Souris à court et à long terme de l'activité locomotrice analysées par un logiciel de suivi de la vidéo

Summary

l'activité locomotrice (LMA) est une mesure simple et facile à réaliser de comportement chez la souris. Couplage d'un logiciel de suivi vidéo (VTS) et LMA permet l'amélioration de la spécificité et de la sensibilité, surtout en comparaison avec le manuel, la ligne de méthode de franchissement d'analyse LMA. En outre VTS permet un suivi à long terme des souris LMA.

Abstract

l'activité locomotrice (LMA) est une mesure simple et facile à réaliser de comportement chez les souris et autres rongeurs. L'amélioration des logiciels de suivi vidéo (VTS) ont permis d'être couplée à des tests LMA, améliorant considérablement la spécificité et la sensibilité par rapport à la méthode des croisements de ligne avec une notation manuelle. En outre, VTS permet l'expérimentation à haut débit. Bien que similaire au suivi vidéo automatisé utilisé pour l'essai en plein champ (OFT), les tests LMA est unique en ce qu'elle permet souris à rester dans leur cage et ne pas utiliser le stimulus anxiogène de l'éclairage lumineux pendant la phase active de la lumière-obscurité cycle. Traditionnellement, LMA a été utilisé pendant de courtes périodes de temps (min), tandis que les études des mouvements plus longs (heures-jours) ont souvent utilisé implanté émetteurs et biotélémétrie. Avec la possibilité de suivre en temps réel, à long, comme les tests LMA à court terme, peut maintenant être réalisée en utilisant la vidéographie. LMA tests à long terme nécessite une spécialisée, Mais facile à construire, cage de sorte que la nourriture et de l'eau (qui est habituellement placé sur le dessus de la cage) n'entrave pas la vidéographie. Surtout, la vidéographie et VTS permet la quantification de paramètres, tels que le chemin de mouvement de la souris, qui sont difficiles ou impossibles à mesurer avec la ligne de passage et / ou biotélémétrie. En somme, les tests LMA couplé à VTS offre une description plus complète des mouvements de la souris et la capacité d'examiner locomotion sur une période de temps prolongée.

