Summary
Monitoraggio delle cellule utilizzando la risonanza magnetica ha guadagnato notevole attenzione negli ultimi anni. Questo protocollo descrive l'etichettatura delle cellule dendritiche con fluoro (
Abstract
Progressi continui in modalità di imaging non invasive, come la risonanza magnetica (MRI) hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di studiare i processi fisiologici o patologici negli organismi viventi. RM è anche dimostrando di essere un valido strumento per l'acquisizione di cellule trapiantate in vivo. Strategie di etichettatura iniziali di cellule per uso MRI fatta di agenti di contrasto che influenzano i tempi di rilassamento MR (T1, T2, T2 *) e portare ad un miglioramento (T1) o esaurimento (T2 *) del segnale in cui sono presenti cellule marcate. T2 * agenti di miglioramento come ultrasmall ferro agenti di ossido (USPIO) sono stati impiegati per studiare la migrazione delle cellule e alcuni sono stati anche approvato dalla FDA per l'applicazione clinica. Un inconveniente di T2 * agenti è la difficoltà di distinguere l'estinzione segnale creato dalle cellule marcate da altre risorse come coaguli di sangue, micro sanguinamenti o bolle d'aria. In questo articolo, descriviamo una tecnica emergente per le cellule di monitoraggio in vivo chesi basa sulla etichettatura delle cellule con fluoro (F 19) ricchi di particelle. Queste particelle sono preparate emulsionando perfluorocarburi (PFC) composti e poi utilizzata per etichettare le cellule, che successivamente può essere ripreso con 19 F MRI. Importanti vantaggi di PFC per il monitoraggio delle cellule in vivo includono (i) l'assenza di carbonio-bound 19 F in vivo, che poi produce immagini sfondo-free e completa delle cellule selectivityand (ii) la possibilità di quantificare il segnale della cella di 19 F spettroscopia MR .
Introduction
Il monitoraggio delle cellule in vivo è un aspetto cruciale in diversi campi della biomedicina. Per questo, le tecniche di imaging non invasive che possono localizzare selettivamente le cellule per un periodo di tempo sono estremamente preziose. Prima dello sviluppo di tridimensionale risonanza magnetica (MRI), il monitoraggio della migrazione delle cellule immunitarie stato limitato alle analisi microscopiche o biopsie tissutali. Monitoraggio delle cellule con l'aiuto della risonanza magnetica ha riscosso un enorme attenzione in questi ultimi anni, non solo per gli immunologi che studiano il comportamento delle cellule immunitarie in vivo, ma anche per i ricercatori clinici e di cellule staminali. Durante la metà degli anni '90, i primi studi sulle nanoparticelle di ossido di ferro 1 avviato una cascata di sviluppi per le celle di rilevamento con la risonanza magnetica. Particelle di ossido di ferro abbreviare il tempo di rilassamento MR (T2 *) delle cellule marcate e quindi causare deplezione segnale nelle immagini RM. Le particelle di ossido di ferro sono stati impiegati per i macrofagi etichetta 2, oligodendrociti progenitors 3 e molti altri tipi di cellule. Alcune di queste particelle sono anche stati clinicamente approvato dalla FDA per l'etichettatura di vaccini cellulari nei pazienti con melanoma 4. Dal momento che in vivo o l'etichettatura ex vivo di cellule con particelle di ossido di ferro si basa su una riduzione del segnale T2 * e quest'ultimo potrebbe essere portato anche su di suscettibilità in vivo relativi alla T2 * effetti come micro emorragie, depositi di ferro o bolle d'aria, potrebbe essere difficile identificare cellule marcate in vivo da altra sfondo T2 * estinzioni di segnale 5.
