוי מתחת לעור. אם המחט אינה גלויה יותר, המחט הוכנסה עמוקה מדי לתוך שכבות העור. עבור פרט בלתי מנוסה, יישום intracutaneous יכול להיות מבוצע בהרדמה.
  2. תמונת הגפיים על ידי בפלואור vivo (19 F) / פרוטון (1 H) MRI (ראה הסעיף הבא) הזרקת 21 שעות הבאות.

4. In Vivo נ 19/1 הדמיית תהודה מגנטית H

את ההוראות המפורטות להקמת סריקות MR מתייחסות לסורק Bruker MR באמצעות שלט תוכנת Paravison (גרסה 5.1). שמות המתייחסים לספציפיות לספק פונקציות ופריטים היו מסומנים באותיות נטויות. עבור סורקי MR אחרים השלבים הבאים עשויים להיות מותאמים לפי ההנחיות של היצרנים.

  1. סדר גישה לייעודיקטן סורק MR בעלי חיים. לקבלת איכות תמונה מספקת, מערכת עם כוח שדה מגנטי של 9.4 טסלה או יותר וסלילים מותאמים לתדרי רדיו (למשל 1 H / F 19 סליל כפול מתכונן נפח RF, קוטר פנימי 35 מ"מ, אורך 50 מ"מ; ראפיד ביומד, וורצבורג, גרמניה) מומלצות.
  2. לפני MRI, להכין תוכנית ההתקנה של סורק ה-MRI להרדמה וניטור פיסיולוגי. ודא שמסכת הנשימה של המיטה / בעל החיים מחוברת למערכת isoflurane וכי הבדיקה הטמפרטורה וכרית נשימה מחוברות למערכת ניטור חיה מרחוק (למשל דגם 1025, SA מכשירים בע"מ, ניו יורק, ארצות הברית). האחרונים משמש כדי לפקח על פרמטרים של בעלי החיים החיוניים כגון טמפרטורת גוף ונשימה.
  3. הרדימי עכברים על ידי הרדמת משאיפת באמצעות תא עכבר מחובר למערכת isoflurane. התאם את קצב זרימת אוויר ולO 2 ב 0.2 דקות L -1 ו -0.1 ל -1 דקות, בהתאמהוהוא הגיע 3% isoflurane (מנוכה ממאדה) לכ -2 דקות עד לרמה הנדרשת של הרדמה (ללא קמצוץ הבוהן הבא תגובה). ספיקות אופטימליות עשויות להשתנות בהתאם להגדרה שבשימוש. להיות מודע לכך שספיקות גבוהות עלולות לגרום להתייבשות. ניטור קפדני של תנאיהם של בעלי החיים נדרש בכל העת כאמור לעיל.
  4. מקם את העכבר שרועה על המיטה / בעל של העכבר הקטן החיה MR הסורק (איור 1).
  5. תוך שמירה על קצב הזרימה מתמיד לאוויר וO 2, להתאים אידוי isoflurane ל 0.8 - 1.5% עד שיגיע לדפוס נשימה אופטימלי. קצב נשימה של 50 - 70 נשימות לדקה מומלץ.
  6. שמור על טמפרטורת הגוף על 36-37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי על ידי שימוש במערכת זרימת מים חמים (או לחלופין אוויר חם).
  7. שמור על העיניים לחות עכבר עם משחת סיכה העין סטרילי במהלך המדידה.
  8. לאחר הבטחת בעלי החייםעל בעל ההדמיה ואת החיבורים למערכת הניטור, הזז את בעל למרכז של H 1/19 F סליל RF (שממוקם בisocenter של מגנט סורק בעלי החיים).
