Maus Kurz-und Langzeit-Bewegungsaktivität von Video-Tracking-Software analysiert

Summary

Laufaktivität (LMA) ist eine einfache und leicht durchgeführt Messung des Verhaltens bei Mäusen. Kopplung von Video-Tracking-Software (VTS) und LMA ermöglicht die Verbesserung der Spezifität und Sensitivität, vor allem, wenn mit dem Handbuch, Linie überqueren Methode der LMA Analyse verglichen. Zusätzlich VTS ermöglicht langfristige Verfolgung von Maus LMA.

Abstract

Laufaktivität (LMA) ist eine einfache und leicht durchgeführt Messung des Verhaltens bei Mäusen und anderen Nagetieren. Verbesserungen in der Video-Tracking-Software (VTS) haben es erlaubt zu LMA Tests gekoppelt werden, dramatisch verbessert Spezifität und Sensitivität bei der Linienüberquerungen Verfahren mit manueller Scoring verglichen. Darüber hinaus ermöglicht VTS Hochdurchsatz-Experimente. Während ähnliche automatisierte Video-Tracking für den offenen Feldtest (OFT) verwendet werden, ist LMA Tests einzigartig, da es ermöglicht Mäusen, in ihrer Heimat zu bleiben und Käfig nutzt nicht das anxiogenen Reiz der hellen Beleuchtung während der aktiven Phase des Hell-Dunkel- Zyklus. Traditionell wurde LMA für kurze Zeit (Minuten) verwendet worden, während längere Bewegung Studien (Stunden-Tage) häufig verwendet haben Sender und biotelemetry implantiert. Durch die Möglichkeit der Echtzeit-Tracking-, Fern-, wie kurzfristige LMA Prüfung können jetzt unter Verwendung Videografie werden. Langfristige LMA Tests erfordert eine spezialisierte, Aber leicht konstruiert, Käfig, so dass Nahrung und Wasser (die in der Regel auf dem Käfig oben positioniert) nicht behindert Videografie. Wichtig ist, ermöglicht Videografie und VTS für die Quantifizierung von Parametern wie Weg der Bewegung der Maus, die schwierig oder unmöglich, mit Linie Kreuzung und / oder biotelemetry messen sind. In der Summe ergibt LMA Tests gekoppelt VTS eine vollständigere Beschreibung der Mausbewegung und die Fähigkeit zur Fortbewegung über einen längeren Zeitraum zu untersuchen.

