Ratón de corto y largo plazo la actividad locomotriz analizados por el software de seguimiento de vídeo

Summary

La actividad locomotora (LMA) es una medición simple y de fácil realización de comportamiento en ratones. Acoplamiento de software de seguimiento de vídeo (VTS) y LMA permite la mejora de la especificidad y la sensibilidad, especialmente cuando se compara con el manual, el método de cruce de línea de análisis LMA. Además VTS permite el seguimiento a largo plazo de ratón LMA.

Abstract

La actividad locomotora (LMA) es una medición simple y de fácil realización de comportamiento en ratones y otros roedores. Las mejoras en el software de seguimiento de vídeo (VTS) han permitido que se acopla a las pruebas de LMA, mejorando notablemente la especificidad y la sensibilidad en comparación con el método de cruces de la línea con puntuación manual. Además, VTS permite la experimentación de alto rendimiento. Aunque es similar a la de seguimiento de vídeo automatizado utilizado para la prueba de campo abierto (OFT), LMA prueba es única, ya que permite que los ratones se mantienen en sus jaulas y no utiliza el estímulo anxiogenic de luz brillante durante la fase activa de la luz-oscuridad ciclo. Tradicionalmente, la MLA se ha utilizado durante períodos cortos de tiempo (minutos), mientras que los estudios de movimiento más largos (HRS-día) a menudo han utilizado implantado transmisores y biotelemetría. Con la opción de seguimiento en tiempo real, de largo, al igual que las pruebas de LMA a corto plazo, puede ahora llevarse a cabo utilizando videografía. LMA pruebas a largo plazo requiere un organismo especializado, Pero de fácil construcción, jaula para que los alimentos y el agua (que se coloca generalmente en la cima de la jaula) no impida videografía. Es importante destacar que, videografía y VTS permite la cuantificación de los parámetros, tales como la trayectoria de movimiento del ratón, que son difíciles o imposible de medir con la línea de cruce y / o biotelemetría. En suma, las pruebas de LMA acoplado a VTS proporciona una descripción más completa de movimiento del ratón y la capacidad de examinar la locomoción durante un período prolongado de tiempo.