In questo articolo, si descrive una tecnica per il monitoraggio delle cellule dendritiche (DC) in vivo impiegando 19 F / 1 H risonanza magnetica (MRI). Questa tecnologia di tracciamento delle cellule è stato introdotto solo nel 2005 6, diversi anni dopo le prime applicazioni riconosciute per 19 F a risonanza magnetica sono stati riportati 7. Uno ADVA importantentage di 19 F su ferro ossido particella marcatura delle cellule è la bassa incidenza biologica di 19 F in tessuto, questo rende possibile l'individuazione celle molto selettivamente con immagini praticamente prive sfondo. Inoltre, è possibile sovrapporre il segnale MR 19 F dalle cellule marcate trapiantate con immagini anatomiche ottenute da convenzionale 1H RMN. F 19/1 H MRI è quindi considerevolmente rilevante per studi che studiano migrazione delle cellule in vivo. Le cellule studiate con questo metodo sono etichettati con 19 particelle F-ricchi. Perfluorocarburi sinteticamente-derivati (PFC) costituiti principalmente da carbonio e atomi di fluoro sono comunemente usati per preparare le particelle. Questi composti sono insolubili in acqua e devono essere emulsionato prima dell'applicazione in vitro o in vivo. La dimensione usuale delle particelle PFC che sono stati impiegati da altri gruppi per in vivo 19 esperimenti di monitoraggio F-MRIvaria tra 100 nm e 245 nm 6,8-10. Tuttavia abbiamo dimostrato che l'efficienza nella etichettatura cellule dendritiche con perfluoro-15-corona-5-etere (PFCE) particelle aumenta con l'aumentare delle dimensioni delle particelle (> 560 nm). 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali devono essere approvati dal comitato di benessere degli animali istituzionale locale prima dell'esecuzione. Durante le misurazioni MR un adeguato livello di anestesia e monitoraggio fisiologico (temperatura corporea, frequenza respiratoria) sono requisiti indispensabili.
1. Generazione di mouse derivate dal midollo osseo cellule dendritiche
- Estrarre le cellule del midollo osseo da topi C57BL / 6 come precedentemente descritto 12. Tale protocollo risale al 1992 13 ed è stato originariamente descritto dal gruppo di Ralph M. Steinman (1943-2011), scopritore della cellula dendritica 14.
- Brevemente, estrarre tibia e perone subito dopo sacrificare i topi. Lavorare sotto la cappa a flusso laminare (per prevenire la contaminazione microbica), lavare il midollo osseo in una piccola scatola di Petri con terreno di lavaggio (5% FBS, 1% penicillina / streptomicina e 1% HEPES in RPMI) 12.
- Trasferire la sospensione cellulare attraverso una stra cellainer (100 pm dimensione di maglia, nylon) in una provetta da centrifuga da 50 ml sterile per rimuovere tessuto osseo e avanzi. Dopo varie fasi di lavaggio e un passo 12 lisi, contare le cellule vitali mediante trypan blu e un emocitometro.
- Risospendere le cellule del midollo osseo ad una concentrazione di 400.000 cellule -1 ml nel terreno di coltura (RPMI supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, 1% HEPES e 1% di L-glutammina) contenente 75 ng ml -1 della granulociti topo macrofagi fattore stimolante le colonie (MGM-CSF) ottenuto da surnatanti di 293FT cellule HEK trasfettate con un plasmide GMCSF del mouse. Trasferire 10 ml di sospensione cellulare (4 x 10 6 cellule) in piastre Petri (100 mm x 20 mm) e incubare in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Il giorno 3, ricostituire vecchia media con 10 ml di mezzo fresco (mantenendo la concentrazione finale di MGM-CSF a 75 ng ml -1). Il giorno 6, rimuovere 10 ml di vecchi media e ricostituirecon 10 ml di mezzo fresco (concentrazione finale MGM-CSF = 75 ng ml -1). Il giorno 8, rimuovere 10 ml di vecchi media e ricostituire con 10 ml di mezzo fresco (concentrazione finale MGM-CSF = 150 ng ml -1).
- Il giorno 10, maturare la DC differenziata con 1 mg ml -1 lipopolisaccaride (LPS) per 24 ore.
2. Etichettatura delle cellule dendritiche con 19 F-ricchi Particelle
- Durante la fase di maturazione 24 ore (1.5), l'etichetta DC con 1 mM di fluoro-ricchi perfluoro-15-crown-5-etere (PFCE) particelle (500-560 nm), anche per 24 ore. Preparare le grandi particelle di fluoro-etichettati emulsionando PFCE in Pluronic F-68 (volume totale 2,5 ml) utilizzando una cella-interrompendo titanio sonotrodo e impiegando un programma di impulso continuo (ampiezza 100%, power = 250 W) per 60 sec.