Protocol

1. Set LMA court terme Jusqu'à et de procédure

1. À court terme LMA cage mis en place
   1. Essai à court terme LMA dans la cage d'accueil de souris à un seul logement. Pour faciliter l'analyse d'image VTS-dépendant, utiliser la literie à haut contraste avec la couleur souris (ie literie de couleur sombre pour les souris blanches et une literie de couleur claire pour souris noires).
   2. Au cours des essais LMA à court terme, couvrir cages avec ¼ clair en plexiglas avec 11 x ¼ dans des trous d'un diamètre de soutenir une ventilation appropriée.
2. Salle d'essai à court terme LMA
   1. Testez souris dans un environnement propre dans lequel ils ont été acclimatés à au moins 24 h ^8.
   2. Pour éclairer l'environnement de test, utilisez couveuse lumières de serrage avec des ampoules rouges (<125 lumens). Avant la vidéographie, ajuster l'angle et la position des feux de supprimer les reflets du haut de la cage en plexiglas.
   3. Supprimer ou éviter le bruit ambiantau-dessus de 70 dB. Utilisation d'un générateur de bruit blanc si intermittente bruit de fond est inévitable pendant le test de la souris.
   4. Couvrir la surface d'essai sur lequel les cages sont placées dans la salle d'examen avec boucher ou du papier de paillasse de laboratoire de couleur similaire à la literie de cage, dans le cas où le sol de la cage est exposée au cours de la vidéographie.
3. À court terme LMA vidéographie
   1. Centre et placer une nuit caméra vidéo capable de vision au plafond avec au moins 120 Go de mémoire au-dessus de la zone d'enregistrement dans la salle d'examen. Ne pas dépasser la capacité de résolution des VTS utilisés en plaçant trop de cages dans la vue caméra image vidéo (par exemple Ethovision XT 7 par Noldus technologies de l'information (Leesburg VA) peut suivre simultanément 8 souris en temps réel).
4. Procédure de test LMA à court terme
   1. Essai à court terme LMA pendant la phase active / sombre du cycle de la lumière. Assurez-vous que le temps par rapport au cycle de la lumière est ee même dans tous les groupes, comme LMA suit un modèle crépusculaire, avec plus d'activité pendant les périodes de début et plus tard du cycle sombre ^1. Inclure les sujets expérimentaux et de contrôle dans chaque groupe de souris enregistrés pour s'assurer que les effets potentiels de différences temporelles LMA sont minimisés.
   2. Individuellement maison et s'acclimater souris au moins 24 heures avant le début de la LMA tests ^8.
   3. Placez les diviseurs de la cage et les cages (contenant des souris individuelles) directement sous la caméra. Retirez tous les matériaux de nidification / enrichissement des cages, ce qui pourrait obstruer la vue de la souris (par exemple, si la souris terriers / se couvre de matériaux de nidification) et interférer avec précision VTS. Placez un couvercle en plexiglas clair sur chaque cage enregistré.
   4. Quand filmer plusieurs cages simultanément, assurez-vous que la résolution est compatible avec les VTS choisies. Pour faciliter l'analyse des VTS, positionner les cages identique au sein de chaque division (ie coin en haut à droite).
   5. Commencer l'enregistrement. Commencez chaque vidéo avec une ardoise qui identifie toutes les informations expérimentales pertinentes pour assurer l'identification correcte de la vidéo indépendante de toute documentation non-vidéo supplémentaire. Utilisez une minuterie ou un chronomètre pour suivre la durée des essais LMA (5-10 min). Si les informations de synchronisation est perdue, le récupérer à partir de l'enregistrement vidéo.
   6. Pour des mesures répétées en utilisant la méthode LMA à court terme, permettent souris accès à la nourriture et à l'eau pendant les intervalles non-mesure.
   7. Lors des tests, conserver les expérimentateurs hors de la vue des souris afin de ne pas agir comme un repère visuel extérieur.
   8. Lorsque le test est terminé, retour / remplacent des matériaux de nidification / enrichissement, afin de réduire le potentiel de développement de l'anxiété-comme le comportement ^8.
5. LMA analyse à court terme
   1. Conserver les enregistrements vidéo de la séance de test à un support d'archivage compatibles avec les VTS utilisés. Pour Ethovision XT 7, un disque sur le disque dur (HDD) est utilisé.
   2. Rejouer les vidéos dans les VTS en utilisant son lecteur multimédia associé, l'analyse des vidéos en temps réel. Dans la figure 1, les variables de détection étaient: 2 cm / s commence à suivre; 1,75 cm / sec suivi s'arrête.
   3. Initialement, choisissez l'ensemble du plancher de la cage comme la région d'intérêt (ROI) pour le suivi. Pour les analyses avancées, telles que l'évaluation de thigmotaxis, créer ROI intra-cage multiple.
   4. Pour les études à haut débit, d'analyser toutes les cages dans la vidéo simultanément avec ROI de sol tout-cage individuelle.
   5. Utilisez les VTS pour calculer la distance totale déplacée (cm), vitesse de déplacement (cm / sec) et la durée du mouvement (s). Pour Ethovision XT 7, d'exporter les données générées dans Microsoft Excel pour le stockage et l'analyse supplémentaire.

