Mouse a breve e lungo termine di attività locomotoria analizzati da Tracking Software Video

Summary

Attività locomotoria (LMA) è una misura semplice e di facile esecuzione di comportamento nei topi. Accoppiamento di software di video tracking (VTS) e LMA permette il miglioramento della specificità e sensibilità, soprattutto se confrontato con il manuale, linea metodo di attraversamento LMA analisi. Inoltre VTS permette il monitoraggio a lungo termine di topo LMA.

Abstract

Attività locomotoria (LMA) è una misura semplice e di facile esecuzione di comportamento nei topi e altri roditori. Miglioramenti nel software di video tracking (VTS) hanno permesso di essere accoppiato a test LMA, migliorando notevolmente la specificità e la sensibilità rispetto al metodo linea di incroci con il punteggio manuale. Inoltre, VTS permette la sperimentazione di alto-rendimento. Simile al video tracking automatico utilizzato per la prova in campo aperto (OFT), test di LMA è unica in quanto permette topi di rimanere nella loro gabbia casa e non utilizza lo stimolo ansiogeno di forte illuminazione durante la fase attiva del chiaro-scuro ciclo. Tradizionalmente, LMA è stato utilizzato per brevi periodi di tempo (minuti), mentre gli studi più lunghi del movimento (ore-giorni) hanno spesso usato impiantati trasmettitori e biotelemetria. Con l'opzione di monitoraggio in tempo reale, a lungo, come il test a breve termine LMA, possono ora essere eseguiti utilizzando videografia. Test a lungo termine LMA richiede una specializzazione, Ma facilmente costruiti, gabbia in modo che il cibo e l'acqua (che è di solito posizionato sulla parte superiore della gabbia) non osti videografia. È importante sottolineare che, videografia e VTS permette la quantificazione di parametri, come ad esempio il percorso di movimento del mouse, che sono difficili o irrealizzabile per misurare con la linea di passaggio e / o biotelemetria. In sintesi, prove LMA accoppiato ad VTS permette una descrizione più completa di movimento del mouse e la capacità di esaminare locomozione su un periodo esteso di tempo.