  9. להגדיר את המיקום של העכבר כך שהברך נמצאת בתוך isocenter של המגנט, או עם שיטה אוטומטית (למשל באמצעות לייזר מיצוב בשילוב עם בעל חיים מונע במנוע) או באופן ידני על ידי חישוב מרחק בעל צריך להתרגש למגנט להגיע isocenter.
  10. למאשר את המיקום הנכון של בעלי החיים בסורק ובהמשך התכנון של הגיאומטריה פרוסה התמונה (כלומר גודל, מיקום וסיבוב במרחב), לרכוש תמונות לסייר בשלוש האוריינטציות סטנדרטיות (צירי, העטרה, sagittal) באמצעות תמונה ברזולוציה נמוכה ומהירה שיטות רכישה (למשל TriPilot פרוטוקול, אשר משתמש ברצף דופק פלאש).
  11. לכוון את סליל RF לתדר התהודה H 1 (לדוגמה. MHz עבור 9.4 T 400.1) ולתדר התהודה 19 F (למשל 376.3 MHz עבור 9.4 T) ולהתאים את העכבה האופיינית של הסליל עד 50 אוהם משתמשים בצג הכוונון של סורק MRI של בעלי החיים. כוונון והתאמה הוא הכרחי כדי להשיג את התנאים האופטימליים לשידור וקליטת אות.
  12. בצע את הגדרות המערכת האוטומטיות הנדרשים לרבות shimming כדי לכוונן את ההומוגניות של השדה המגנטי (למשל ADJ_SHIM), התאמות תדר מערכת כדי לכוון את תדר RF לLamor של העכבר (למשל ADJ_SF) ורווח התייחסות להתאים את המשרעת RF ( למשל ADJ_REFG). כל ההגדרות האלה חשובים להפוך שדות סטטיים והמגנטיות משתנים (B 0, 1 ב ') באזור של עניין כהומוגנית ככל האפשר.
  13. לרכוש סט שני של תמונות הסקאוט (כאמור לעיל), יחד שלושת הכיוונים מאונך, לאחר שהתאים את שדה ראייה (FOV), כך ששני גפיים התחתונים ARדואר גלוי מאגן ועד כף רגל (= LxWxH 50x25x25 מ"מ). תמונות אלה ישמשו לתכנן את האוריינטציות של H 1/19 סריקות הסופיות F 3D.
  14. הגדר את פרוטוקול TurboRARE 3D עבור H-סריקת 1: TR / TE = 1500/53 אלפיות השנייה, FOV = 50x25x25 מ"מ, מטריקס = 400x200x200 פקטור, נדיר = 16 (. כ זמן סריקה 60 דקות). התאם FOV בעזרת דימויי סקאוט, להתחיל בסריקה (רמזור).
  15. טען דופק יחיד FID-רצף עם TR של לפחות 1,000 אלפיות שנייה. פתח סריקה לערוך ולהגדיר גרעין ל19 פ השתמש בהגדרות ידניות על ידי ביטול הבחירה ברווח רווח ההפניה האוטומטי בשיטת עריכה של ארגז הכלים.