- Seguendo le fasi di incubazione sopra, raccogliere il DC mature e fluoro-marcato utilizzando un tessuto coltura cellulare raschietto, trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml e centrifugarea 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Per eliminare ogni particella di avanzi e cellule morte, lasciare cellule raccolte di aderire su piatti poli-L-lisina. Per prepararsi a questo passo, cappotto Petri con poli-L-lisina (1 mg ml -1) a 37 ° C per 1 ora, poi lavare via il non legato poli-L-lisina con PBS.
- Incubare sopra cellule raccolte sulle piastre poli-L-lisina in terreno privo di siero e consentono alle cellule di aderire (1 ora a 37 ° C, 5% CO 2).
- Lavare il medium di scartare le cellule non aderenti, particelle rimanenti e le cellule morte e lavare tre volte con pre-riscaldato (37 ° C) PBS.
- Raccolto cellule aderenti dalla tripsina-EDTA trattamento (0,25% tripsina-EDTA, 3 min di incubazione a 37 ° C).
- A seguito di un altro passo centrifugazione lavaggio, risospendere la quantità necessaria di DC mature nel siero PBS sterile.
- Per determinare se le cellule sono state etichettate con successo, si consiglia di controllare il physicochecaratteristiche chimici innovativi delle cellule usando la citometria a flusso (FACS). La dispersione lateralmente (SSC) dovrebbe rivelare un maggiore granularità in queste cellule, come descritto in precedenza 11. Va tenuto inoltre presente che fibroblasti potrebbero contaminare le culture CC e potrebbero anche prendere le particelle 19 F in parallelo. Pertanto la purezza cc deve essere valutata (misurando la percentuale di CD11c + CD11b + cellule usando FACS) prima applicazione in vivo.
3. Applicazione in vivo di 19 cellule dendritiche F-etichettati
- Somministrare DC (10 giugno-10 luglio) in un volume di 50 - 100 l intracutaneously nelle arti posteriori di un C57BL / 6 del mouse posizionando il mouse in un supporto ed inserendo accuratamente un ago G 26 ½ negli strati superiori della pelle prima dell'applicazione (uso 0,5 ml siringhe tubercolina con ago permanentemente collegati a ridurre al minimo il volume morto). Per garantire unan applicazione appropriata intracutaneous, è importante che la parte inserita dell'ago sia parzialmente visibile sotto la pelle. Se l'ago non è più visibile, l'ago è stato inserito troppo in profondità negli strati cutanei. Per l'individuo non addestrato, l'applicazione intracutaneous potrebbe essere eseguita in anestesia.
- Immagine degli arti dal vivo in fluoro (19 F) / protone (1 H), la risonanza magnetica (vedi sezione successiva) 21 ore dopo l'iniezione.
4. In Vivo 19 F / 1 H Risonanza Magnetica
Le istruzioni dettagliate per la configurazione delle scansioni MR si riferiscono a uno scanner MR Bruker utilizzando il software di controllo Paravison (versione 5.1). Nomi riguardanti le funzioni e gli elementi specifici del produttore sono stati evidenziati in corsivo. Per altri scanner MR questi passaggi possono essere adattate secondo le direttive dei produttori.
- Disporre l'accesso ad un appositopiccolo MR scanner animale. Per un'adeguata qualità delle immagini, un sistema con un campo magnetico di 9.4 Tesla o più e su misura bobine a radio frequenza (ad esempio, 1 H / F 19 dual-sintonizzabile volume di bobina RF, a 35 mm di diametro interno, 50 mm di lunghezza; Rapid Biomed, Würzburg, Germania) sono raccomandati.
- Prima di risonanza magnetica, preparare la configurazione dello scanner MRI per l'anestesia e il monitoraggio fisiologico. Assicurarsi che la maschera respiratoria del letto / titolare animale è collegato al sistema di isoflurano e che la sonda di temperatura e pad respirazione sono collegati ad un sistema di monitoraggio remoto animale (ad esempio modello 1025, SA Instruments Inc., New York, USA). Quest'ultimo serve per monitorare i parametri vitali dell'animale nei quali la temperatura del corpo e la respirazione.