Protocol

1. Kurzfristige LMA Set Up und Vorgehensweise

1. Kurzfristige LMA Käfig einrichten
   1. Testen kurzfristigen LMA im eigenen Käfig eines einzeln untergebracht Maus. Um VTS-abhängige Bildanalyse zu erleichtern, verwenden Betten in hohem Kontrast mit Maus Farbe (dh dunkle Bettwäsche für weiße Mäuse und helle Bettwäsche für schwarze Mäuse).
   2. Während kurzfristige LMA Tests decken Käfige mit klaren ¼ in Plexiglas mit 11 x ¼ Durchmesser Löcher, geeignete Belüftung zu unterstützen.
2. Kurzfristige LMA Testraum
   1. Testen Mäuse in einer sauberen Umgebung, in der sie wurden für mindestens 24 Stunden ⁸ eingewöhnt.
   2. Um die Testumgebung beleuchten, verwenden Grübler Klemme Leuchten mit roten Zwiebeln (<125 Lumen). Vor Videografie, den Winkel und die Position der Lichter, um die Blendung oder Reflexionen von den Plexiglas Käfigdach entfernen.
   3. Entfernen oder zu vermeiden Raumgeräuscheüber 70 dB. Verwenden Sie ein weißes Rauschen-Generator, wenn intermittierende Hintergrundrauschen ist unvermeidlich beim Maus-Tests.
   4. Bedecken Sie den Test Oberfläche, auf der die Käfige in den Testraum mit Metzger oder Labortisch Papier von ähnlicher Farbe an den Käfig Bettwäsche gestellt werden, im Falle der Käfig Boden während Videografie ausgesetzt.
3. Kurzfristige LMA Videografie
   1. Mitte und legen Sie eine Decke montierten Nachtsicht-fähige Videokamera mit mindestens 120 GB Speicher über dem Aufnahmebereich in den Testraum. Überschreiten Sie nicht das Auflösungsvermögen der VTS, indem zu viele Käfige innerhalb der Videokamera Blick Rahmen (zB Ethovision XT 7 von Noldus Information Technology (Leesburg VA) gleichzeitig verfolgen 8 Mäusen in Echtzeit) verwendet.
4. Kurzfristige LMA Testverfahren
   1. Testen kurzfristigen LMA während der aktiven / dunkle Phase des Licht-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass die Zeit relativ zu dem Licht-Zyklus ist the gleiche für alle Gruppen, wie LMA eine crepuscular Muster, mit mehr Aktivität folgt während der frühen und späteren Perioden der Dunkel-Zyklus ^1. Umfassen sowohl experimentelle und Kontrollpersonen in jeder Gruppe von Mäusen aufgenommen, um mögliche Auswirkungen der zeitlichen Unterschiede in LMA gewährleisten werden minimiert.
   2. Individuell Haus und akklimatisieren Mäuse mindestens 24 Stunden vor Beginn des Tests LMA ^8.
   3. Legen Sie die Käfig Teiler und Käfige (die einzelnen Mäuse) direkt unter die Kamera. Entfernen Sie alle Verschachtelung / Bereicherung Material aus den Käfigen, da dies die Ansicht der Maus (zB wenn die Maus Höhlen / deckt sich mit Nistmaterial) behindern kann und stören VTS Genauigkeit. Legen Sie ein klares Plexiglas Deckel auf jedem Käfig aufgezeichnet.
   4. Wenn videoing mehrere Käfige gleichzeitig sicher sein, dass die Auflösung mit den gewählten VTS ist. Um VTS Analyse zu erleichtern, positionieren die Käfige identisch in jeder Teiler (dh der oberen rechten Ecke).
   5. Starten Sie die Aufnahme. Beginnen Sie jedes Video mit einem Schieferdach, das alle relevanten Informationen identifiziert experimentelle um eine ordnungsgemäße Identifizierung des Videos unabhängig von jeder zusätzlichen Nicht-Video-Dokumentation zu gewährleisten. Verwenden Sie einen Timer oder die Stoppuhr für die Dauer des Tests LMA (5-10 min) zu verfolgen. Wenn Timing-Informationen verloren, erholen sie aus der Videoaufzeichnung.
   6. Für wiederholte Messungen mit der kurzfristigen LMA Verfahren erlauben Mäusen zu Nahrung und Wasser in den nicht-Messintervalle zugreifen.
   7. Während des Tests, halten alle Experimentatoren aus den Augen der Mäuse um nicht als externe visuelle Cue handeln.
   8. Wenn der Test beendet ist, kehren / ersetzen Verschachtelung / Bereicherung Material, um das Potenzial für die Entwicklung von Angst-ähnliches Verhalten ⁸ zu reduzieren.
5. Kurzfristige LMA Analyse
   1. Bewahren Sie die Video-Aufnahmen aus der Test-Session zu einem Archiv Medien kompatibel mit den VTS verwendet. Für Ethovision XT 7, einen Computer auf die Festplatte (HDD) wird verwendet,.
   2. Replay die Videos in den VTS mit den angeschlossenen Media-Player, die Analyse der Videos in Echtzeit. In Abbildung 1 sind die Erkennung Variablen: 2 cm / sec beginnt Tracking; 1,75 cm / sec stoppt Tracking-Systems.
   3. Zunächst wählen Sie den gesamten Käfig Etage wie die Region of Interest (ROI) für die Verfolgung. Für fortgeschrittene Analysen, wie Prüfung der Thigmotaxis, erstellen Sie mehrere intra-Käfig ROIs.
   4. Für Hochdurchsatz-Studien analysieren alle Käfige im Video gleichzeitig mit individuellen Rundum-Käfigboden ROIs.
   5. Mit den VTS zur Berechnung der gesamten Strecke bewegt (cm), Geschwindigkeit der Bewegung (cm / sec) und die Dauer der Bewegung (s). Für Ethovision XT 7, exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel für die Lagerung und zusätzliche Analyse generiert.

