Muis Kort-en langlopende bewegingsactiviteit Analyzed door Video Tracking Software

Summary

Locomotorische activiteit (LMA) is een eenvoudige en gemakkelijk uitgevoerde meting van het gedrag bij muizen. Koppeling van video tracking software (VTS) en LMA maakt verbetering van specificiteit en gevoeligheid, vooral in vergelijking met de handmatige, lijn kruising werkwijze LMA analyse. Daarnaast VTS staat lange-termijn follow-up van de muis LMA.

Abstract

Locomotorische activiteit (LMA) is een eenvoudige en gemakkelijk uitgevoerde metingen van gedrag in muizen en andere knaagdieren. Verbeteringen in video-tracking-software (VTS) hebben toegestaan ​​dat het wordt gekoppeld aan LMA testen, drastisch te verbeteren specificiteit en sensitiviteit in vergelijking met de lijnoverschrijdingen methode met handmatige scoring. Daarnaast VTS maakt hoge-doorvoer onderzoeksmethoden. Terwijl vergelijkbare geautomatiseerde video volgen voor de open veld test (OFT), LMA testen is uniek in dat het mogelijk muizen in hun kooi blijven en anxiogene stimulus van heldere verlichting niet gebruiken tijdens de actieve fase van de licht-donker cyclus. Traditioneel is LMA is gebruikt voor korte periodes (min), terwijl studies meer beweging (uur-dagen) hebben vaak geïmplanteerde zenders en biotelemetrie. Met de mogelijkheid van real-time tracking, lange, zoals korte termijn LMA testen, kunnen nu worden uitgevoerd met behulp van videografie. Langdurig LMA gebruik vereist een gespecialiseerde, Maar gemakkelijk geconstrueerd kooi zodat voedsel en water (die meestal geplaatst op de kooi geplaatst) niet videografie belemmert. Belangrijker, videografie en VTS staat voor de kwantificering van parameters, zoals de weg van muisbewegingen, die moeilijk of niet haalbaar is om te meten met lijn kruising en / of biotelemetrie zijn. Kortom, LMA testen gekoppeld met VTS verschaft een meer volledige beschrijving van muisbewegingen en de mogelijkheid om voortbeweging onderzoeken over een langere tijdsperiode.