2. Test LMA à long terme et méthode de

1. Construction de la cage tests LMA long terme
   1. Coupez un trou d'un diamètre de 5,5 cm dans le mur à court termed'une cage de souris standard. Créer une couverture pour le trou avec ¼ en maille d'acier galvanisé. Couper le filet, créant plusieurs ½ dans les ouvertures pour permettre l'accès de la souris à l'alimentation. Burnish une maille coupe pour enlever les arêtes vives.
   2. Utiliser une maille supplémentaire pour créer une trémie externe directement connecté à la maille utilisée pour couvrir le cm ouverture 5.5. Branchez la trémie de la maille utilisée pour couvrir le trou et fixez l'ensemble de la cage à l'aide de rivets en aluminium.
   3. Construire une bouteille d'eau à partir d'un standard de 50 ml conique (Corning) et un bouchon de caoutchouc 1 trou (Fisher) qui est sur-percé pour permettre l'insertion des anti-goutte tube de siroter (Systèmes Sta-Pure). Fixez la bouteille d'eau à la cage avec une bande Velcro (3M) et insérer le tube de siroter à travers les mailles ouverture couverte.
   4. Au cours des essais LMA long terme, couvrir cages avec ¼ clair en plexiglas avec 11 x ¼ dans des trous d'un diamètre de soutenir une ventilation appropriée.
2. Salle d'essai à long terme LMA
   1. Salle de test LMA à long terme mis en place est identique à court terme LMA. Voir la section 1.2 pour la procédure.
3. À long terme LMA vidéographie
   1. Centre et placer un plafonnier infrarouge, la sécurité de style, appareil photo directement lié à un PC au-dessus de la zone d'enregistrement dans la salle d'examen. Enregistrer uniquement le nombre de cages à la fois que les résultats dans la résolution des cages individuelles dans la capacité des VTS utilisés (par exemple Ethovision XT 7 peut suivre simultanément 8 souris en temps réel).
4. Procédure de test LMA long terme
   1. Testez long terme LMA pendant la phase active / sombre du cycle de la lumière. Assurez-vous que le temps par rapport au cycle de la lumière est la même dans tous les groupes, comme LMA suit un modèle crépusculaire avec plus d'activité pendant les périodes de début et plus tard du cycle sombre ^1. Testez les deux sujets expérimentaux et de contrôle dans chaque groupe de souris enregistrés pour assurer la minimisation du potentieleffets des différences temporelles LMA.
   2. Individuellement maison et acclimater les souris testées dans les cages modifiées pour au moins 24 heures.
   3. Placez les diviseurs de la cage et les cages (contenant des souris individuelles) directement sous la caméra. Retirez tous les matériaux de nidification / d'enrichissement des cages afin d'assurer une vue sans obstacle de la souris. Souris creuser dans le matériau de nidification va interférer avec la capacité des VTS pour suivre la souris. Placez un couvercle en plexiglas clair sur chacune des cages d'être enregistrées.
   4. Lors de l'enregistrement de plusieurs cages à la fois, assurez-vous que la résolution est compatible avec les VTS choisies. Pour faciliter la STM analyse, la position des cages identiques au sein de chaque division (ie coin en haut à droite).
   5. LMA tests à long terme est généralement analysée en temps réel et un enregistrement vidéo n'est généralement pas créé. Un enregistrement vidéo peut être enregistrée à l'aide d'une caméra secondaire ou par l'intermédiaire d'un enregistreur de DVD relié à l'appareil principal. Soyez sûr de garder des registres détaillés de personnesouris et des informations de groupe.
   6. Mettre en place les VTS pour l'analyse en temps réel. L'ensemble du plancher de la cage devrait englober le retour sur investissement pour le suivi. Mettre en place ROI pour toutes les cages étant enregistrées. Utilisez les VTS pour calculer la distance totale déplacée (cm), vitesse de déplacement (cm / sec) et la durée du mouvement (s). Dans la figure 2, les variables de détection étaient: 2 cm / s commence à suivre; 1,75 cm / sec suivi s'arrête.
   7. Commencer l'enregistrement de la souris à long terme LMA. Contrôler la durée du test LMA à long terme par l'intermédiaire de l'horloge associée à l'ordinateur d'analyse.
   8. Pendant le test, garder tous les expérimentateurs hors de la vue des souris afin de ne pas agir comme un repère visuel extérieur.
   9. Lorsque le test est terminé, retour / remplacent des matériaux de nidification / enrichissement, afin de réduire le potentiel de développement de l'anxiété-comme le comportement ^8.
5. LMA analyse à long terme
   1. LMA analyse à long terme se produit en temps réel sans la génération d'un enregistrement vidéo. Exporter les données dans Microsoft Excel pour le stockage et l'analyse, si vous utilisez Ethovision XT 7.
   2. Pour générer un enregistrement vidéo de longue durée LMA, utiliser un appareil photo secondaire. Assurez-vous que l'appareil photo secondaire a une capacité de stockage amplement suffisant pour stocker le processus potentiellement long enregistrement (s).