  16. התחל מדידה ללא הקלטת נתונים כדי להציג אות MR בזמן אמת באמצעות GSP (ללכת התקנה). אם אות הרפאים 19 F בתוך חלון הרכישה היא נמוכה מדי, להוסיף עוד ממוצעים בשיטת עריכה ו / או לווסת מחליש הדופק (TX0 או מחוון SP0) עד סיgnal נראה בבירור. התאם את התדר הבסיסי כדי למרכז את שיא הרפאים 19 F ב 0 הרץ בחלון הרכישה. החל תדר בסיסי ועצירת עיתונות. שים לב שisoflurane משמש כהרדמה עלול ליצור אות רקע. ב9.4 טסלה MRI השינוי הכימי בין החלקיקים המכילים 19-F ואת isoflurane הוא כ 1,800 הרץ. ודא שרוחב פס העירור הוא קטן יותר מאשר 3,600 הרץ, כדי למנוע יחד isoflurane המרגש עם 19 תאים או חלקיקי ה-F-שכותרתו. התדר הבסיסי צריך להיות מוגדר בצורה נכונה על האות שנוצרה על ידי תאי ה-F-19 שכותרתו. לחלופין, שיטה אחרת של הרדמה יכולה לשמש כניסוי ראות עיניו.
  17. שיבוט (לשכפל) פרוטוקול TurboRARE 3D מהקודם H סריקת 1. ללכת כדי לערוך את השיטה ובטל את רווח ההפניה האוטומטי (כאמור לעיל). הגדרת גרעין נ 19 מעריכת סריקה. שנה את המטריצה ​​ל128x64x64ונדיר פקטור ללפחות 40 (עד 64). לTR / TE 1000/6 אלפיות שני ו64 ממוצעים, זמן הסריקה הוא כ -70 דקות. קבע את הרווח למקלט 101 (ארגז כלים) ולהתחיל את הסריקה ללא כל התאמות נוספות באמצעות הרפובליקנים (ללכת צינור).
  18. כאשר הסריקות שתסיים לחזור בעל העכבר מהסורק MRI. נתק את העכבר בזהירות מהמחזיק. אם העכבר לא הקריב לניתוח vivo לשעבר (למשל היסטולוגיה או ספקטרוסקופיה, ראה להלן) ישירות לאחר מדידות MR, לעקוב מקרוב עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. ויסות טמפרטורת גוף מושפעת מההרדמה, ולכן במהלך תהליך ההחלמה, לשים את העכבר בכלוב נפרד הממוקם על משטח טמפרטורה מוסדר חם. ברגע שהעכבר התאושש לגמרי מהרדמה, להחזיר אותו לכלוב והחזקתה לחדר של בעלי החיים.
  19. כדי כיסוי את תמונות 19 F עד 1 H תמונות, השתמש בתפריט הצג option על אותה התוכנה (Paravison). ניתן למצוא את הפונקציה ביסוד תחת מיתאם. שמור ביסוד, לטעון את התמונה החדשה ולסמן את שכבת F 19 על ידי הגדרת צבע חדש מלהסתכל למעלה טבלה. להפלות בין 19 F ו 1 H הסריקות, לשנות את הסף לצבע הנבחר (לחתוך תראה את שולחן), כך שאות F 19 תהיה הצבע הנבחר ואת תמונת רקע 1 H יישאר בגוונים אפור. תוכניות עיבוד פוסט אחרות (למשל ImageJ) זמינות כדי ליצור את / 19 שכבות של תמונות F H 1.
  20. צריך בכימות vivo של אות F 19 שיהיו צורך, בצע את פרוטוקול הכמותי פשוטה כפי שתואר לעיל 15,16. בקיצור, כימות יכול להיעשות על ידי הנחת צינור התייחסות עם ריכוז ידוע של PFCE אמולסיה בתוך FOV ליד העכבר. לאחר שרכש את תמונות MR, קוואןתצדיק את העוצמות של אותות 19 F באמצעות אזור של ריבית ניתוח (ROI) ולהשוות בעקומת כיול חוץ גופית כפי שמוצג באיור 2.

5. ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית לימפה צומת (MRS)

  1. לאחר להקריב את העכבר, להסיר את הבלוטות לימפה popliteal ומקום בצינור תמ"ג 5 מ"מ קטן ולהוסיף 100 μl של 2% PFA.
  2. התקן 19 סליל ספקטרוסקופיה F (למשל סליל טבעתי) שבו יש פתיחה של לפחות 5 מ"מ להחזקת צינור NMR המכיל בלוטות לימפה.
  3. מניחים את צינור התמ"ג בתוך הסליל ולהזיז את הסליל לisocenter של המגנט.
  4. לכוון את סליל RF לתדר התהודה F 19 (לדוגמא 376.3 MHz עבור 9.4 T) ולהתאים את העכבה האופיינית של הסליל עד 50 אוהם משתמשים בצג הכוונון של סורק MRI של בעלי החיים. כוונון והתאמה הוא הכרחי כדי להשיג את התנאים האופטימליים לשידור ואותקבלת הפנים.
  5. להגדיר את כל הפרמטרים שים בתוך ארגז הכלים shimming ל0 ולחץ על להחיל. בדרך כלל זה לא הכרחי ליישם שיטות shimming מאז היקף המדגם קטן יחסית. אם אות F 19 מספיק זמינה, בשיטות אוטומטיות עשויות להיות מיושמת לshimming, תדירות מערכת ועלייה במקלט, כמתואר לעיל.
  6. טען רצף FID דופק יחיד עם TR של לפחות 1,000 אלפיות שנייה. פתח ערוך סריקה ולהגדיר את הגרעין ל19 פ השתמש בהגדרות ידניות על ידי ביטול הבחירה ברווח רווח ההפניה האוטומטי בשיטת עריכה של ארגז הכלים. הגדר את מספר הממוצע ל -1.
  7. התחל את הרצף באמצעות GSP. אם אות הרפאים 19 F בתוך חלון הרכישה היא נמוכה מדי, להוסיף עוד ממוצעים בשיטת עריכה ו / או לווסת מחליש הדופק (TX0 או מחוון SP0) עד אות נראה בבירור. התאם את התדר הבסיסי, כך שSPE F 19שיא ctral הוא במרכזו של החלון ברכישה 0 הרץ ולהחיל את תדר בסיסי. התאם מחליש הדופק שוב כדי למקסם את האות, כדי להגיע לעירור של 90 מעלות. כאשר אות היא בעצור לחצו מרבי.
  8. הגדר את הממוצעים בשיטת עריכה שבין 64 ו 256 (או יותר במידת צורך, בהתאם לאות) ולהתחיל את הרכישה באמצעות הרפובליקנים. אות המזוהה בקורלציה ליניארית עם מספר הממוצעים. במהלך כימות יש לזכור כי האות זוהתה צריכה להיות מנורמלות ממוצע אחת. יתר על כן, רמת ריכוז ידוע או עקומת כיול כיול יש צורך לחשב את מספר תאים מאת אות F 19 המנורמלת (איור 2).
  9. לאחר הסריקה הוא סיים, הסר את המדגם, הנח את הדוגמא הבאה ולהמשיך בשלב 5.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שמונה עשר לעשרים ואחת שעות לאחר יישום intracutaneous, 19 תאים דנדריטים F-שכותרתו (DC) להעביר לימפה popliteal ניקוז. התנועה של DC דרך הצינורות הלימפה לבלוטה לימפה politeal ניקוז יכולה להיות מוערכת על ידי כיסה את התמונות אנטומיות H 1 עם 19 תמונות DC F (איור 2 א). יש לנו דיווח בעבר על ההגירה של תאים אלה in vivo, כמו גם את ההשפעה של גודל ה-F-19 חלקיק על DC Immunobiology, כולל יעילות ספיגת 11. על מנת לכמת את היקף הגירת DC לבלוטות הלימפה, אנחנו לחלץ את ניקוז בלוטות לימפה ולבצע 19 F גב (איור 2). כאשר אנו משווים את אות F 19 התקבלה מכל בלוטה לימפה עם אות F 19 המתקבלת ממספרים השונים של DC שכותרתו עם אותם חלקיקי PFCE (עקומת כיול, איור 2 ג) אנו יכולים להסיקמספר 19-F-DC שכותרתו להגיע לניקוז הבלוטות לימפה. בניסוי הנציג שמוצג באיורים 2 א ו -2, אנו יכולים להסיק כי 3.6 x 10 5 אנטיגן הטעון DC הגיע לימפה הנכונה תוך 10 DC 4 x 7.5 שלא היו עמוסים באנטיגן הגיע לימפה הנכונה.

איור 1
איור 1. עמדתו של העכבר על בעל העכבר של סורק MR חיה הקטן.