- Anestetizzare topi da narcosi inalazione utilizzando una camera di mouse collegato a un sistema di isoflurano. Regolare la portata per aria e O 2 a 0,2 L min -1 e 0,1 L min-1, rispettivamentee il 3% isoflurano (regolata da un vaporizzatore) per circa 2 minuti fino a quando il livello richiesto di anestesia è raggiunto (nessuna risposta seguente pinch tep). Portate ottimali possono variare a seconda della configurazione in uso. Essere consapevoli del fatto che portate elevate possono portare alla disidratazione. Attento monitoraggio delle condizioni degli animali è necessaria in ogni momento come detto sopra.
- Posizionare il mouse prona sul letto del mouse / titolare del piccolo animale MR scanner (figura 1).
- Pur mantenendo la velocità di flusso per l'aria e O2 costante, regolare il vaporizzatore isoflurano al 0,8-1,5% fino al raggiungimento di un modello di respirazione ottimale. Si raccomanda 70 respiri al minuto - una frequenza respiratoria di 50.
- Mantenere la temperatura corporea a 36-37 ° C durante l'esperimento utilizzando un acqua calda (o alternativamente aria calda) sistema di circolazione.
- Tenete gli occhi del umida mouse con sterile pomata lubrificante occhio durante la misurazione.
- Dopo aver assicurato il animalesul supporto imaging e le connessioni al sistema di monitoraggio, spostare il supporto al centro della H 1/19 F RF coil (che viene posizionato all'isocentro del magnete scanner animale).
- Impostare la posizione del mouse tale che il ginocchio si trova all'interno all'isocentro del magnete, sia con un metodo automatico (per esempio usando un laser di posizionamento combinata con un supporto animale motorizzato) oppure calcolando manualmente la distanza del titolare deve essere spostata nel magnete per raggiungere la isocentro.
- Per confermare il corretto posizionamento dell'animale nello scanner e successivamente pianificazione della geometria porzione di immagine (cioè le dimensioni, posizione e rotazione nello spazio), acquisire esplorare immagini in tre orientamenti standard (assiale, coronale, sagittale) risoluzione dell'immagine basso e veloce utilizzando metodi di acquisizione (es. protocollo TriPilot, che utilizza una sequenza di impulsi FLASH).
- Accordare la bobina RF alla frequenza di risonanza H 1 (ad esempio. 400,1 MHz per 9,4 T) e alla frequenza di risonanza 19 F (376,3 MHz per es 9.4 T) e abbinare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il monitor sintonia del MR scanner animale. Messa a punto e di corrispondenza è necessario per raggiungere le condizioni ottimali per la trasmissione e la ricezione del segnale.
- Eseguire le impostazioni di sistema automatici necessari compresi spessoramento per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico (ad esempio ADJ_SHIM), regolazioni di frequenza di sistema per sintonizzare la RF alla frequenza Lamor del mouse (per esempio ADJ_SF) e il guadagno di riferimento per regolare l'ampiezza RF ( es ADJ_REFG). Tutte queste impostazioni sono importanti per rendere i campi magnetics statici e variabili (B 0, B 1) nella regione di interesse più possibile omogeneo.
- Acquisire una seconda serie di immagini di scout (come sopra) lungo i tre orientamenti ortogonali, dopo aver regolato il campo di vista (FOV) tale che entrambi gli arti inferiori are visibile dal bacino al piede (LxWxH = 50x25x25 mm). Queste immagini servono per programmare gli orientamenti delle 3D 1 H / F 19 scansioni finali.
- Impostare un protocollo TurboRARE 3D per 1 H-scan: TR / TE = 1,500 / 53 msec, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Fattore RARE = 16 (. Scansione di tempo circa 60 min). Regolare FOV con l'aiuto delle immagini di scout, avviare la scansione (semaforo).
- Caricare un singolo impulso FID-sequenza con TR di almeno 1.000 msec. Aprire Edit Scan e impostare nucleo a 19 F. Utilizzare le impostazioni manuali di guadagno deselezionando il guadagno automatica del riferimento nel metodo Edit della Casella degli strumenti.