Protocol

1. LMA Set a breve termine Up e procedura

1. A breve termine LMA gabbia istituito
   1. Testare LMA a breve termine all'interno della casa gabbia di un mouse a singolo ospitato. Per facilitare l'analisi delle immagini VTS-dipendente, utilizzare biancheria da letto in alto contrasto con il colore del mouse (cioè letto di colore scuro per i topi bianchi e biancheria da letto di colore chiaro per i topi neri).
   2. Durante il test a breve termine LMA, coprire le gabbie con chiaro ¼ in plexiglas con 11 ¼ x in fori di diametro per sostenere una ventilazione adeguata.
2. Sala prove LMA a breve termine
   1. Testare topi in un ambiente pulito in cui sono stati acclimatati per almeno 24 ore ^8.
   2. Per illuminare l'ambiente di test, utilizzare chioccia luci morsetto con lampadine rosse (<125 lumen). Prima di videografia, regolare l'angolo e la posizione delle luci per eliminare il riverbero o riflessi dalla cima della gabbia di plexiglas.
   3. Rimuovere o evitare il rumore nelle cameresuperiore a 70 dB. Utilizzare un generatore di rumore bianco, se il rumore di fondo intermittente è inevitabile durante il test del mouse.
   4. Coprire la superficie di prova su cui le gabbie sono posti in sala prove con macellaio o carta da banco di laboratorio di colore simile al letto gabbia, nel caso in cui il pavimento della gabbia è esposto durante la videografia.
3. A breve termine LMA videografia
   1. Centro e posizionare una visione notturna, capace videocamera a soffitto con almeno 120 GB di memoria al di sopra dell'area di registrazione in sala prove. Non superare la capacità di risoluzione dei VTS utilizzati mettendo troppe gabbie all'interno della videocamera telaio vista (ad esempio Ethovision XT 7 da Noldus Information Technology (Leesburg VA) possono contemporaneamente traccia 8 topi in tempo reale).
4. Procedura di test LMA a breve termine
   1. Testare LMA a breve termine durante la fase attiva / scuro del ciclo di luce. Assicurarsi che il tempo relativo al ciclo di luce è ªe stesso in tutti i gruppi, come LMA segue un modello crepuscolare, con più attività durante i periodi iniziali e successive del ciclo di buio ^1. Includere entrambi i soggetti sperimentali e di controllo in ciascun gruppo di topi registrate per garantire i potenziali effetti delle differenze temporali LMA sono ridotti al minimo.
   2. Individualmente casa e ambientarsi topi almeno 24 ore prima dell'inizio della LMA test ^8.
   3. Posizionare i divisori gabbia e gabbie (contenenti singoli topi) direttamente sotto la telecamera. Rimuovere tutto il materiale di nidificazione / arricchimento dalle gabbie, in quanto ciò potrebbe ostacolare la vista del mouse (per esempio se il mouse Burrows / si copre con materiale di nidificazione) e di interferire con la precisione VTS. Mettere un coperchio trasparente in plexiglass su ogni gabbia registrato.
   4. Quando filmare diverse gabbie contemporaneamente, assicurarsi che la risoluzione sia compatibile con il VTS scelti. Per facilitare l'analisi VTS, posizionare le gabbie identiche all'interno di ogni divisore (cioè in alto a destra).
   5. Avviare la registrazione. Iniziare ogni video con una lista che identifica tutte le informazioni sperimentali pertinenti per garantire la corretta identificazione del video indipendente da qualsiasi documentazione non-video aggiuntivo. Utilizzare un timer o cronometro per monitorare la durata delle prove LMA (5-10 min). Se le informazioni di temporizzazione è persa, recuperarlo dal record di video.
   6. Per misure ripetute utilizzando il metodo LMA a breve termine, consentono topi accesso a cibo e acqua durante gli intervalli di non-misura.
   7. Durante il test, tenere eventuali sperimentatori fuori dalla vista dei topi in modo da non agire come un segnale visivo esterno.
   8. Quando il test è finito, ritorno / sostituisce materiale di nidificazione / arricchimento, per ridurre il potenziale per lo sviluppo di ansia comportamento simile ^8.
5. Analisi LMA a breve termine
   1. Conservare le registrazioni video della sessione di test su un supporto di archiviazione compatibili con il VTS utilizzati. Per Ethovision XT 7, un disco del disco rigido viene utilizzato (HDD).
   2. Riproduzione dei video nei VTS con il suo lettore multimediale associato, analizzando i video in tempo reale. In figura 1, le variabili di rilevazione sono state: 2 cm / sec inizia tracking; 1,75 centimetri / sec arresta inseguimento.
   3. Inizialmente, scegliere l'intero pavimento della gabbia, come la regione di interesse (ROI) per il monitoraggio. Per le analisi avanzate, come la valutazione di thigmotaxis, creare più ROI intra-gabbia.
   4. Per gli studi di high-throughput, analizzare tutte le gabbie all'interno del video in contemporanea con singolo piano ROI all-gabbia.
   5. Utilizzare il VTS per calcolare la distanza totale spostato (cm), velocità di movimento (cm / sec) e la durata del movimento (sec). Per Ethovision XT 7, esportare i dati generati in Microsoft Excel per la memorizzazione e l'analisi supplementare.