איור 2
איור 2. כימות של 19 הגירת DC-F-in vivo שכותרתו באמצעות 19 F MRS. () DC תויגו עם 1 מ"מ 560 ננומטר PFCE particl es, עמוס (מימין) או בלי (משמאל) ואנטיגן מנוהל intracutaneously בגפיים אחורי. ovalbumin עוף השלם (OVA) הועסק כאנטיגן; OVA הודגר עם DC יחד עם 19 חלקיקי F. תאים דנדריטים מוצגים כנ 19 MR אות (אדום), ואילו בלוטות לימפה וצינורות הלימפה מוצגות ב1 H MR האנטומי התמונה (בגווני אפור). תמונות נרכשו עם 19 נ / 1 כלוב ציפורים נפח כפול מתכונן H מהוד. (ב) בלוטות הלימפה מעכבר שמוצגת בהוצאו והניחו בצינור תמ"ג. אות F 19 נמדדה על ידי נ 19 גב (ראה פרוטוקול טקסט) ואת המשרעת הייתה מחושבת על ידי ביצוע שינוי פורייה מהיר (FFT) של ריקבון האינדוקציה חינם רכש (FID). (ג) במשך תקופה של 24 שעות, שונה כמויות של הבירה תויגו עם 1 560 חלקיקי PFCE ננומטר מ"מ ואות F 19 נמדדה על ידי גברת 19 F כמו בB.EF = היעד "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה זו של העסקת נ 19/1 H MRI כדי לעקוב אחר התנועה של DC לימפה נותנת את ההזדמנות ללמוד את דפוסי הנדידה של תאי מערכת חיסון בגוף חי. תאים הדנדריטים הם דוגמאות מצוינות של מהירות העברת תאים חיסוניים כי הם מסוגלים לתמרן דרך מבנים תלת ממדיים ללא חוזקה הקפדה על מצעים ספציפיים 17. למרות שהרזולוציה מרחבית הנמוכה (טווח מיקרומטר) של הטכניקה המתוארת היא לא ניתן להשוות ברזולוציה הגבוהה (טווח ננומטר) שניתן להשיג עם מיקרוסקופיה multiphoton, עם טכניקה זו עדיין אפשר ללמוד את האופי של נדידת תאי in vivo ומעלה תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, יש לו מיקרוסקופ חדירה לעומק מוגבל ותחום מצומצם של נוף, שהופך אותו כיום אינה מתאימה לשטחים גדולים הדמיה בתוך אורגניזם חי.

בשל noninvasiveness של הטכניקה, זה אפשרי שניitor ההגירה של תאים חיסוניים לכמה ימים, מבלי להקריב את העכבר לאחר החקירה. יתרון נוסף של השיטה הוא האפשרות לכיסוי את תמונות 19 F כי ללכוד את התאים הנודדים עם סריקות H 1 אנטומיים, ובכך מאפשרים לוקליזציה מדויקת של התאים בתוך האורגניזם החי. טכניקה זו תאפשר לנו לחקור מנגנונים מולקולריים שבבסיס DC הגירה. בניגוד למקובל במבחני הגירה חוץ גופית, שיטה זו מאפשרת למחקר של נדידת תאים בסביבת 3D פיזיולוגית.

יישום הפוטנציאל של 19 F בגב וMRI הוכרו 7,18 ארוך. היחס הגבוה gyromagnetic, גבוה הספין ושפע איזוטופי טבעי עושה 19 F מועמד אידיאלי לMR הדמיה 7. בנוסף לכך, הדמיון בין 19 F ו H 1 (לגבי מאפייניהם NMR) הוא תנאי הכרחי לכיסוי משמעותי בין tהוא MRI האנטומי 1H עם 19 F-MRI של תאים שכותרתו. ואכן אחד יתרונות של H 1/19 F-MRI על H / X-MRI גרעיני 1 השני הוא שאותו RF המהוד יכול לשמש לשניהם F 19 וגרעיני H 1. ברוב היישומים המשמשים לנ 19/1 H-MRI, נפח מהוד הוא מועסק שיכול להיות מכוונת לשניהם 19 F ו 1 ח בשל שדה כמעט הזהה ב '1 לשני הערוצים, העברת הגדרות צריכת חשמל מערוץ 1 H (כי הוא קל יותר למדידה) לערוץ 19 F הוא אפוא אפשרי.