- Avviare la misura senza registrazione dei dati per visualizzare un segnale MR in tempo reale utilizzando GSP (vai setup). Se il segnale spettrale 19 F entro la finestra di acquisizione è troppo bassa, aggiungere più medie in Modifica Metodo e / o modulare l'attenuatore impulsi (TX0 o slider SP0) finché un SIgnale è chiaramente visibile. Regolare la frequenza di base per centrare il picco spettrale 19 F a 0 Hz nella finestra di acquisizione. Applicare frequenza di base e premere Stop. Si noti che l'isoflurano utilizzata come anestesia può generare un segnale di fondo. A 9.4 Tesla MRI chemical shift tra le particelle 19 contenenti F e l'isoflurano è di circa 1.800 Hz. Assicurarsi che la larghezza di banda di eccitazione è più piccolo di 3.600 Hz per evitare emozionante il isoflurano insieme con i 19 cellule o particelle F-etichettati. La frequenza di base deve essere impostata correttamente sul segnale generato dalle celle 19 F-etichettati. In alternativa, un altro metodo di anestesia potrebbe essere utilizzato come sperimentatore ritiene opportuno.
- Clone (duplicare) il protocollo TurboRARE 3D dal precedente 1 H scansione. Vai a Modifica metodo e deselezionare il guadagno di riferimento automatico (come sopra). Set 19 F nucleo da Edit Scan. Cambiare la matrice di 128x64x64e il raro-Factor per almeno 40 (fino a 64). Per un TR / TE 1000/6 msec e 64 medie, il tempo di scansione è di circa 70 min. Impostare il guadagno del ricevitore di 101 (casella degli strumenti) e avviare la scansione senza ulteriori regolazioni utilizzando GOP (vai gasdotto).
- Quando le scansioni sono finiti ritrarre il supporto per mouse dallo scanner MR. Staccare con cautela dal supporto del mouse. Se il mouse non viene sacrificato per analisi ex vivo (istologia o spettroscopia, vedi sotto), subito dopo le misurazioni MR, monitorare attentamente finché non ha completamente recuperato da anestesia. Regolazione della temperatura corporea è influenzata dalla anestesia, quindi durante il processo di recupero, mettere il mouse in una gabbia separata che è posto su un tampone a temperatura regolata caldo. Una volta che il mouse ha completamente recuperato da anestesia, riportarlo nella sua gabbia di detenzione e alla sala degli animali.
- Per sovrapporre le 19 immagini F a 1 immagini H, utilizzare il menu Visualizza option sullo stesso software (Paravison). La funzione di sottotetto può essere trovato sotto Correlare. Salvare il sottofondo, caricare la nuova immagine ed evidenziare lo strato F 19 per la definizione di un nuovo colore dalla tabella di ricerca. Per discriminare tra i 19 F e 1 H scansioni, modificare la soglia per il colore scelto (tagliare Look up table) in modo che il segnale 19 F avrà il colore scelto e il 1 image H sfondo rimarrà in scala di grigi. Altri programmi di post-elaborazione (ad esempio ImageJ) sono a disposizione per creare le H 1/19 F sovrapposizioni di immagini.
- Se una quantificazione in vivo del segnale 19 F essere necessario, seguire un semplice protocollo quantitativa come descritto in precedenza 15,16. In breve, la quantificazione può essere fatto mettendo un tubo di riferimento con una concentrazione nota di PFCE-Emulsione all'interno del FOV vicino al mouse. Dopo aver acquisito le immagini MR, quanviduare le intensità dei segnali F 19 utilizzando regione d'interesse analisi (ROI) e confrontare la curva di calibrazione in vitro come mostrato in Figura 2.
5. Linfonodo spettroscopia di risonanza magnetica (MRS)
- Dopo aver sacrificato il mouse, rimuovere il linfonodo popliteo e posto in una piccola 5 millimetri tubo NMR e aggiungere 100 ml di 2% PFA.
- Installare una bobina spettroscopia 19 F (ad esempio una bobina toroidale), che ha un'apertura di almeno 5 mm per reggere il tubo NMR contenente il linfonodo.
- Porre il tubo NMR all'interno della bobina e spostare la bobina in all'isocentro del magnete.
- Sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza 19 F (es 376,3 MHz per 9,4 T) e abbinare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il monitor sintonia del MR scanner animale. Messa a punto e di corrispondenza è necessario per raggiungere le condizioni ottimali per la trasmissione e il segnalericezione.