Protocol

1. Kortlopende LMA Set Up en procedure

1. Kortlopende LMA kooi zetten
   1. Test korte termijn LMA binnen de kooi van een enkel-gehuisvest muis. Aan VTS-afhankelijke beeldanalyse te vergemakkelijken, gebruik beddengoed in hoog contrast met de muis kleur (dus donker gekleurd beddengoed voor witte muizen en lichtgekleurd beddengoed voor zwarte muizen).
   2. Tijdens een kortstondige LMA testen, bedekken kooien met duidelijke ¼ in plexiglas met 11 x ¼ diameter gaten om geschikte ventilatie ondersteunen.
2. Kortlopende LMA testkamer
   1. Test muizen in een schone omgeving waarin zij zijn gewend aan ten minste 24 uur ^8.
   2. Het verlichten van de testomgeving, gebruiken broedmachine klem lichten met rode bollen (<125 lumen). Voorafgaand aan videografie, past u de hoek en positie van de lichten om reflectie en schittering te verwijderen uit het plexiglas kooibovenkanten.
   3. Verwijderen of te ontwijken lawaaiboven 70 dB. Gebruik een witte ruis generator als intermitterende achtergrondgeluid is onvermijdelijk tijdens muis testen.
   4. Bedek het testen oppervlak waarop de kooien worden geplaatst in de testkamer met een slager of laboratoriumtafel papier van dezelfde kleur aan de kooi beddengoed, wanneer de kooi bodem wordt blootgesteld tijdens videografie.
3. Kortlopende LMA videografie
   1. Midden en plaats een plafond gemonteerde nachtzicht-staat videocamera met tenminste 120 GB geheugen boven de opname gebied in de testkamer. Neem niet meer dan de resolutie vermogen van de VTS gebruikt door het plaatsen van te veel kooien binnen de video-camera view frame (bijv. Ethovision XT 7 bij Noldus Information Technology (Leesburg VA) kan gelijktijdig volgen 8 muizen in real-time).
4. Kortlopende LMA testprocedure
   1. Test korte termijn LMA tijdens de actieve / donkere fase van het licht cyclus. Zorg ervoor dat de tijd ten opzichte van het licht cyclus is the hetzelfde in alle groepen, als LMA volgt een schemerig patroon, met meer activiteit tijdens de vroege en latere perioden van de donker-cyclus ^1. Omvatten zowel de experimentele en controle proefpersonen in elke groep opgenomen muizen om potentiële effecten van temporele verschillen in LMA zorgen, worden geminimaliseerd.
   2. Individueel huis en acclimatiseren muizen ten minste 24 uur voor aanvang van LMA testen ^8.
   3. Plaats de kooi verdelers en kooien (met individuele muizen) direct onder de camera. Verwijder alle nesten / verrijking materiaal van de kooien, want dit kan de weergave van de muis (bijvoorbeeld als de muis holen / dekt zich in met nestmateriaal) belemmeren en verstoren VTS nauwkeurigheid. Plaats een duidelijke plexiglas deksel op elke kooi opgenomen.
   4. Wanneer videoing meerdere kooien tegelijk, zeker van zijn dat de resolutie is compatibel met de gekozen VTS. Aan VTS-analyse te vergemakkelijken, de positie van de kooien identiek binnen elke verdeler (dwz de rechter bovenhoek).
   5. Start de opname. Begin elke video met een leistenen dat alle relevante experimentele gegevens identificeert om de juiste identificatie van de video los van bijkomende niet-videodocumentatie garanderen. Gebruik een timer of stopwatch om de duur van de LMA testen (5-10 min.) te volgen. Als timing informatie verloren, terug te vorderen van de video-opname.
   6. Voor herhaalde metingen met behulp van de korte termijn LMA-methode, zodat muizen toegang tot voedsel en water tijdens de non-meting intervallen.
   7. Tijdens het testen, houden alle onderzoekers uit het zicht van de muizen om niet te werken als een externe visuele cue.
   8. Bij het ​​testen is voltooid, keren / vervangen nestelen / verrijking materiaal, om het potentieel voor de ontwikkeling van angst-achtig gedrag ⁸ te verminderen.
5. Kortlopende LMA analyse
   1. Sla de video-opnamen van de testsessie op een archiveringsmedia compatibel is met de VTS gebruikt. Voor Ethovision XT 7, een harde schijf schijf (HDD) wordt gebruikt.
   2. Speel de video's in de VTS met de bijbehorende media player, het analyseren van de video's in real-time. In figuur 1, de detectie variabelen waren: 2 cm / sec begint volgen, 1,75 cm / sec stopt tracking.
   3. In eerste instantie kiest het gehele kooi verdieping als de regio van belang (ROI) voor tracking. Voor geavanceerde analyses, zoals de beoordeling van thigmotaxis, maakt u meerdere intra-kooi ROI.
   4. Voor high-throughput onderzoeken, analyseren van alle kooien in de video tegelijkertijd met individuele all-kooi vloer ROI.
   5. Gebruik de VTS berekent de totale afgelegde afstand (cm), bewegingssnelheid (cm / sec) en duur van de beweging (sec). Voor Ethovision XT 7, exporteer de gegevens gegenereerd in Microsoft Excel voor opslag en aanvullende analyse.

2. Langdurige LMA Testing Set Up en procedure

1. Langdurige LMA testen kooiconstructie
   1. Snijd een 5,5 cm diameter gat in het korte-end wallvan een standaard muis kooi. Maak een afdekking van het gat met ¼ in gegalvaniseerd staal gaas. Snijd de maas, creëerde ½ in openingen om de muis toegang tot voedsel toe. Polijsten alle gesneden gaas om scherpe randen te verwijderen.
   2. Met extra maas externe hopper rechtstreeks op de maaswijdte van de 5,5 cm opening af te maken. Sluit de trechter aan de maas gebruikt om het gat te dekken, en sluit de vergadering om de kooi met aluminium klinknagels.
   3. De bouw van een fles water van een standaard 50 ml conische (Corning) en een 1-gat rubberen stop (Fisher) die is over-geboord om voor het inbrengen van no-drip druppelbuis (Sta-Pure Systems). Zet de fles water naar de kooi met klittenband (3M) en steek de druppelbuis door het gaas overdekte opening.
   4. Tijdens een langdurige LMA testen, bedekken kooien met duidelijke ¼ in plexiglas met 11 x ¼ diameter gaten om geschikte ventilatie ondersteunen.
2. Langdurige LMA testkamer
   1. Langdurige LMA testkamer opgezet is identiek aan de korte termijn LMA. Zie paragraaf 1.2 voor de procedure.
3. Langdurige LMA videografie
   1. Midden en plaats een plafond gemonteerde infrarood, beveiliging-stijl, camera direct gekoppeld aan een PC boven de opname gebied in de testkamer. Alleen opnemen van het aantal kooien in een keer, dat resulteert in individuele resolutie kooi binnen het vermogen van de VTS gebruikt (bv. Ethovision XT 7 kan gelijktijdig volgen 8 muizen in real-time).
4. Langdurige LMA testprocedure
   1. Testen op lange termijn LMA tijdens de actieve / donkere fase van het licht cyclus. Zorg ervoor dat de tijd ten opzichte van het licht cyclus is hetzelfde in alle groepen, als LMA volgt een schemerig patroon met meer activiteit tijdens de vroege en latere perioden van de donker-cyclus ^1. Test zowel de experimentele en controle proefpersonen in elke groep opgenomen muizen tot minimalisering van potentiële zorgeneffecten van temporele verschillen in LMA.
   2. Individueel huis en wennen de proefmuizen in het gemodificeerde kooien ten minste 24 uur.
   3. Plaats de kooi verdelers en kooien (met individuele muizen) direct onder de camera. Verwijder alle nesten / verrijking materiaal van de kooien te zorgen voor een vrij uitzicht van de muis. Muis gravende in het nestmateriaal zal interfereren met het vermogen van de VTS om de muis te volgen. Plaats een helder plexiglas deksel op elk van de kooien te nemen.
   4. Bij het opnemen van meerdere kooien tegelijk, moet u de resolutie is compatibel met de gekozen VTS. Om VTS analyse, positie kooien identieke gemak binnen elke verdeler (dwz de rechter bovenhoek).
   5. Langdurig LMA testen algemeen geanalyseerd real-time, en een video-opname wordt meestal niet gemaakt. Een video-opname kan worden vastgelegd met behulp van een tweede camera of via een DVD-recorder die met de primaire camera. Zorg ervoor dat gedetailleerde dossiers van individuele houdenmuis en groep informatie.
   6. Stel de VTS voor real-time analyse. De hele kooi vloer moet de ROI voor het bijhouden omvatten. Opgezet ROI voor alle kooien wordt opgenomen. Gebruik de VTS berekent de totale afgelegde afstand (cm), bewegingssnelheid (cm / sec) en duur van de beweging (sec). In figuur 2, de detectie variabelen waren: 2 cm / sec gaat volgen; 1,75 cm / sec stopt tracking.
   7. Beginnen met het opnemen muis langdurige LMA. Bewaken van de duur van de lange termijn LMA testen via de klok verbonden met de analyserende computer.
   8. Tijdens het testen, houden alle onderzoekers uit het zicht van de muizen om niet te werken als een externe visuele cue.
   9. Bij het ​​testen is voltooid, keren / vervangen nestelen / verrijking materiaal, om het potentieel voor de ontwikkeling van angst-achtig gedrag ⁸ te verminderen.
5. Langdurige LMA analyse
   1. Langdurig LMA analyse gebeurt in real-time zonder het genereren van een video opname. De gegevens te exporteren naar Microsoft Excel voor opslag en analyse, als het gebruiken Ethovision XT 7.
   2. Om een ​​video op te nemen voor de lange termijn LMA genereren, gebruik dan een secundaire camera. Wees er zeker van de tweede camera heeft voldoende opslagcapaciteit voldoende zijn om de mogelijk langdurige opname (s) op te slaan.