2. Langfristige LMA Testing Aufstellung und Vorgehensweise

1. Langfristige LMA Tests Käfigkonstruktion
   1. Schneiden Sie ein 5,5 cm Durchmesser Loch in der kurz-Stirnwandeiner Standard-Maus Käfig. Erstellen Sie eine Abdeckung für das Loch mit ¼ aus verzinktem Stahlgitter. Schneiden Sie das Netz, wodurch mehrere ½ in Öffnungen Maus Zugang zu Lebensmitteln zu ermöglichen. Burnish jede Masche Schnitt um scharfe Kanten zu entfernen.
   2. Verwenden Sie zusätzliche Masche, um eine externe Trichter direkt auf das Netz verwendet, um die 5,5 cm Öffnung abzudecken verbunden erstellen. Verbinden Sie den Trichter auf das Netz verwendet werden, um das Loch abzudecken, und befestigen Sie die Assembly in den Käfig mit Alu-Nieten.
   3. Konstruieren Sie eine Flasche Wasser aus einem Standard 50 ml konisch (Corning) und einem 1-Loch Gummistopfen (Fisher), die über-gebohrt, um zum Einsetzen von nicht-Tropf-Online-Saugrohr (Sta-Pure Systems) ermöglichen. Befestigen Sie die Wasserflasche an den Käfig mit Klettband (3M) und legen Sie die Online-Saugrohr durch die Maschen fallen Öffnung.
   4. Während langfristige LMA Tests decken Käfige mit klaren ¼ in Plexiglas mit 11 x ¼ Durchmesser Löcher, geeignete Belüftung zu unterstützen.
2. Langfristige LMA Testraum
   1. Langfristige LMA Testraum eingerichtet ist identisch mit kurzfristigen LMA. Siehe Abschnitt 1.2 für das Verfahren.
3. Langfristige LMA Videografie
   1. Mitte und legen Sie eine Decke angebrachte Infrarot-, Sicherheits-Stil, Kamera direkt an einen PC über den Aufnahmebereich in den Testraum verknüpft. Nur notieren Sie die Anzahl der Käfige auf einmal, dass die Ergebnisse in den einzelnen Käfig Auflösung innerhalb der Leistungsfähigkeit der VTS (zB Ethovision XT 7 gleichzeitig verfolgen 8 Mäusen in Echtzeit).
4. Langfristige LMA Testverfahren
   1. Testen langfristige LMA während der aktiven / dunkle Phase des Licht-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass die Zeit relativ zu dem Licht-Zyklus ist die gleiche für alle Gruppen, wie LMA folgt eine crepuscular Muster mit mehr Aktivität in den frühen und späteren Perioden der Dunkel-Zyklus ^1. Testen Sie beide Versuchs-und Kontrollgruppe in jeder Gruppe von Mäusen aufgenommen Minimierung möglicher gewährleistenAuswirkungen der zeitlichen Unterschiede in LMA.
   2. Individuell Haus und akklimatisieren die Test-Mäuse in den modifizierten Käfigen für mindestens 24 Stunden.
   3. Legen Sie die Käfig Teiler und Käfige (die einzelnen Mäuse) direkt unter die Kamera. Entfernen Sie alle Verschachtelung / Bereicherung Material aus den Käfigen, um eine ungehinderte Sicht der Maus gewährleisten. Maus Wühlen in den Nistmaterial wird mit der Fähigkeit der VTS, um die Maus zu verfolgen stören. Legen Sie ein klares Plexiglas Deckel auf jedem der Käfige zu erfassen.
   4. Bei der Aufnahme mehrere Käfige auf einmal sicher, dass die Auflösung ist kompatibel mit den gewählten VTS. Um VTS Analyse Stellung Käfige identisch Leichtigkeit in jedem Teiler (dh der oberen rechten Ecke).
   5. Langfristige LMA Prüfung wird in der Regel in Echtzeit analysiert und eine Videoaufzeichnung ist in der Regel nicht erstellt. Ein Video-Aufzeichnung kann durch Verwendung eines sekundären Kamera oder über ein DVD-Recorder in Verbindung mit der primären Kamera aufgezeichnet werden. Achten Sie darauf, detaillierte Aufzeichnungen einzelner haltenMaus und Gruppen-Informationen.
   6. Richten Sie die VTS für die Echtzeit-Analyse. Der gesamte Käfig Boden sollte umfassen die ROI für das Tracking. Richten Sie ROIs für alle Käfige aufgezeichnet. Mit den VTS zur Berechnung der gesamten Strecke bewegt (cm), Geschwindigkeit der Bewegung (cm / sec) und die Dauer der Bewegung (s). In Fig. 2 wurden die Erkennung Variablen: 2 cm / sec beginnt Tracking; 1,75 cm / sec hält Tracking.
   7. Starten Sie die Aufnahme mit der Maus langfristige LMA. Überwachen Sie die Dauer der langfristigen LMA Tests über die Uhr mit der Analyse von Computer verbunden.
   8. Während des Tests, halten alle Experimentatoren aus den Augen der Mäuse um nicht als externe visuelle Cue handeln.
   9. Wenn der Test beendet ist, kehren / ersetzen Verschachtelung / Bereicherung Material, um das Potenzial für die Entwicklung von Angst-ähnliches Verhalten ⁸ zu reduzieren.
5. Langfristige LMA Analyse
   1. Langfristige LMA Analyse erfolgt in Echtzeit ohne die Erzeugung einer Videoaufzeichnung. Exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel zur Speicherung und Analyse bei Verwendung Ethovision XT 7.
   2. Um ein Video Rekord für langfristige LMA generieren, verwenden Sie eine zweite Kamera. Seien Sie sicher, dass die zweite Kamera verfügt über ausreichend Speicherkapazität ausreicht, um die möglicherweise langwierigen Aufnahme (n) zu speichern.