- Impostare tutti i parametri spessori all'interno della Casella degli strumenti Shimming a 0 e premere applicare. Solitamente, non è necessario applicare metodi spessoramento poiché il volume del campione è relativamente piccolo. Se un sufficiente segnale 19 F è disponibile, metodi automatizzati possono essere applicate per lo spessoramento, frequenza di sistema e il guadagno del ricevitore come descritto sopra.
- Caricare un singolo impulso FID sequenza con un TR di almeno 1.000 msec. Aprire Modifica scansione e impostare il nucleo a 19 F. Utilizzare le impostazioni manuali di guadagno deselezionando il guadagno automatica del riferimento nel metodo Edit della Casella degli strumenti. Impostare il numero di medie a 1.
- Avviare la sequenza usando GSP. Se il segnale spettrale 19 F entro la finestra di acquisizione è troppo bassa, aggiungere più medie in Modifica Metodo e / o modulare l'attenuatore impulsi (TX0 o slider SP0) finché un segnale è chiaramente visibile. Regolare la frequenza di base in modo che il 19 F spepicco ctral è al centro della finestra di acquisizione a 0 Hz e applicare frequenza di base. Regolare nuovamente l'attenuatore impulso per massimizzare il segnale, per raggiungere 90 ° eccitazione. Quando il segnale è al massimo di arresto stampa.
- Impostare le medie in Edit Method tra 64 e 256 (o più se necessario, a seconda del segnale) e avviare l'acquisizione utilizzando GOP. Il segnale rilevato correla linearmente con il numero di medie. Durante quantificazione tenere presente che il segnale rilevato deve essere normalizzato ad una media. Inoltre, uno standard di calibrazione di una concentrazione nota o una curva di calibrazione è necessario calcolare il numero di cellule del segnale normalizzato F 19 (Figura 2).
- Una volta che la scansione è terminata, rimuovere il campione, posizionare il campione successivo e procedere con passo 5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diciotto a 21 ore dopo l'applicazione intracutanea, 19 F-etichettati cellule dendritiche (DC), migrano nel linfonodo popliteo drenante. Il movimento delle DC attraverso i dotti linfatici nel linfonodo drenante politeal può essere apprezzata con sovrapposizione delle immagini 1 H anatomiche con le immagini CD 19 F (Figura 2A). Abbiamo precedentemente riportato sulla migrazione di queste cellule in vivo, così come l'impatto di dimensione 19 F-particella DC immunobiology, compresa l'efficienza di assorbimento 11. Al fine di quantificare l'entità della migrazione DC nei linfonodi, si estrae i linfonodi drenanti e ad effettuare 19 F MRS (Figura 2B). Quando si confronta il segnale F 19 ottenuto da ciascun linfonodo con il segnale F 19 ottenuto da un diverso numero di DC etichettati con le stesse particelle PFCE (curva di taratura, la Figura 2C) possiamo dedurreil numero di 19 F-marcato DC che raggiungono il linfonodo drenante. Nell'esperimento rappresentante mostrato nelle figure 2A e 2B, si può dedurre che 3.6 x 10 5 antigene-caricato DC raggiunto il linfonodo destra mentre 7,5 x 10 4 DC che non sono stati caricati con antigene raggiunto il linfonodo destra.
Figura 1. Posizione del mouse sul supporto per mouse del piccolo MR scanner animale.