2. Test LMA lungo termine Set Up e procedura

1. LMA test costruzione gabbia a lungo termine
   1. Tagliare un foro di 5,5 cm di diametro nel muro di breve terminedi una gabbia mouse standard. Creare una copertura per il foro con ¼ in maglia di acciaio zincato. Tagliare la maglia, creando parecchi ½ in aperture per permettere l'accesso del mouse per il cibo. Brunire inoltre maglie taglio per rimuovere bordi taglienti.
   2. Utilizzare maglia aggiuntiva per creare una tramoggia esterno direttamente collegato alla maglia utilizzata per coprire l'apertura 5.5 cm. Collegare la tramoggia per la maglia utilizzata per coprire il buco, e collegare il gruppo alla gabbia con rivetti in alluminio.
   3. Costruire una bottiglia d'acqua da uno standard di 50 ml (Corning) e un tappo di gomma 1 foro (Fisher) che è finita-forato per consentire l'inserimento di nessun-gocciolamento tubo sipper (Sistemi di Sta-Pure). Fissare la bottiglia d'acqua alla gabbia con il velcro (3M) e inserire il tubo sipper attraverso l'apertura coperta maglia.
   4. Durante il test di lunga durata LMA, coprire le gabbie con chiaro ¼ in plexiglas con 11 ¼ x in fori di diametro per sostenere una ventilazione adeguata.
2. Sala prove LMA a lungo termine
   1. Sala prove LMA a lungo termine creato è identico a LMA a breve termine. Vedere la sezione 1.2 per la procedura.
3. A lungo termine LMA videografia
   1. Centro e mettere un soffitto incasso a infrarossi, la sicurezza in stile, fotocamera direttamente collegato ad un PC sopra l'area di registrazione in sala prove. Registrare solo il numero di gabbie subito che si traduce in risoluzione gabbia individuale entro la capacità del VTS utilizzati (ad es Ethovision XT 7 può simultaneamente seguire 8 topi in tempo reale).
4. Procedura di test LMA a lungo termine
   1. Testare LMA lungo termine durante la fase attiva / scuro del ciclo di luce. Assicurarsi che il tempo relativo al ciclo di luce è la stessa in tutti i gruppi, come LMA segue un modello crepuscolare con più attività durante i periodi iniziali e successive del ciclo di buio ^1. Prova entrambi i soggetti sperimentali e di controllo in ciascun gruppo di topi registrati al fine di garantire la riduzione al minimo del potenzialeeffetti delle differenze temporali nella LMA.
   2. Individualmente casa e acclimatare i topi di prova nelle gabbie modificate, per almeno 24 ore.
   3. Posizionare i divisori gabbia e gabbie (contenenti singoli topi) direttamente sotto la telecamera. Rimuovere tutto il materiale / arricchimento nidificazione dalle gabbie per consentire una visibilità di vista del topo. Topo scavando nel materiale di nidificazione possa interferire con la capacità del VTS per tenere traccia del mouse. Posizionare un coperchio trasparente in plexiglas su ciascuna delle gabbie da registrare.
   4. Durante la registrazione di diverse gabbie in una volta, assicurarsi che la risoluzione sia compatibile con il VTS scelti. Per facilitare VTS analisi, posizione gabbie identiche all'interno di ogni divisore (cioè in alto a destra).
   5. Test a lungo termine LMA è generalmente analizzato in tempo reale, e una registrazione video non è di solito creato. Un record video può essere registrato utilizzando una fotocamera secondaria o tramite un registratore DVD collegato alla fotocamera principale. Essere sicuri di mantenere registrazioni dettagliate dei singolimouse e informazioni sul gruppo.
   6. Impostare il VTS per l'analisi in tempo reale. L'intero pavimento della gabbia dovrebbe comprendere il ROI per il monitoraggio. Impostare ROI per tutte le gabbie si sta registrando. Utilizzare il VTS per calcolare la distanza totale spostato (cm), velocità di movimento (cm / sec) e la durata del movimento (sec). Nella Figura 2, le variabili di rilevazione sono state: 2 cm / sec inizia tracking; 1,75 centimetri / sec arresta inseguimento.
   7. Iniziare a registrare il mouse lungo termine LMA. Monitorare la durata della prova lungo termine LMA tramite l'orologio associato al computer analizzando.
   8. Durante il test, mantenere tutti gli sperimentatori fuori dalla vista dei topi in modo da non agire come un segnale visivo esterno.
   9. Quando il test è finito, ritorno / sostituisce materiale di nidificazione / arricchimento, per ridurre il potenziale per lo sviluppo di ansia comportamento simile ^8.
5. Analisi LMA a lungo termine
   1. Analisi LMA lungo termine si verifica in tempo reale senza la generazione di una registrazione video. Esportare i dati in Microsoft Excel per la memorizzazione e l'analisi, se si utilizza Ethovision XT 7.
   2. Per generare una registrazione video per LMA lungo termine, utilizzare una telecamera secondaria. Assicurarsi che la fotocamera secondaria dispone di ampie capacità di archiviazione sufficiente per memorizzare la registrazione potenzialmente lungo (s).

Representative Results

Un esempio di risultati di una misure ripetute, prova LMA breve termine è mostrato in Figura 1. Questa figura mostra che, dopo lipopolisaccaride (LPS), l'amministrazione, i topi alloggiati in gabbie ventilate individualmente (IVC) recuperare l'attività locomotoria a breve termine più velocemente di topi alloggiati in ambiente ambiente ingabbiamento (AEC) ^6. Mentre la perdita iniziale di attività locomotoria è simile tra LPS gruppi iniettati, il recupero di basale LMA è più rapida in IVC-alloggiati topi come era la velocità di movimento (figura 1b) e la durata del movimento (Figura 1c). L'uso di un modello a misure ripetute con questo test LMA breve termine permette l'osservazione e il confronto di recupero nel tempo tra gruppi diversi.

A lungo termine prova LMA esempio è mostrato in Figura 2. Questo dato dimostra locomozione mouse durante 12 ore di prove al giorno su 2 distinti ma consecutivi giorni. No diffe significativo renza a distanza spostato (figura 2a), è stata trovata velocità di movimento (Figura 2b) o alla durata del movimento (figura 2c) tra questi 2 giorni (dati non pubblicati pilota). Mentre vi è una quantità significativa di errore dovuto ad un piccolo campione, questi risultati illustrano che dati coerenti e ripetibili possono essere generati nel corso dei giorni consecutivi, consentendo il potenziale per gli studi locomozione più lungo termine per essere eseguita senza la necessità di impiantato trasmettitori e biotelemetria. Sebbene sottodimensionato, il 1 giorno contro 2 giorno differenza nella distanza spostato (figura 2a) sembra dovuto a dissomiglianza nella durata del movimento (figura 2c) e non a una differenza di velocità (Figura 2b).

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Figura 1. Perdita di LPS-indotta di attività locomotoria nei topi alloggiati in ambiente ambiente ingabbiamento (AEC) e messa in gabbia ventilata singolarmente (IVC). Gruppo topi alloggiati (4 per gabbia) da entrambi AEC o IVC abitazioni sono stati alloggiati individualmente prima dell'inizio della LMA a breve termine test. I topi sono stati iniettati con LPS (100 ng / kg) e (a) distanza spostati (cm), (b) velocità di movimento (cm / sec) e (c) Durata di movimento (s) sono stati valutati nei tempi indicati. I risultati sono espressi come percentuale basale (pre-LPS) LMA, significa ± SEM, n = 6. Distanza spostato effetti principali: il tempo (F (3,77) = 13,08, P <0,01), il tipo di alloggiamento (F (1,77) = 3.69, P = 0.06), il tempo x interazione custodia tipo (F (3,77) = 3.31, P = 0.02). Velocità di movimento effetti principali: tempo (F (3,77) = 13,08, P <0,01); Tipo di alloggiamento (F (1,77) = 3.69, P = 0.06); tempo x hous ing interazione di tipo (F (3,77) = 3.31, p = 0,0243). Durata del movimento effetti principali: tempo (F (3,77) = 12,92, P <0,01); Tipo di alloggiamento (F (1,77) = 0,69, p = 0,41); tempo x interazione custodia tipo (F (3,77 ) = 3.26, P = 0.03). Bar all'interno dei singoli punti di tempo senza lettere comuni apice sono significativamente differenti (P <0,05). # Ristampato da: Brain Behav. e Immun., 26 (6), York, JM, et al., gabbie a ventilazione individuale causare basso grado di ipossia topi croniche incidono ematologicamente e comportamentale, 951-958, Copyright 2012, con il permesso di Elsevier. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 2. Mouse. Gruppo topi alloggiati LMA a lungo termine (4 per gabbia) sono stati alloggiati individualmente prima dell'inizio dei test a lungo termine LMA. Topi LMA è stata analizzata in tempo reale per 12 ore (giorno 1), e negli stessi topi 1 giorno dopo (giorno 2). I risultati sono espressi come (a) distanza totale spostata (cm x 1.000), (b) velocità di movimento (cm / sec) e (c) Durata di movimento (sec x 1.000) mezzi ± SEM, n = 4 (nessuna differenza significativa tra 0 e 24 ore) (dati non pubblicati pilota).