Protocol

1. Corto plazo Set Up LMA y del Procedimiento

1. Corto plazo LMA jaula creada
   1. Pruebe LMA a corto plazo dentro de la jaula de un ratón de un solo alojados. Para facilitar el análisis de imágenes VTS-dependiente, use ropa de cama en alto contraste con el color del ratón (es decir, ropa de cama de color oscuro para los ratones blancos y ropa de cama de color claro para ratones negros).
   2. Durante las pruebas de LMA corto plazo, cubrir las jaulas con ¼ claro en Plexiglas con 11 x ¼ de diámetro para apoyar la ventilación adecuada.
2. Corto plazo sala de pruebas LMA
   1. Prueba de ratones en un ambiente limpio en el que se han aclimatado a por lo menos 24 horas ^8.
   2. Para iluminar el entorno de prueba, utilice criadoras luces abrazadera con bombillas de color rojo (<125 lúmenes). Antes del video, ajustar el ángulo y la posición de las luces para eliminar brillos o reflejos de la parte superior de jaula de plexiglás.
   3. Eliminar o evitar el ruido en las habitacionespor encima de 70 dB. Use un generador de ruido blanco si el ruido de fondo intermitente es inevitable durante la prueba del ratón.
   4. Cubrir la superficie de prueba sobre la cual las jaulas se colocan en la sala de pruebas con papel de carnicero o banco de laboratorio de color similar al de la ropa de cama jaula, en caso de que el suelo de la jaula está expuesto durante videografía.
3. Corto plazo LMA videografía
   1. Centro y coloque una noche cámara de vídeo con capacidad de visión desde el techo al menos 120 GB de memoria por encima de la zona de control en la sala de pruebas. No exceda la capacidad de resolución de los VTS usados ​​poniendo demasiadas jaulas dentro del marco de la vista de cámara de vídeo (por ejemplo Ethovision XT 7 por Noldus Tecnología de la Información (Leesburg VA) puede seguir simultáneamente 8 ratones en tiempo real).
4. Procedimiento de ensayo LMA corto plazo
   1. Pruebe LMA a corto plazo durante la fase activa / oscura del ciclo de luz. Asegúrese de que el tiempo en relación con el ciclo de luz es the misma en todos los grupos, como LMA sigue un patrón crepuscular, con más actividad durante los períodos tempranos y tardíos del ciclo de oscuridad ^1. Incluya ambos sujetos experimentales y de control en cada grupo de ratones registrados para garantizar los posibles efectos de las diferencias temporales en la LMA se reducen al mínimo.
   2. Individualmente casa y los ratones se aclimatan al menos 24 horas antes del inicio de las pruebas de LMA ^8.
   3. Coloque los separadores jaulas y jaulas (que contienen ratones individuales) directamente debajo de la cámara. Retire todo el material de nidificación / enriquecimiento de las jaulas, ya que podría obstruir la vista del ratón (por ejemplo, si el ratón madrigueras / se cubre con material de anidación) e interferir con VTS precisión. Coloque una tapa de plexiglás transparente en cada jaula registrado.
   4. Cuando videoing varias jaulas al mismo tiempo, asegúrese de que la resolución es compatible con los VTS seleccionadas. Para facilitar el análisis de VTS, colocar las jaulas de forma idéntica dentro de cada división (es decir, la esquina superior derecha).
   5. Inicie la grabación. Comience cada video con una pizarra que identifica a toda la información experimental pertinente para garantizar la correcta identificación del video independiente de cualquier documentación que no sea de vídeo adicional. Utilice un reloj o cronómetro para seguir duración de LMA pruebas (5-10 min). Si se pierde la información de tiempo, recuperarlo de la grabación de vídeo.
   6. Por medidas repetidas utilizando el método de LMA corto plazo, permiten acceder a los ratones a los alimentos y el agua durante los intervalos sin medida.
   7. Durante las pruebas, los experimentadores mantener fuera de la vista de los ratones para no actuar como señal visual externa.
   8. Una vez finalizada la prueba, vuelta / substituye el material de nidificación / enriquecimiento, para reducir el potencial de desarrollo de la ansiedad-como el comportamiento ^8.
5. Análisis LMA corto plazo
   1. Guarde las grabaciones en vídeo de la sesión de pruebas a un medio de archivo compatibles con el VTS usados. Para Ethovision XT 7, una unidad de disco duro se utiliza (HDD).
   2. Reproducir los videos de los VTS utilizando su reproductor de medios, el análisis de los vídeos en tiempo real. En la Figura 1, las variables de detección fueron: 2 cm / seg se inicia el seguimiento; 1,75 cm / seg seguimiento se detiene.
   3. Inicialmente, elegir todo el suelo de la jaula como la región de interés (ROI) para el seguimiento. Para los análisis avanzados, como la evaluación de thigmotaxis, crear regiones de interés dentro de la jaula múltiple.
   4. Para los estudios de alto rendimiento, analizar todas las jaulas en el vídeo de forma simultánea con ROIs piso todo jaula individual.
   5. Utilice el VTS para calcular la distancia total se trasladó (cm), la velocidad de movimiento (cm / seg) y la duración de movimiento (seg). Para Ethovision XT 7, exportar los datos generados en Microsoft Excel para el almacenamiento y el análisis adicional.