Figura 2. Quantificazione di 19 F-etichettato migrazione DC in vivo, utilizzando 19 F MRS. (A) DC sono stati etichettati con 1 mm 560 nm PFCE particl es, caricato con (a destra) o senza l'antigene (a sinistra) e somministrato intracutaneously in arti posteriori. Ovoalbumina pollo intero (OVA) è stato impiegato come antigene OVA è stato incubato con la DC insieme con i 19 particelle F. Cellule dendritiche sono mostrati come segnale MR 19 F (rosso), mentre linfonodi e canali linfatici sono mostrati in H immagine anatomica MR 1 (scala di grigi). Le immagini sono state acquisite con un 19 F / 1 H a doppio sintonizzabile volumi Birdcage risonatore. (B) linfonodi di topo mostrati in A sono stati estratti e posti in un tubo NMR. Il segnale 19 F è stata misurata da 19 F MRS (vedi Protocol testo) e l'ampiezza è stato calcolato eseguendo una trasformazione rapida di Fourier (FFT), del decadimento induzione libera acquisita (FID). (C) Per un periodo di 24 ore, differente quantità di DC sono stati etichettati con 1 mm 560 particelle PFCE nm e 19 di segnale F è stata misurata da 19 F MRS come in B.ef = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo metodo di impiegare 19 F / 1 H MRI di seguire il movimento della CC nella linfonodo dà la possibilità di studiare i modelli di migrazione di cellule immunitarie in vivo. Le cellule dendritiche sono eccellenti esempi di rapida migrazione di cellule immunitarie che sono in grado di manovrare attraverso strutture tridimensionali senza strettamente aderire a substrati specifici 17. Sebbene la scarsa risoluzione spaziale (gamma micron) della tecnica descritta non è comparabile con l'alta risoluzione (intervallo nm) che può essere ottenuto con la microscopia multiphoton, con questa tecnica è ancora possibile studiare la natura della migrazione cellulare in vivo e oltre un periodo di tempo più lungo. Inoltre, la microscopia ha una penetrazione di profondità limitata e un campo di vista limitato, rendendolo inadatto per l'imaging attualmente ampie aree all'interno di un organismo vivente.
Dovuto alla non invasività della tecnica, è possibile montor la migrazione delle cellule immunitarie per diversi giorni senza sacrificare il mouse dopo l'indagine. Un altro vantaggio della tecnica è la possibilità di sovrapporre le immagini 19 F che catturano le cellule migranti con anatomiche 1 H scansioni, consentendo così una localizzazione precisa delle cellule all'interno dell'organismo vivente. Questa tecnica ci permetterà di studiare i meccanismi molecolari alla base della migrazione DC. Diversamente tipica saggi in vitro di migrazione, questo metodo consente lo studio della migrazione delle cellule in un ambiente 3D fisiologico.
Il potenziale di applicazione di 19 F in MRS e la risonanza magnetica sono da tempo riconosciuti 7,18. L'elevato rapporto giromagnetico, alta rotazione e tenore isotopico naturale rende 19 F un candidato ideale per la RM 7. Inoltre, la somiglianza tra i 19 F e 1 H (per quanto riguarda le loro proprietà NMR) è un prerequisito per una sovrapposizione significativa tra tegli anatomica 1H RMN con i 19 F MRI di cellule marcate. Infatti uno dei vantaggi di H 1/19 F MRI sopra altri 1 H / X nuclei MRI è che la stessa RF risonatore può essere utilizzato sia per 19 F e 1 H nuclei. Nella maggior parte delle applicazioni utilizzate per 19 F / 1 H MRI, un volume risonatore è impiegato che può essere sintonizzata sia 19 F e 1 H. Causa della quasi identica B 1 campo per entrambi i canali, un trasferimento di impostazioni di potenza dal canale 1 H (che è più facile da misurare) sul canale F 19 è dunque possibile.
Un fattore importante da considerare quando l'etichettatura cellule con particelle di qualsiasi dimensione (da ultra-piccole a grandi particelle di micro-imprese) è il potenziale di manipolazione biologica e la tossicità. Abbiamo recentemente dimostrato che aumentando la dimensione delle particelle di etichettatura, potremmo promuovere lo stato di maturazione delle DC 11. Una possibilespiegazione per la nostra scoperta è la preponderanza di particelle più grandi di 500 nm da prendere da fagocitosi piuttosto che endocitosi 19; l'ex meccanismo di assorbimento definire la natura di DC. Altre caratteristiche fisiche (ad esempio, la forma delle particelle e la topologia della superficie) potrebbe anche alterare la funzione biologica delle cellule marcate e dovrebbero essere attentamente considerata 20. Per un dato apparato sperimentale che prevede l'etichettatura di CC con particelle, è quindi consigliabile che dosaggi tipici di biologia cellulare vengono eseguite in parallelo al esperimento per determinare / escludere qualsiasi influenza delle particelle sulle proprietà biologiche di queste cellule. Parecchi saggi possono essere eseguiti, a seconda dello studio sperimentale in questione. Per escludere un'influenza sulla maturazione delle DC, misure di marcatore di superficie cellulare (ad esempio CD80, CD86), l'espressione da FACS è raccomandato. Per escludere un'influenza sulla captazione dell'antigene e presentazione, fagocitosi esperisono raccomandati iments ed esperimenti di priming delle cellule T, rispettivamente,. Nel caso di esperimenti di migrazione, l'espressione di chemochine (CC) recettori (come CCR7) e in saggi di migrazione in vitro sono raccomandati.