אחד גורמים חשובים שיש לשקול בעת סימון תאים עם חלקיקים בכל גודל (מקטן במיוחד לחלקיקי מיקרו בגודל גדולים) הוא הפוטנציאל של מניפולציה ורעילות ביולוגיות. הראנו לאחרונה כי על ידי הגדלת הגודל של חלקיקי התיוג, אנחנו יכולים לקדם את מצב ההבשלה של 11 DC. אפשריהסבר לממצא שלנו הוא היתרון לחלקיקים גדולים יותר מ -500 ננומטר שיש לנקוט על ידי phagocytosis במקום אנדוציטוזה 19; מנגנון הספיגה לשעבר המגדיר את האופי של DC. מאפיינים פיסיים אחרים (לדוגמא צורת חלקיקים ומשטח טופולוגיה) יכולים גם לשנות את התפקוד הביולוגי של התאים שכותרתו וצריכים להיות גם נחשבים 20 בזהירות. עבור כל התקנה ניסיונית נתון הדורש תיוג של DC עם חלקיקים, וכך הוא מומלץ מאוד כי מבחני טיפוסיים ביולוגיה של תא מבוצעים במקביל לניסוי כדי לקבוע / לשלול כל השפעה של החלקיקים על המאפיינים הביולוגיים של תאים אלה. ניתן לבצע כמה מבחני, תלוי במחקר הניסויי בשאלה. כדי לא לכלול השפעה על הבשלת DC, מדידות של סמן תא שטח (לדוגמה: CD80, CD86) ביטוי על ידי FACS מומלצת. כדי לא לכלול השפעה על ספיגת אנטיגן והצגה, exper phagocytosisiments וניסויים תחול תא T, בהתאמה, מומלצים. במקרה של ניסויי הגירה, הביטוי של chemokine (CC) קולטנים (כגון CCR7) ובמבחני הגירת מבחנה מומלצים.

למרות שנ 19/1 H-MRI טומן בחובו הבטחה לחקר נדידת תאים במיוחד למטרות קליניות, יש כיום מספר המגבלות. אלה כוללים (i) ברזולוציה מרחבית שמונעת הדמיה ישירה של תאים בודדים, (ii) רגישות F 19 מספיקה (גבול גילוי של מספר 10 5 תאים בתוך אחד החזר על השקעה), (ג) עלה משך סריקה כתוצאה מגדל בממוצע כדי לפצות להגבלה הקודמת, (iv) טווח מוגבל של 19 F תהודה RF בשוק ו( V) אותות אפשרי אינם רצויים רקע נ 19 על ידי גורמים המכילים פלואור-אחרים, כגון בתוך רכיבי חומרה וisofluorane polytetrafluoroethylene (PTFE) (MRלמשל קבלים וכבלים לחיבור).

מלבד גורמים, כגון עוצמת שדה מגנטית ואת עוצמות הדרגתיות, הקובע עיקרי אחד שמכתיב את רמת הרזולוציה מרחבית הוא הרגישות של תדר הרדיו (RF) מהוד משמש 21. הרזולוציה MRI קשורה קשר הדוק ליחס אות לרעש (SNR) 21 ועל הקטנת גודל voxel כדי להגביר רזולוציה מרחבית, יחס אות לרעש הוא באובדן צפוי. אחת דרכים להגדיל את הרזולוציה מרחבית מבלי להתפשר על רגישות אות היא להעסיק סלילי cryogenically מקוררים להגביר את יחס האות לרעש על ידי הפחתת רעש תרמי 22. בעזרת סליל ראש 1H שמשתמש במערכת קירור, שאנחנו יכולים לדמיין לאחרונה מחלחלים סלולריים בEncephalomyelitis אוטואימונית הניסיוני לאחר השימוש ברזולוציה של מטוס (35x35) מיקרומטר 2 23. היישום של טכנולוגית cryogenically המקורר זה לנ 19/1 H-MRI יהיה אופportunity כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הקשורות לMRI זיהוי אות תא ורזולוציה.