2. Prueba LMA largo plazo configurar y Procedimiento

1. Construcción de jaula pruebas LMA largo plazo
   1. Corte un agujero de 5,5 cm de diámetro en la pared del extremo cortode una caja estándar para ratón. Creación de una cubierta para el agujero con ¼ de malla de acero galvanizado. Cortar la malla, la creación de varios ½ en las aberturas para permitir el acceso a la alimentación del ratón. Bruña cualquier malla corte para eliminar los bordes afilados.
   2. Utilizar malla adicional para crear una tolva externa directamente conectado a la malla utilizada para cubrir la abertura de 5,5 cm. Conecte la tolva a la malla utilizada para cubrir el agujero y fijar el conjunto a la jaula con remaches de aluminio.
   3. Construir una botella de agua a partir de un estándar de 50 ml cónico (Corning) y un tapón de goma 1-agujero (Fisher) que está sobre-perforado para permitir la inserción de anti-goteo tubo para sorber (Sistemas de Sta-Pure). Sujete la botella de agua a la jaula con cinta Velcro (3M) e inserte el tubo para sorber a través de la abertura cubierta de malla.
   4. Durante las pruebas de LMA a largo plazo, cubrir las jaulas con ¼ claro en Plexiglas con 11 x ¼ de diámetro para apoyar la ventilación adecuada.
2. A largo plazo sala de pruebas LMA
   1. A largo plazo sala de pruebas LMA establecido es idéntica a LMA corto plazo. Consulte la sección 1.2 para el procedimiento.
3. A largo plazo LMA videografía
   1. Centro y colocar un plafón de infrarrojos, al estilo de la seguridad, la cámara directamente conectada a una PC por encima de la zona de grabación en la sala de pruebas. Sólo registrar el número de jaulas a la vez que da lugar a la resolución jaula individual dentro de la capacidad de los VTS utilizados (por ejemplo Ethovision XT 7 puede seguir simultáneamente 8 ratones en tiempo real).
4. Procedimiento de ensayo LMA largo plazo
   1. Pruebe LMA a largo plazo durante la fase activa / oscura del ciclo de luz. Asegúrese de que el tiempo en relación con el ciclo de la luz es la misma en todos los grupos, como LMA sigue un patrón crepuscular con más actividad durante los períodos anteriores y posteriores de la oscuridad ciclo ^1. Pruebe ambos sujetos experimentales y de control en cada grupo de ratones registrados para garantizar la minimización del potencialefectos de las diferencias temporales en la LMA.
   2. Individualmente casa y aclimatar los ratones de prueba en las jaulas modificadas durante al menos 24 horas.
   3. Coloque los separadores jaulas y jaulas (que contienen ratones individuales) directamente debajo de la cámara. Retire todo el material / enriquecimiento de anidación de las jaulas para garantizar una obstrucción de vista del ratón. Ratón madriguera en el material de anidación va a interferir con la capacidad de los STM para rastrear el ratón. Coloque una tapa de plexiglás transparente en cada una de las jaulas para ser grabados.
   4. Al grabar varias jaulas a la vez, asegúrese de que la resolución es compatible con los VTS seleccionadas. Para facilitar VTS jaulas análisis, posición idéntica dentro de cada división (es decir, la esquina superior derecha).
   5. LMA pruebas a largo plazo se suele analizar en tiempo real, y un registro de video por lo general no crea. Un registro de vídeo se puede grabar mediante el uso de una cámara secundaria o por medio de un grabador de DVD vinculado a la cámara primaria. Asegúrese de mantener registros detallados de personaratón y la información de grupo.
   6. Configure el STM para el análisis en tiempo real. Todo el piso de la jaula debe abarcar el ROI de seguimiento. Configure ROIs para todas las jaulas a grabar. Utilice el VTS para calcular la distancia total se trasladó (cm), la velocidad de movimiento (cm / seg) y la duración de movimiento (seg). En la Figura 2, las variables de detección fueron: 2 cm / seg se inicia el seguimiento; 1,75 cm / seg seguimiento se detiene.
   7. Comience a registrar ratón LMA largo plazo. Supervisar la duración de la prueba LMA a largo plazo a través del reloj asociado con el equipo el análisis.
   8. Durante la prueba, mantenga todos los experimentadores fuera de la vista de los ratones a fin de no actuar como señal visual externa.
   9. Una vez finalizada la prueba, vuelta / substituye el material de nidificación / enriquecimiento, para reducir el potencial de desarrollo de la ansiedad-como el comportamiento ^8.
5. Análisis LMA largo plazo
   1. Análisis LMA a largo plazo se produce en tiempo real, sin la generación de un registro de vídeo. Exportar los datos a Microsoft Excel para el almacenamiento y el análisis, si se utiliza Ethovision XT 7.
   2. Para generar un registro de video de LMA a largo plazo, el uso de una cámara secundaria. Asegúrese de que la cámara secundaria tiene una amplia capacidad de almacenamiento suficiente para almacenar el potencialmente largo de grabación (s).

Representative Results

Un ejemplo de los resultados de medidas repetidas, prueba de LMA a corto plazo se muestra en la Figura 1. Esta figura muestra que después de la administración de lipopolisacárido (LPS), los ratones alojados en jaulas ventiladas individualmente (IVC) recuperar la actividad locomotora a corto plazo más rápido que los ratones alojados en jaulas entorno ambiental (AEC) ^6. Mientras que la pérdida inicial de la actividad locomotora es similar entre los grupos inyectados con LPS, la recuperación a basal LMA es más rápido en los ratones alojados IVC-como era la velocidad de movimiento (Figura 1b) y la duración de movimiento (Figura 1c). El uso de un modelo de medidas repetidas con esta prueba LMA corto plazo permite la observación y la comparación de la recuperación en el tiempo entre los diferentes grupos.