Anche se 19 F / 1 H MRI promettente per studiare la migrazione delle cellule in particolare per scopi clinici, attualmente ci sono una serie di limitazioni. Questi includono (i) una risoluzione spaziale che preclude la visualizzazione diretta delle singole cellule, (ii) insufficiente 19 F sensibilità (limite di rilevazione di diversi 10 5 cellule all'interno di un ROI), (iii) aumenta durata di scansione, come risultato di un aumento in media per compensare per la limitazione precedente, (iv) una serie limitata di 19 F risonatori RF sul mercato e (v) eventuale indesiderato sfondo 19 di segnale F da altri elementi contenenti fluoro, come all'interno di componenti hardware MR isofluorano e politetrafluoroetilene (PTFE) (ad esempio condensatori e cavi di collegamento).
Oltre a fattori quali la forza del campo magnetico e forza di gradiente, un determinante principale che determina il livello di risoluzione spaziale è la sensibilità della frequenza radio (RF) utilizzato risonatore 21. Risoluzione MRI è strettamente legato al rapporto segnale-rumore (SNR) 21 e sulla riduzione voxel per amplificare risoluzione spaziale, una perdita di SNR è prevedibile. Un modo per aumentare la risoluzione spaziale senza compromettere la sensibilità del segnale è di impiegare bobine criogenico raffreddati che aumentare SNR riducendo il rumore termico 22. Con l'aiuto di una bobina testa 1H che utilizza un sistema criogenico, potremmo recentemente visualizzarne infiltrati cellulari nel encefalomielite autoimmune sperimentale dopo l'utilizzo in un piano di risoluzione (35x35) 23 micron 2. L'applicazione di questa tecnologia criogenicamente raffreddato per 19 F / 1 H MRI sarebbe un opnità di superare alcune delle limitazioni MRI associate alla rilevazione del segnale cellulare e risoluzione.
Un importante problema per il monitoraggio in vivo di cellule mediante MRI è la quantificazione di queste cellule in una posizione specifica all'interno di un organismo vivente. Per questo è possibile eseguire 19 F MRS (vedi 5,1-5,9). Utilizzando curve di calibrazione che si ottengono dai 19 F MRS misurazioni dei diversi numeri di DC 19 F-marcato, è possibile dedurre il numero di celle che raggiungono il linfonodo. I 19 F misurazioni MRS dei linfonodi può essere paragonato alla F curva di calibrazione DC 19 MRS. Inoltre, confrontando i dati MRS dalle curve di calibrazione cellule DC con il PFCE puro, si può dedurre che è possibile rilevare circa 10 F 13 19 giri per cellula seguente etichettatura. Secondo i principi della risonanza magnetica, il limite di rilevazione più basso è 10 18 giri al voxel 24. Così, si può supporre che siamo in grado di rilevare un numero minimo di 10 5 CC per voxel con un T MRI 9.4.
In sintesi, il protocollo che descriviamo qui è utile per analisi in vivo che studiano migrazione cellulare durante processi patofisiologici. La non invasività della tecnica consente studi longitudinali senza la necessità di sacrificare gran numero di animali, la capacità di sovrapporre 19 F immagini dalle cellule marcate sulla 1 H immagini anatomiche promuove tracciamento ottimale e altamente selettivo delle cellule migranti, e 19 F MRS fornisce un'opportunità per stimare il numero di cellule di localizzazione di aree anatomiche specifiche in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) e una borsa di studio universitaria a SW dal Centro di Ricerca Sperimentale e Clinica, una collaborazione del Centro Max Delbrück per la medicina molecolare e la Facoltà di Medicina Charité di Berlino. I finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il Sig. Robert Westphal per il supporto tecnico durante il suo stage presso il nostro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA | ||
References
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).