נושא חשוב אחד למעקב בvivo של תאים על ידי בדיקת MRI הוא הכימות של תאים אלה במיקום מסוים בתוך אורגניזם חי. לשם כך ניתן לבצע 19 F MRS (ראה 5.1-5.9). על ידי שימוש בעקומות כיול המתקבלים ממדידות MRS 19 F של מספרים של 19-F-DC שכותרתו שונים, ניתן להסיק מספר התאים מגיעים לבלוטות לימפה. 19 מדידות F MRS של בלוטות לימפה יכולות להיות בהשוואה לעקומת כיול F גברת DC 19. יתר על כן, על ידי השוואת נתוני MRS מעקומות הכיול הסלולרי DC עם PFCE הטהור, אנו יכולים להסיק כי ניתן לזהות כ 10 13 19 F ספינים לכל תא הבא תיוג. על פי עקרונות MR, גבול הגילוי הנמוך ביותר הוא 10 18 לספיני voxel 24. לפיכך, ניתן להניח כי אנו מסוגלים לזהות מספר מינימאלי של 10 5 DC לשימוש voxel 9.4 T-MRI.

לסיכום, בפרוטוקול שאנו מתארים כאן הוא מועיל עבור vivo בחקירות הלומדות נדידת תאים במהלך תהליכי pathophysiological. Noninvasiveness של הטכניקה מאפשר מחקרים ארוכי טווח ללא הצורך בהקרבה של מספר גדול של בעלי חיים; יכולת כיסוי נ 19 תמונות מהתאים שכותרתו ב -1 בדימויים אנטומיים H מקדמת מעקב אופטימלי ומאוד סלקטיבית של התאים הנודדים, ונ 19 MRS מספק הזדמנות להעריך את מספר התאים localizing לאזורים אנטומיים ספציפיים בגוף חי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה לSW (DFG WA 2804) ומענק לאוניברסיטת SW מהמרכז למחקר הניסויי וקליני, שיתוף פעולה של מקס Delbrück מרכז לרפואה מולקולרית ופקולטה לרפואת Charité בברלין. היו הממנים שום תפקיד בתכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנה של כתב היד. אנו מודים למר רוברט Westphal לקבלת תמיכה טכנית בתקופת ההתמחות שלו במעבדה שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
C57BL/6 mice Charles River, Berlin
RPMI Gibco 21875-091
FBS Superior Biochrom AG S 0615
HEPES Gibco-Invitrogen 15630-056
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine Gibco 25030-024
Dulbecco's PBS Sigma Aldrich D8662
PFA Santa Cruz sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur 391-1996
Pluronic F-68 Sigma Aldrich P5556
Petri dishes (35 x 10 mm) VWR, Germany 391-1996
27 ½ G syringes VWR, Germany 612-0151
Nylon cell strainers (100 μm mesh) VWR, Germany 734-0004
NMR tubes VWR, Germany 634-0461
EQUIPMENT
Dissection tools FST
CO2 incubator Binder
Small animal MR system Bruker Biospin 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software
1H/19F dual-tunable volume RF coil Rapid Biomed, Würzburg, Germany 35 mm inner diameter, 50 mm length
19F spectroscopy coil in-house tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching
Isoflurane inhalation system Föhr Medical Instruments GmbH
Animal monitoring system Model 1025 SA Instruments Inc., New York, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
  3. Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
  4. de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  5. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
  6. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
  7. Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
  8. Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
  9. Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
  10. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
  11. Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
  12. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
  13. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  14. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
  15. Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
  16. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
  17. Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  18. Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
  19. Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
  20. Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
  21. Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
  22. Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
  23. Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
  24. Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 73 אימונולוגיה נייד ביולוגיה פיזיולוגיה אנטומיה תהודה מגנטית גרעינית הנדסה ביו רפואית המטולוגיה, NMR פלואור תאים דנדריטיים הגירה בלוטות לימפה הדמיה בתהודה מגנטית MRI ספקטרוסקופיה באמצעות תהודה המגנטית גברת ספקטרוסקופיה הדמיה מעקב סלולרי טכניקות קליניות
נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waiczies, H., Guenther, M.,… More

Waiczies, H., Guenther, M., Skodowski, J., Lepore, S., Pohlmann, A., Niendorf, T., Waiczies, S. Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (73), e50251, doi:10.3791/50251 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter