Мышь Краткосрочные и долгосрочные двигательную активность Анализируемый видео отслеживания программного обеспечения

Summary

Двигательная активность (LMA) является простой и легко выполнить измерение поведения у мышей. Муфта отслеживания видео программное обеспечение (СДС) и LMA позволяет для улучшения специфичности и чувствительности, особенно по сравнению с ручной, линии пересечения методом LMA анализа. Кроме того VTS позволяет долгосрочное отслеживание мыши LMA.

Abstract

Двигательная активность (LMA) является простой и легко выполнить измерение поведения у мышей и других грызунов. Улучшения в видео отслеживания программного обеспечения (СДС) позволили ему быть соединен с LMA тестирования, что значительно улучшает специфичность и чувствительность по сравнению с методом переходов рек с скоринга руководстве. Кроме того, ВЦ обеспечивает высокую пропускную экспериментов. В то время как аналогичные автоматического отслеживания видео используется для открытого тестирования в полевых условиях (УДК), LMA тестирования уникальна тем, что она позволяет мышам оставаться в клетках, где их и не использует анксиогенные стимулом яркое освещение во время активной фазы света и темноты цикла. Традиционно LMA была использована в течение коротких периодов времени (минут), в то время как больше движения исследованиях (часов-дней) часто использовали имплантировали передатчики и биотелеметрии. С возможностью отслеживать реального времени, долго, как краткосрочное тестирование LMA, теперь может быть проведено с использованием видеосъемки. Долгосрочные LMA тестирования требует специализированного, Но легко построить, клетку так, что пища и вода (которая, как правило, расположены на верхней клеткой) не препятствует видеосъемка. Важно отметить, что видеосъемка и VTS позволяет для количественной оценки параметров, таких как путь движения мыши, которые трудно или невозможным измерить с пересечения линий и / или биотелеметрии. В общем, LMA тестирования, соединенный с VTS обеспечивает более полное описание движение мыши и способность исследовать передвижение в течение длительного периода времени.

Protocol

1. Краткосрочные LMA настройки и процедуры

1. Краткосрочные LMA клетке создали
   1. Тестирование краткосрочных LMA в доме клетку одного размещен мыши. Для облегчения VTS-зависимых анализа изображений, использовать постельные принадлежности в высокой контрастности цвета с мышью (т.е. темные постельные принадлежности для белых мышей и светлые постельные принадлежности для черных мышей).
   2. Во время краткосрочного тестирования LMA, накрыть клетки с четкими ¼ в оргстекла с 11 х ¼ диаметра отверстий для соответствующей вентиляции.
2. Краткосрочные LMA комнату тестирования
   1. Тестирование мышей в чистой окружающей среде, в которой они были акклиматизировались в течение по крайней мере 24 часов ^8.
   2. Для правильного освещения среды тестирования, используйте свет брудером зажим с красной луковицы (<125 люмен). До видеосъемка, отрегулировать угол наклона и положение фары для удаления бликов или отражений от вершин оргстекла клетке.
   3. Удалить или избежать шума номеравыше 70 дБ. Используйте генератор белого шума, если прерывистое фоновые шумы неизбежны во время тестирования мышь.
   4. Накройте тестирования поверхности, на которую клетки помещаются в комнату тестирования с мясником или лабораторном столе бумаги аналогичного цвета в клетку постельные принадлежности, в случае, если пол клетки подвергается во время видеосъемки.
3. Краткосрочные LMA видеосъемка
   1. Центр и поместить потолочных ночного видения с поддержкой видео камера с не менее 120 ГБ памяти, расположенные над областью записи в комнату тестирования. Не превышайте разрешающей способности СДС используются делать слишком много клеток в представлении видеокамеры кадра (например Ethovision XT 7 Noldus по информационным технологиям (Leesburg VA) может одновременно сопровождать 8 мышей в режиме реального времени).
4. Краткосрочные LMA процедура тестирования
   1. Тестирование краткосрочных LMA во время активного / темно-фазы светового цикла. Убедитесь, что время относительно светового цикла йэлектронной одинаковым для всех групп, а LMA следующим сумеречный узором, с большей активностью в начале и более поздних периодов темного цикла ^1. Включает как экспериментальных и контрольных субъектов в каждой группе мышей записаны чтобы обеспечить потенциальное воздействие временных различий в LMA сведены к минимуму.
   2. Индивидуально дом и акклиматизироваться мышей по крайней мере 24 ч до начала LMA тестирования ^8.
   3. Поместите клетку перегородки и клетки (содержащие отдельные мышей) непосредственно под камерой. Удалить все вложенности / обогащения материала из клетки, так как это может помешать обзору мыши (например, если мышь нор / покрывает себя раскроя материала) и мешать точность СДС. Наведите прозрачной крышкой из плексигласа на каждой клетке записано.
   4. Когда видеосъемку нескольких клетках одновременно, будь уверена, что решение совместимо с выбранным СДС. Для облегчения анализа VTS, расположить клетки одинаково в пределах каждого делителя (т.е. правом верхнем углу).
   5. Начать запись. Начинайте каждое видео с листа, который идентифицирует все соответствующие экспериментальной информации для обеспечения надлежащей идентификации видео независимо от любых дополнительных не-видео документации. Используйте таймер или секундомер, чтобы отслеживать продолжительность LMA тестирования (5-10 мин). Если информации о времени потеряно, восстановить по видеозаписи.
   6. Для повторного использования мер краткосрочного LMA метода, позволяют мышам доступ к пище и воде в течение не-интервалов измерения.
   7. Во время тестирования, не допускайте попадания экспериментаторы из виду мышей, чтобы не выступать в качестве внешнего визуального сигнала.
   8. Когда тестирование закончится, вернуть / заменить вложенности / обогащение материала, чтобы уменьшить потенциал для развития тревоги-подобное поведение ^8.
5. Краткосрочные LMA анализа
   1. Храните видеозаписей из тестовой сессии архивных данных Совместимые с СДС использовал. Для Ethovision XT 7, жесткий диск (HDD) используется.
   2. Воспроизведение видео в СДС использованием связанного медиаплеер, анализируя видео в режиме реального времени. На рисунке 1, обнаружение переменные были: 2 см / сек начинает отслеживать; 1,75 см / сек останавливает слежения.
   3. Изначально выбрать весь пол клетки, как область интереса (ROI) для слежения. Для продвинутых анализы, такие как оценка thigmotaxis, создайте несколько внутри клетки трансформирования.
   4. Для высокой пропускной исследования, проанализировать все клетки в видео одновременно с индивидуальными все-пол клетки трансформирования.
   5. Используйте VTS для расчета общей пройденное расстояние (см), скорость передвижения (см / сек) и продолжительность движения (SEC). Для Ethovision XT 7, экспортировать данные, полученные в Microsoft Excel для хранения и дополнительного анализа.

2. Долгосрочные LMA тестового набора и ход

1. Долгосрочные LMA тестирования клетке строительства
   1. Отрежьте 5,5 см диаметром отверстия в коротких торцевой стенкестандартной клетке мыши. Создать покрытие для отверстия ¼ из оцинкованной стальной сеткой. Разрежьте сетку, создав несколько ½ в отверстиями, которые обеспечивают мыши доступа к продовольствию. Burnish любой разрез сетки для удаления острых краев.
   2. Используйте дополнительные сетки для создания внешнего бункера непосредственно связан с сеткой используется для покрытия 5,5 см открытия. Подключите бункера в сетка используется, чтобы покрыть отверстие, и прикрепите узел к клетке с использованием алюминиевых заклепок.
   3. Построить бутылку воды из стандартной 50 мл конические (Corning) и 1 отверстие резиновой пробки (Fisher), который составляет более просверленные чтобы для вставки без подтекания трубки Sipper (Sta-Pure Systems). Закрепите бутылку воды в клетку с лентой Velcro (3M) и вставьте Sipper трубки через сетку покрыты открытия.
   4. Во время длительного тестирования LMA, накрыть клетки с четкими ¼ в оргстекла с 11 х ¼ диаметра отверстий для соответствующей вентиляции.
2. Долгосрочные LMA комнату тестирования
   1. Долгосрочные LMA комнату тестирования созданы идентична краткосрочных LMA. См. раздел 1.2 для процедуры.
3. Долгосрочные LMA видеосъемка
   1. Центр и поместить потолочных инфракрасных, безопасность стиле, камеры непосредственно подключается к ПК выше области записи в комнату тестирования. Только записи количества клеток сразу, что результаты в отдельных разрешение клетке в пределах возможностей СДС использоваться (например, 7 Ethovision XT может одновременно сопровождать 8 мышей в режиме реального времени).
4. Долгосрочные LMA процедура тестирования
   1. Тестирование долгосрочного LMA во время активного / темно-фазы светового цикла. Убедитесь, что время относительно светового цикла является одинаковым для всех групп, а LMA следующим сумеречной картины с большей активностью в начале и более поздних периодов темного цикла ^1. Тестирование и экспериментальных и контрольных субъектов в каждой группе мышей записанный для обеспечения минимизации потенциальныхпоследствия временных различий в LMA.
   2. Индивидуально дом и акклиматизироваться тест мышей в модифицированных клетках в течение по крайней мере 24 часов.
   3. Поместите клетку перегородки и клетки (содержащие отдельные мышей) непосредственно под камерой. Удалить все вложенности / обогащения материала из клеток для обеспечения беспрепятственного зрения мыши. Мышь закапывания в раскроя материала будет препятствовать способности СДС для отслеживания мыши. Поместите прозрачной крышкой из плексигласа на каждом из клетки должны быть записаны.
   4. При записи нескольких клетках сразу, убедитесь, поддерживается ли разрешение с выбранным СДС. Для облегчения анализа VTS, положение клетки одинаково в пределах каждого делителя (т.е. правом верхнем углу).
   5. Долгосрочные LMA тестирования обычно анализируются в реальном времени, а запись видео, как правило, не создаются. Запись видео может быть записано с помощью вторичной камере или через DVD-рекордер со ссылкой на первичную камеру. Будьте уверены, чтобы вести подробный учет индивидуальныхмыши и группах.
   6. Настройка СДС для анализа в реальном времени. Весь пол клетка должна охватывать ROI для слежения. Настройка трансформирования для всех клетках записывается. Используйте VTS для расчета общей пройденное расстояние (см), скорость передвижения (см / сек) и продолжительность движения (SEC). На рисунке 2, обнаружение переменные были: 2 см / сек начинает отслеживать; 1,75 см / сек останавливает слежения.
   7. Начать запись мыши долгосрочных LMA. Монитор продолжительности долгосрочного тестирования LMA через часов связанный с анализом компьютера.
   8. Во время тестирования, сохранить все экспериментаторы из виду мышей, чтобы не выступать в качестве внешнего визуального сигнала.
   9. Когда тестирование закончится, вернуть / заменить вложенности / обогащение материала, чтобы уменьшить потенциал для развития тревоги-подобное поведение ^8.
5. Долгосрочный анализ LMA
   1. Долгосрочные LMA анализа происходит в режиме реального времени без образования видеозапись. Экспорта данных в Microsoft Excel для хранения и анализа данных, при использовании Ethovision XT 7.
   2. Чтобы создать запись видео для долгосрочного LMA, использовать дополнительную камеру. Убедитесь, что дополнительная камера имеет достаточно емкость достаточна для хранения потенциально длительной записи (ы).

Representative Results

В качестве примера результаты повторных измерений, краткосрочные LMA теста показан на рисунке 1. Эта цифра показывает, что после липополисахарида (ЛПС) введения мышей размещены в индивидуально вентилируемые останов (IVC) восстановить краткосрочных двигательную активность быстрее, чем мыши размещается в окружающей среде арретирования (AEC) ^6. Хотя первоначальная потеря двигательной активности похожа ЛПС вводили группам, восстановление базального LMA является более быстрым в IVC-размещались мышей, как было скорости движения (рис. 1б) и продолжительность движения (рис. 1в). Использование повторяющихся типовых критериев с этим кратковременное испытание LMA позволяет наблюдение и сравнение с течением времени восстановления между различными группами.

Долгосрочные LMA тестовый пример показан на рисунке 2. Эта цифра демонстрирует передвижения мыши в течение 12 ч ежедневно в течение 2 тестирование отдельных последовательных дней. Никаких существенных Diff # Rence в пройденное расстояние (рис. 2а), скорости движения (рис. 2б) или продолжительность движения (рис. 2, в) было найдено между этими 2 дня (неопубликованные данные пилот). Хотя существует значительное количество ошибки из-за небольшого размера выборки, эти результаты показывают, что последовательное и воспроизводимые данные могут быть получены в течение последовательных дней, позволяя потенциал для долгосрочного исследования передвижения должны быть выполнены без необходимости имплантировали передатчики и биотелеметрии. Хотя недостаточна, 1 день по сравнению с 2 день разница в расстоянии переехал (рис. 2а) возникает из-за несходства в продолжительности движения (рис. 2, в), а не разница в скорости (рис. 2б).

PG "/>
Рисунок 1. LPS-индуцированной потере двигательной активности у мышей размещены в окружающей среде арретирования (AEC) и индивидуально вентилируемые останов (IVC). Группа размещены мышей (4 на клетку) либо из AEC или IVC корпуса разместили по отдельности до начала краткосрочные LMA тестирования. Мышам вводили ЛПС (100 мкг / кг) и (а) пройденное расстояние (см), (б) скорость движения (см / сек) и (с) продолжительность движения (ы) были оценены в указанные моменты времени. Результаты выражают в виде процента базовой линии (предварительно ЛПС) LMA, среднее ± SEM, n = 6. Расстояние переехал Основные эффекты: время (F (3,77) = 13,08, P <0,01), тип корпуса (F (1,77) = 3,69, p = 0,06), время X корпуса типа взаимодействия (F (3,77) = 3,31, p = 0,02). Скорость движения основных эффекта: время (F (3,77) = 13,08, P <0,01), тип корпуса (F (1,77) = 3,69, p = 0,06), время X жилищно Ing типа взаимодействия (F (3,77) = 3,31, p = 0,0243). Продолжительность движения основных эффекта: время (F (3,77) = 12,92, P <0,01), тип корпуса (F (1,77) = 0,69, p = 0,41), время X корпусе типа взаимодействия (F (3,77 ) = 3,26, p = 0,03). Бары в рамках отдельных временных точках, не имеющих общих букв верхнего индекса значительно отличаются (P <0,05). # Перепечатано из: Behav мозга. и Immun., 26 (6), York, JM, и др.., индивидуально вентилируемые клетки вызывают хроническое низкосортных гипоксии влияющих мышей гематологически и поведенчески, 951-958, Copyright 2012, с разрешения Elsevier. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Мышь долгосрочного LMA. Группы размещены мышей (4 животных на клетку) разместили по отдельности до начала долгосрочного тестирования LMA. Мышей LMA был проанализирован в режиме реального времени в течение 12 часов (день 1) и в тех же мышей через 1 день (день 2). Результаты выражены в виде (а) общее пройденное расстояние (см х 1000), (б) скорость движения (см / сек) и (с) продолжительность движения (сек х 1000), среднее ± SEM, п = 4 (без значительной разницы от 0 до 24 часов) (неопубликованные данные пилот).

Discussion

Симптомы болезни у мышей включают летаргию, потерю интереса к социальным и экологическим окружением, недомогание и анорексия ^2-3. У мышей и других грызунов, LMA может быть использован для оценки болезни после активации иммунной ^4-5. Кроме того, долгосрочные LMA предлагает возможность отслеживать движение в течение 24 часов (или больше) периода, что позволяет анализ вызванных лечением изменений в поведении или циркадные нарушения сна / бодрствования. LMA предлагает несколько преимуществ по сравнению с другими тестами по болезни, поскольку он является неинвазивным, легко выполняемая в качестве повторных измерений или непрерывной модальности и минимально смешанные. По сравнению с другими способами и системами (например Phenotyper, Intellecage, photobeam системы), LMA анализа с VTS является относительно недорогим, так как несколько клеток могут быть записаны / анализироваться одновременно. Хотя здесь не используется дополнительный анализ деятельности LMA как воспитание и скалодром может быть достигнуто за счет использованиябоковые камеры. С VTS, LMA является высокой пропускной способностью адаптации. VTS также позволяет для более тщательного изучения движения в том числе определение длительности, расстояния, скорости и пути ^5. Пути отслеживания очень удобно, так он лежит в основе тревоги поведения.

Несмотря на свои многочисленные преимущества, потенциальная ловушка присущие LMA с VTS является изоляция / одном корпусе мыши до (и, возможно, превышающий) 24 часа в сутки. Социальная изоляция может вызвать реакцию на стресс и агрессию при длительном ^11. Следователи должны знать об этом ограничении и принять меры для обеспечения надлежащего контроля и экспериментальные интерпретации результатов.

В течение всего тестирования поведения, в том числе мыши LMA, пристальное внимание на предварительные экспериментальные соображения имеет решающее значение для достижения устойчивых результатов. Акклиматизация в комнату тестирования и тестовые среды клетке имеет важное значение. Аберрантный шум, свет и звук особенно интерферометрыКольцо так как они могут спровоцировать реакцию испуга и / или тревоги поведение ^7-8. В идеале, LMA тестирование должно происходить в контролируемой температуры и влажности атмосферы, свободной от вредных запахов (особенно природного запаха хищника). Фиксированный набор поведенческих тестирования, который позволяет для содержания животных в течение длительного периода времени (дни) является желательным. Возможность возвращать мыши к средству ухода за животными предпочтительно, поскольку повторное тестирование очень полезна в исследование старения или хронических заболеваний.

Наконец, LMA тестирование должно проводиться в сочетании с почти все другие поведенческие тесты, потому что почти все такие тесты требуют движением мыши. Возмущенные LMA воздействия тесты для познания (Barnes лабиринт, лабиринт Y, T лабиринт, признание нового объекта), тревоги-подобное поведение (Zero лабиринте, открытом поле), ищущий удовольствий (колесном ходу), депрессивно-подобного поведения (сахароза / сахарин предпочтения ) и болезни (социальная изоляция и роющих) ^8-9. С помощью тестирования краткосрочные и LОнг перспективе LMA, фенотипические различия между мышью ¹⁰ суб-штаммов, генотипы и болезни / модели вмешательства могут быть быстро оценивать то время как существенно не влияющие последующих поведенческих тестов. Кроме того, если существенные различия движения определены соответствующие меры могут быть приняты до вступления в силу более сложных поведенческих тестов, которые ограничены на присущем путает они вызывают.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.