Representative Results

Un exemple des résultats d'une des mesures répétées, essai LMA à court terme est illustré à la figure 1. Cette figure montre que, après administration lipopolysaccharide (LPS), les souris logés dans des cages individuellement ventilées (IVC) récupérer l'activité locomotrice à court terme plus rapidement que les souris hébergées dans l'air ambiant environnement cage (AEC) ^6. Alors que la perte initiale de l'activité locomotrice est similaire entre les groupes injectés LPS, la reprise basal LMA est plus rapide chez les souris IVC-logés comme c'était vitesse de déplacement (figure 1b) et la durée du mouvement (figure 1C). L'utilisation d'un modèle de mesures répétées avec ce test LMA à court terme permet l'observation et la comparaison de récupération au cours du temps entre les différents groupes.

Un exemple de test à long terme LMA est montré à la figure 2. Ce chiffre démontre la locomotion des souris pendant 12 heures de tests quotidiens sur 2 jours distincts mais consécutifs. Aucune diffé importante rence de distance de déplacement (figure 2a), la vitesse de mouvement (figure 2b) ou à la durée de mouvement (Figure 2c) a été trouvée entre ces 2 jours (données pilotes non publiés). Bien qu'il existe une quantité importante d'erreur due à une petite taille de l'échantillon, ces résultats illustrent le fait que des données cohérentes et répétables peuvent être générés au cours des jours consécutifs, permettant le potentiel pour les études de locomotion à long terme pour être exécutée sans la nécessité d'implanter émetteurs et biotélémétrie. Bien que de faible puissance, de 1 jour par rapport à la différence 2 jours en distance parcourue (Figure 2a) semble due à une dissemblance dans la durée du mouvement (figure 2c) et non à une différence de vitesse (Figure 2b).

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Figure 1. Groupe souris hébergées de perte induite par le LPS de l'activité locomotrice chez la souris logées dans des cages de l'environnement ambiant (AEC) et cages individuellement ventilées (IVC). (4 par cage), soit auprès AEC ou logement IVC ont été logés individuellement avant le début de court terme LMA test. Les souris ont été injectées avec LPS (100 ng / kg) et (a) distance parcourue (cm), (b) vitesse de déplacement (cm / sec) et (c) la durée du mouvement (s) ont été évalués dans les délais indiqués. Les résultats sont exprimés en pour cent de base (avant-LPS) LMA, moyenne ± SEM, n = 6. Distance parcourue effets principaux: le temps (F (3,77) = 13,08, P <0,01), le type de logement (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), le temps x interaction de type de logement (F (3,77) = 3,31, P = 0,02). Vitesse de déplacement principaux effets: le temps (F (3,77) = 13,08, P <0,01), le type de logement (F (1,77) = 3,69, P = 0,06); temps x logement ING interaction de type (F (3,77) = 3.31, P = 0,0243). Durée de mouvement principaux effets: le temps (F (3,77) = 12,92, P <0,01), le type de logement (F (1,77) = 0,69, P = 0,41); temps x interaction de type de logement (F (3,77 ) = 3.26, P = 0,03). Bars dans des moments individuels sans lettres en exposant communes sont significativement différentes (P <0,05). # Tiré de: Brain Behav. et Immun., 26 (6), York, JM, et al., cages individuellement ventilées provoquer souris chronique de bas grade hypoxie impact hématologique et comportemental, 951-958, Copyright 2012, avec la permission d'Elsevier. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. LMA. Groupe souris hébergées à long terme chez la souris (4 par cage) ont été logés individuellement avant le début des essais LMA long terme. Souris LMA a été analysée en temps réel pendant 12 heures (jour 1), et dans les mêmes souris un jour plus tard (jour 2). Les résultats sont exprimés en (a) distance totale déplacée (cm x 1,000), (b) vitesse de déplacement (cm / sec) et (c) la durée du mouvement (sec x 1,000) moyenne ± sem, n = 4 (pas de différence significative entre 0 et 24 h) (données pilotes non publiées).