Representative Results

Ein Beispiel der Ergebnisse aus einer wiederholten Maßnahmen wird kurzfristig LMA-Test in Abbildung 1 dargestellt. Diese Zahl zeigt, dass nach Lipopolysaccharid (LPS) Verwaltung, Mäuse einzeln in belüfteten Käfighaltung (IVC) erholen kurzfristigen Bewegungsaktivität untergebracht schneller als Mäuse in umgebenden Umwelt Käfighaltung (AEC) ⁶ untergebracht. Während die anfängliche Verlust der motorischen Aktivität ist ähnlich zwischen LPS injiziert Gruppen, ist die Erholung basalen LMA schneller in IVC-Mäuse untergebracht war wie Geschwindigkeit der Bewegung (Abbildung 1b) und die Dauer der Bewegung (Abbildung 1c). Die Verwendung eines wiederholten Messungen Modell mit dieser kurzfristigen LMA Test ermöglicht die Beobachtung und Vergleich der Erholung im Laufe der Zeit zwischen den verschiedenen Gruppen.

Eine langfristige LMA-Test Beispiel ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Zahl zeigt, Maus Fortbewegung während 12 Stunden der täglichen Tests über 2 separate, aber aufeinander folgenden Tagen. Kein signifikanter unterschied renz in Strecke bewegt (Abbildung 2a), Geschwindigkeit der Bewegung (Abbildung 2b) oder die Dauer der Bewegung (Abbildung 2c) wurde zwischen diesen 2 Tage (unveröffentlicht Pilotdaten) gefunden. Zwar gibt es eine erhebliche Menge eines Fehlers aufgrund einer kleinen Stichprobe zeigen diese Ergebnisse, dass konsistente und reproduzierbare Daten im Laufe der aufeinander folgenden Tagen erzeugt werden kann, so dass das Potenzial für eine längerfristige Untersuchungen zur Fortbewegung ohne die Notwendigkeit durchgeführt werden implantiert Sender und biotelemetry. Obwohl schwach, zog die 1 Tag 2 Tage gegenüber Differenz im Abstand (Abbildung 2a) erscheint aufgrund einer Ungleichheit in der Dauer der Bewegung (Abbildung 2c) und nicht auf einen Unterschied in der Geschwindigkeit (Abbildung 2b).

pg "/>
Abbildung 1. LPS-induzierter Verlust der motorischen Aktivität bei Mäusen in umgebenden Umwelt Käfighaltung (AEC) untergebracht und einzeln belüftet Käfighaltung (IVC). Gruppe untergebracht Mäuse (4 pro Käfig) entweder AEC oder IVC Gehäuse wurden einzeln vor Beginn des kurzfristigen LMA untergebracht Tests. Mäuse wurden mit LPS (100 ug / kg) injiziert, und (a) Entfernung bewegt (cm), (b) Geschwindigkeit der Bewegung (cm / sec) und (c) die Dauer der Bewegung (s) wurden zu den angegebenen Zeiten ausgewertet. Ergebnisse werden als Prozent Ausgangswert (vor LPS) LMA ausgedrückt, Mittelwert ± SEM, n = 6 ist. Entfernung bewegt wichtigsten Auswirkungen: Zeit (F (3,77) = 13.08, P <0,01), Gehäuse-Typ (F (1,77) = 3,69, p = 0,06), die Zeit x Gehäuse-Wechselwirkung (F (3,77) = 3,31, p = 0,02). Bewegungsgeschwindigkeit wichtigsten Auswirkungen: Zeit (F (3,77) = 13.08, P <0,01), Gehäuse-Typ (F (1,77) = 3,69, p = 0,06), die Zeit x Gehäuse ing-Wechselwirkung (F (3,77) = 3,31, p = 0,0243). Dauer der Bewegung wichtigsten Auswirkungen: Zeit (F (3,77) = 12.92, P <0,01), Gehäuse-Typ (F (1,77) = 0,69, p = 0,41), die Zeit x Gehäuse-Wechselwirkung (F (3,77 ) = 3,26, P = 0,03). Bars in den einzelnen Zeitpunkten ohne gemeinsamen hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich signifikant (P <0,05). Gehirn Behav: # von Nachdruck. und Immun., 26 (6), York, JM, et al., individuell belüftete Käfige zu chronischen low-grade Hypoxie beeinflussen Mäuse hämatologisch und auf der Verhaltensebene, 951-958, Copyright 2012, mit Genehmigung von Elsevier. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Abbildung 2. Maus langfristige LMA. Gruppe untergebracht Mäuse (4 pro Käfig) wurden einzeln vor dem Beginn der langfristigen LMA Tests untergebracht. Mäuse LMA wurde in Echtzeit für 12 Stunden (Tag 1) analysiert und in den gleichen Mäusen 1 Tag später (Tag 2). Die Ergebnisse werden als (a) Gesamt-Distanz bewegt (cm x 1,000) ausgedrückt (b) Geschwindigkeit der Bewegung (cm / sec) und (c) die Dauer der Bewegung (s x 1.000) Mittelwerte ± sem, n = 4 (kein signifikanter Unterschied zwischen 0 und 24 h) (unveröffentlicht Pilot-Daten).

Discussion

Die Symptome der Krankheit bei Mäusen sind Lethargie, Verlust des Interesses an sozialen und ökologischen Umgebung, Unwohlsein und Appetitlosigkeit ^2-3. Bei Mäusen und anderen Nagetieren, können verwendet werden, um Krankheit LMA nach Aktivierung des Immunsystems ^4-5 zu bewerten. Darüber hinaus bietet langfristige LMA die Fähigkeit, Bewegung über eine 24 Stunden (oder mehr) Zeit zu verfolgen, so dass die Analyse der Behandlung induzierten Veränderungen der circadianen Verhalten oder Störungen im Schlaf / Wach-Muster. LMA bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tests bei Krankheit, da sie nicht-invasiv, leicht als eine Maßnahme wiederholt oder kontinuierliche Modalität durchgeführt und ist minimal Verwechslung ist. Verglichen mit anderen Methoden und Systeme (zB Phenotyper, Intellecage, photobeam Systeme), LMA-Analyse mit VTS ist relativ kostengünstig, weil mehrere Käfige können aufgezeichnet / gleichzeitig analysiert. Obwohl hier nicht genutzt werden, können zusätzliche Analyse der LMA Aktivitäten wie Aufzucht und Klettern durch den Einsatz erreicht werdenein seitlich montierter Kamera. Mit VTS ist LMA Hochdurchsatz anpassungsfähig. VTS ermöglicht auch eine gründlichere Untersuchung der Bewegung einschließlich der Bestimmung der Dauer, Distanz, Geschwindigkeit und Weg ^5. Pfad-Tracking ist besonders leistungsfähig, da sie Angst Verhaltensweisen zugrunde liegt.

Trotz seiner vielen Vorteile, ist ein potenzieller Fallstrick inhärent LMA mit VTS die Isolierung / einzigen Gehäuse von Mäusen bis zu (und möglicherweise mehr als) 24 Stunden. Soziale Isolation kann zu einer Stressreaktion und Aggression, wenn längere ^11. Die Ermittler sollten sich bewusst von dieser Einschränkung und Maßnahmen ergreifen, um die ordnungsgemäße experimentelle Kontrolle und Interpretation der Ergebnisse zu gewährleisten.

Bei allen Verhaltenstests, einschließlich Maus LMA, aufmerksam zu vorexperimentelles Überlegungen ist entscheidend für die Erreichung konsistente Ergebnisse. Gewöhnung an den Testraum und Testkäfig Umgebungen unerlässlich. Aberrant Lärm, Licht und Ton sind vor allem Störungen nichtRing als sie eine Schreckreaktion und / oder Angstverhalten ^7-8 provozieren. Idealerweise sollte LMA Tests in einer kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit Umwelt frei von schädlichen Gerüche (vor allem natürliche Feinde Gerüche) auftreten. Eine feste Verhaltenstests Suite, die für die Unterbringung der Tiere ermöglicht längere Zeit (Tage) ist wünschenswert. Die Fähigkeit, Mäuse, um das Tier Pflegeeinrichtung zurück ist vorteilhaft, da wiederholtes Testen ist sehr nützlich bei der Untersuchung von Alterung oder chronischen Krankheiten.

Schließlich sollte LMA-Tests in Verbindung mit fast allen anderen Verhaltenstests durchgeführt werden, weil fast alle solche Tests Mausbewegung erfordern. Gestörte LMA Auswirkungen Tests für Kognition (Barnes Labyrinth, Irrgarten Y, T Labyrinth, Roman Objekterkennung), Angst-ähnliches Verhalten (Null Labyrinth, Freiland), Genußsucht (Rad-Laufen), depressive-ähnliches Verhalten (Saccharose / Saccharin Vorlieben ) und Krankheit (sozialer Rückzug und Graben) ^8-9. Durch das Testen kurz-und lOng-Begriff LMA können phänotypische Unterschiede zwischen Maus ¹⁰ Sub-Stämme, Genotypen und Krankheit / Intervention Modelle schnell ausgewertet werden, während nicht wesentlich beeinflussen nachfolgenden Verhaltenstests. Außerdem, wenn signifikante Bewegung Unterschiede identifiziert werden geeignete Maßnahmen vor dem Erlass von komplizierter Verhaltenstests, die durch die inhärenten verwechselt sie induzieren begrenzt genommen werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.