Representative Results

Een voorbeeld van de resultaten van herhaalde maatregelen wordt op korte termijn LMA proef getoond in figuur 1. Uit deze figuur blijkt dat na lipopolysaccharide (LPS) administratie, muizen gehuisvest in individueel geventileerde kooien (IVC) herstellen kortlopende bewegingsactiviteit sneller dan muizen gehuisvest in omgevingsomstandigheden kooien (AEC) ^6. Terwijl het eerste verlies van de bewegingsactiviteit is vergelijkbaar tussen LPS geïnjecteerde groepen, het herstel aan basale LMA is sneller in IVC-gehuisvest muizen zo was de snelheid van de beweging (figuur 1b) en de duur van de beweging (figuur 1c). Het gebruik van herhaalde metingen model met deze korte termijn LMA toets kunnen de observatie en vergelijking van herstel tijd tussen verschillende groepen.

Een lange termijn LMA proef voorbeeld wordt getoond in figuur 2. Deze figuur toont de muis motoriek tijdens 12 uur van het dagelijks testen dan 2 aparte maar opeenvolgende dagen. Geen significant verschil rence in afstand verplaatst (figuur 2a), de snelheid van de beweging (Figuur 2b) of de duur van de beweging (figuur 2c) werd gevonden tussen deze 2 dagen (niet gepubliceerde piloot data). Hoewel er een aanzienlijke hoeveelheid van de fout als gevolg van een kleine steekproef, deze resultaten illustreren dat stabiele en reproduceerbare gegevens kunnen worden verkregen in de loop van opeenvolgende dagen, waardoor de kans op langere termijn locomotion studies worden uitgevoerd zonder de noodzaak van geïmplanteerde zenders en biotelemetrie. Hoewel underpowered, de 1 dag 2 dag versus verschil in afstand verplaatst (figuur 2a) wordt door een verschil in de duur van de beweging (figuur 2c) en niet op een snelheidsverschil (figuur 2b).

pg "/>
Figuur 1. LPS-geïnduceerd verlies van bewegingsactiviteit in muizen gehuisvest in omringende milieu kooien (AEC) en individueel geventileerde kooien (IVC). Group gehuisvest muizen (4 per kooi) van beide AEC of IVC woningen werden individueel gehuisvest vóór de start van de korte termijn LMA testing. Muizen werden geïnjecteerd met LPS (100 ug / kg) en (a) afgelegde afstand (cm), (b) bewegingssnelheid (cm / sec) en (c) de duur van de beweging (s) werden geëvalueerd met gebruik van de tijd. Resultaten worden uitgedrukt als percentage basislijn (pre-LPS) LMA, gemiddelden ± sem, n = 6. Afstand verplaatst belangrijkste effecten: tijd (F (3,77) = 13.08, p <0.01), woonvorm (F (1,77) = 3,69, p = 0,06); tijd x behuizing soort interactie (F (3,77) = 3,31, p = 0,02). Snelheid van beweging belangrijkste effecten: tijd (F (3,77) = 13.08, p <0,01); woonvorm (F (1,77) = 3,69, p = 0,06); tijd x hous ing soort interactie (F (3,77) = 3,31, p = 0,0243). Duur van de beweging belangrijkste effecten: tijd (F (3,77) = 12.92, p <0,01); woonvorm (F (1,77) = 0,69, p = 0,41); tijd x behuizing soort interactie (F (3,77 ) = 3,26, p = 0,03). Bars binnen afzonderlijke tijdstippen zonder gemeenschappelijke superscript letters zijn significant verschillend (P <0,05). # Overgenomen uit: Brain Behav. en Immun., 26 (6), York, JM, et al.., individueel geventileerde kooien veroorzaken chronische laaggradige hypoxie invloed muizen hematologisch en gedragsmatig, 951-958, Copyright 2012, met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Figuur 2. Muis langdurige LMA. Group gehuisvest muizen (4 per kooi) werden afzonderlijk gehuisvest voorafgaand aan langdurige LMA testen. Muizen LMA werd geanalyseerd in real time gedurende 12 uur (dag 1) en op dezelfde muizen 1 dag later (dag 2). De resultaten worden uitgedrukt als (a) totale afgelegde afstand (cm x 1.000), (b) bewegingssnelheid (cm / sec) en (c) de duur van de beweging (sec x 1.000) gemiddelde ± sem, n = 4 (geen significant verschil tussen 0 en 24 uur) (ongepubliceerde pilootdata).

Discussion

Symptomen van ziekte bij muizen zijn oa lusteloosheid, verlies van interesse in sociale en ecologische omgeving, malaise en anorexia ^2-3. In muizen en andere knaagdieren, LMA kan worden gebruikt om ziekte na immuunactivatie ^4-5 evalueren. Bovendien, op lange termijn LMA biedt de mogelijkheid om beweging te volgen over een 24-uurs (of hoger) periode, waardoor de analyse van de behandeling-geïnduceerde veranderingen in circadiane gedrag of verstoringen in de slaap / waak patronen. LMA biedt verschillende voordelen boven andere toetsen voor ziekte aangezien het niet-invasief, gemakkelijk uitgevoerd als een continue of herhaalde meting modaliteit en minimaal verstorende. Vergeleken met andere werkwijzen en systemen (bv. Phenotyper, Intellecage, fotocel systemen), LMA analyse VTS relatief goedkoop omdat meerdere kooien worden opgenomen / simultaan geanalyseerd. Hoewel hier niet benut, kan aanvullende analyse van de LMA activiteiten zoals opvoeding en muurklimmen worden bereikt door gebruik te maken vaneen aan de zijkant gemonteerde camera. Met VTS, LMA is high-throughput aanpasbaar. VTS staat ook voor een grondiger onderzoek van beweging, waaronder het bepalen van tijd, afstand, snelheid en het pad ^5. Path tracking is bijzonder krachtig omdat grondslag angst gedrag.

Ondanks de vele voordelen, een potentiële valkuil inherent aan LMA met VTS is de isolatie / behuizing van muizen tot (en mogelijk meer dan) 24 uur. Sociaal isolement kan een stress-respons en agressie bij langdurige ¹¹ induceren. Onderzoekers moeten zich bewust zijn van deze beperking en neemt maatregelen om de correcte experimentele controle en interpretatie van de resultaten te garanderen.

Tijdens alle gedrags testen, waaronder muis LMA, veel aandacht aan pre-experimentele overwegingen is essentieel voor het bereiken van consistente resultaten. Acclimatisatie aan de testkamer en testen kooi omgevingen is essentieel. Afwijkende geluid, licht en geluid zijn vooral interferentiesring als ze kunnen een schrikreactie en / of angst gedrag ^7-8 provoceren. Idealiter LMA testen moeten optreden bij een temperatuur en vochtigheid gecontroleerde omgeving vrij van schadelijke geuren (vooral natuurlijke predator geuren). Een vaste behavioral tests programmapakket waarmee voor huisvesting van dieren voor langere tijd (dagen) is wenselijk. Het vermogen om muizen terug naar de dierlijke zorg faciliteit voordelig aangezien herhaalde testen is erg nuttig in de studie van veroudering of chronische ziekten.

Ten slotte moet LMA testen worden uitgevoerd in combinatie met vrijwel alle andere gedragstesten omdat bijna al deze testen vereisen muisbeweging. Verstoorde LMA gevolgen tests voor cognitie (Barnes doolhof, Y doolhof, T doolhof, nieuw object herkenning), angst-achtig gedrag (Zero doolhof, open veld), plezier-seeking (wiel draait), depressieve-achtig gedrag (sacharose / saccharine preferente ) en ziekte (sociale terugtrekking en gravende) ^8-9. Door het testen van korte-en long termijn LMA, kan fenotypische verschillen ¹⁰ tussen muis sub-stammen, genotypes en ziekte / interventiemodellen snel worden geëvalueerd, terwijl geen significante invloed op latere gedragstesten. Bovendien, indien er aanzienlijke verschillen verkeer worden vastgesteld passende maatregelen kunnen worden genomen vóór de inwerkingtreding van ingewikkelder gedragstesten die beperkt zijn door de inherente verwart ze veroorzaken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.