Discussion

Les symptômes de la maladie chez les souris comprennent la léthargie, perte d'intérêt dans un cadre social et environnemental, malaise et anorexie ^2-3. Chez les souris et autres rongeurs, LMA peut être utilisé pour évaluer la maladie après activation immunitaire ^4-5. En outre, à long terme LMA offre la possibilité de suivre le mouvement sur un 24 heures (ou plus), permettant ainsi l'analyse des altérations induites par le traitement de comportement circadien ou perturbations dans le sommeil / éveil modèles. LMA offre plusieurs avantages par rapport à d'autres tests pour la maladie car elle est non-invasive, facilement réalisée comme une mesure répétée ou continue et modalité est peu confondant. Comparé à d'autres méthodes et systèmes (p. ex Phenotyper, Intellecage, les systèmes photobeam), l'analyse LMA avec VTS est relativement peu coûteux, car plusieurs cages peuvent être enregistrées / analysés simultanément. Même s'il n'est pas utilisé ici, une analyse supplémentaire des activités LMA comme l'élevage et mur d'escalade peut être atteint grâce à l'utilisation deune caméra montée sur le côté. Avec VTS, LMA est à haut débit adaptable. VTS permet également un examen plus approfondi du mouvement y compris la détermination de la durée, la distance, la vitesse et la trajectoire ^5. suivi de trajectoire est particulièrement puissante car elle sous-tend les comportements anxieux.

Malgré ses nombreux avantages, un écueil potentiel inhérent à la LMA avec VTS est l'isolement / boîtier unique de souris jusqu'à (et éventuellement dépasser) 24 h. L'isolement social peut induire une réaction de stress et d'agressivité quand prolongée ^11. Les enquêteurs doivent être conscients de cette limitation et prendre des mesures pour assurer le contrôle expérimental et l'interprétation des résultats.

Durant tous les tests comportementaux, y compris les souris LMA, une attention particulière aux considérations pré-expérimentales est essentiel pour atteindre des résultats cohérents. L'acclimatation à la salle d'examen et les environnements de la cage de test est essentielle. Aberrant bruit, la lumière et le son sont particulièrement interféanneau, car ils peuvent provoquer une réaction de sursaut et / ou le comportement d'anxiété ^7-8. Idéalement, les tests LMA devrait se produire dans un environnement de température et humidité contrôlées sans odeurs nauséabondes (odeurs de prédateurs naturels en particulier). Une suite de tests comportementaux fixe qui permet pour le logement des animaux pendant de longues périodes de temps (jours) est souhaitable. La possibilité de retourner la souris pour l'établissement de soins des animaux est avantageuse car des tests répétés est très utile dans l'étude du vieillissement ou les maladies chroniques.

Enfin, les tests LMA doit être effectuée en collaboration avec presque tous les autres tests de comportement parce que presque tous ces tests nécessitent mouvement de la souris. S'inquiétant LMA essais d'impacts pour la cognition (labyrinthe Barnes, labyrinthe en Y, labyrinthe T, roman reconnaissance d'objet), l'anxiété comme le comportement (Zero labyrinthe, en plein champ), la recherche du plaisir (roue porteuse), le comportement dépressif comme (saccharose / saccharine préférence ) et la maladie (retrait social et fouisseurs) ^8-9. En testant à court et à long terme LMA, les différences phénotypiques entre ¹⁰ sous-souches, les génotypes et les maladies / modèles intervention souris peut être évaluée rapidement sans influencer de manière significative les tests comportementaux ultérieurs. En outre, si les différences de mouvements importants sont identifiés des mesures appropriées peuvent être prises avant l'adoption de tests comportementaux plus complexes qui sont limités par les confond inhérents qu'elles induisent.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.