Discussion

I sintomi della malattia nei topi includono letargia, perdita di interesse in un ambiente sociale e ambientale, malessere e anoressia ^2-3. Nei topi e altri roditori, LMA può essere utilizzato per valutare la malattia dopo immunitario attivazione ^4-5. Inoltre, LMA a lungo termine offre la possibilità di monitorare il movimento su una 24 ore (o superiore) periodo, permettendo l'analisi delle alterazioni indotte dal trattamento nel comportamento circadiano o disturbi nel sonno / veglia. LMA offre diversi vantaggi rispetto ad altri test per malattia poiché è non invasivo, facilmente eseguita come una misura ripetuta o modalità continua ed è minimamente confondenti. Rispetto ad altri metodi e sistemi (ad esempio Phenotyper, Intellecage, sistemi photobeam), analisi LMA con VTS è relativamente poco costoso, perché più le gabbie possono essere registrati / analizzati simultaneamente. Anche se non è utilizzato qui, ulteriori analisi delle attività di LMA, come l'allevamento e l'arrampicata su parete può essere raggiunto attraverso l'uso diuna telecamera montato lateralmente. Con VTS, LMA è high-throughput adattabile. VTS permette anche di un esame più approfondito del movimento compresa la determinazione di durata, la distanza, la velocità e il percorso ^5. Tracciamento percorso è particolarmente potente in quanto è alla base dei comportamenti di ansia.

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, un potenziale problema inerente alla LMA con VTS è l'isolamento / singolo alloggiamento del mouse fino a (e forse superiore) 24 hr. L'isolamento sociale può indurre una risposta di stress e aggressività quando prolungata ^11. Gli investigatori devono essere consapevoli di questa limitazione e di adottare misure per garantire un adeguato controllo sperimentale e l'interpretazione dei risultati.

Durante tutti i test comportamentali, tra cui il mouse LMA, attenzione alle considerazioni pre-sperimentali è essenziale per ottenere risultati coerenti. Acclimatazione alla sala prove e gli ambienti di gabbia di prova è essenziale. Aberrante il rumore, la luce e il suono sono particolarmente interfeAnello in quanto potrebbero provocare una risposta di trasalimento e / o comportamenti ansia ^7-8. Idealmente, il test LMA dovrebbe verificarsi in un ambiente controllato di temperatura e umidità libera di odori nocivi (odori predatori soprattutto naturali). Una suite di test comportamentali fisso che permette di alloggiamento degli animali per lunghi periodi di tempo (giorni) è auspicabile. La capacità di ritornare topi per la funzione di cura degli animali è vantaggioso poiché ripetute prove è molto utile nello studio di invecchiamento o di malattie croniche.

Infine, prova LMA dovrebbe essere eseguita in combinazione con quasi tutti gli altri test comportamentali, perché quasi tutti questi test richiedono il movimento del mouse. Perturbato LMA impatti test per cognizione (Barnes labirinto, labirinto Y, T labirinto, romanzo di riconoscimento di oggetti), ansia comportamento simile (Zero labirinto, campo aperto), ricerca del piacere (ruota in esecuzione), il comportamento depressivo-like (saccarosio / saccarina preferenza ) e malattia (ritiro sociale e scavatori) ^8-9. Testando breve e long termine LMA, differenze fenotipiche tra ¹⁰ topo sotto-ceppi, genotipi e malattia / modelli di intervento può essere rapidamente valutati mentre non influenza in modo significativo le successive prove comportamentali. Inoltre, se rilevanti differenze di movimento sono identificate possano essere adottate misure appropriate prima della promulgazione di test comportamentali più complessi che sono limitati dalle confonde inerenti essi inducono.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.