Un ejemplo de ensayo LMA a largo plazo se muestra en la Figura 2. Esta cifra demuestra la locomoción ratón durante 12 horas todos los días de las pruebas de más de 2 días separados pero consecutivos. No dife significativa rencia en distancia recorrida (Figura 2a), se encontró que la velocidad de movimiento (Figura 2b) o la duración de movimiento (Figura 2c) entre estos 2 días (datos piloto no publicados). Mientras que hay una cantidad significativa de error debido a un pequeño tamaño de la muestra, estos resultados ilustran que los datos consistentes y repetibles pueden ser generados en el transcurso de días consecutivos, lo que permite el potencial para los estudios de locomoción a largo plazo para llevar a cabo sin la necesidad de implantado transmisores y biotelemetría. Aunque poca potencia, la diferencia frente a 1 día 2 días en la distancia recorrida (Figura 2a) aparece debido a la disimilitud en la duración de movimiento (Figura 2c) y no a una diferencia en la velocidad (Figura 2b).

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Figura 1. Pérdida inducida por LPS de la actividad locomotora en ratones alojados en jaulas entorno ambiental (AEC) y la introducción en jaulas ventiladas individualmente (IVC). Grupo ratones alojados (4 por jaula) de cualquiera de AEC o IVC vivienda se alojaron individualmente antes del inicio de la MLA a corto plazo pruebas. Los ratones fueron inyectados con LPS (100 mg / kg) y (a) distancia recorrida (cm), (b) la velocidad de movimiento (cm / seg) y (c) la duración del movimiento (s) se evaluaron en los tiempos indicados. Los resultados se expresan como línea de base por ciento (pre-LPS) LMA, medias ± SEM, n = 6. Distancia trasladó efectos principales: tiempo (F (3,77) = 13.08, P <0,01), el tipo de vivienda (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), el tiempo de interacción x Tipo de vivienda (F (3,77) = 3.31, P = 0.02). Velocidad de circulación principales efectos: el tiempo (F (3,77) = 13.08, P <0,01), el tipo de vivienda (F (1,77) = 3,69, P = 0,06), el tiempo x vivienda ing tipo de interacción (F (3,77) = 3.31, P = 0.0243). Duración de circulación principales efectos: el tiempo (F (3,77) = 12.92, P <0,01), el tipo de vivienda (F (1,77) = 0,69, P = 0,41), el tiempo x la interacción tipo de vivienda (F (3,77 ) = 3,26, P = 0,03). Bares a puntos de tiempo individuales sin letras de superíndice son comunes son significativamente diferentes (P <0,05). # Tomado de: comportamiento del cerebro. y Immun., 26 (6), York, JM, et al., jaulas ventiladas individualmente causar hipoxia de bajo grado afectan ratones crónicas hematológicamente y de comportamiento, 951-958, Copyright 2012, con permiso de Elsevier. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 2. Ratón a largo plazo LMA. Grupo ratones alojados (4 por jaula) se alojaron individualmente antes del inicio de las pruebas de LMA a largo plazo. Ratones LMA se analizó en tiempo real durante 12 horas (día 1), y en los mismos ratones 1 día más tarde (día 2). Los resultados se expresan como (a) distancia total trasladó (cm x 1,000), (b) la velocidad de movimiento (cm / seg) y (c) la duración del movimiento (seg x 1,000) medios ± SEM, n = 4 (sin diferencia significativa entre 0 y 24 hr) (datos piloto no publicados).

Discussion

Los síntomas de la enfermedad en ratones incluyen letargo, pérdida de interés en el entorno social y ambiental, malestar y anorexia ^2-3. En los ratones y otros roedores, LMA se puede utilizar para evaluar la enfermedad después de la activación inmune ^4-5. Además, LMA largo plazo ofrece la posibilidad de seguir el movimiento en un 24 horas (o más) período, permitiendo el análisis de las alteraciones inducidas por el tratamiento en el comportamiento o alteraciones en los patrones de sueño / vigilia circadiano. LMA ofrece varias ventajas sobre otras pruebas para la enfermedad, ya que no es invasiva, lleva a cabo fácilmente como una medida repetida o modalidad continua y es mínimamente confusión. En comparación con otros métodos y sistemas (por ejemplo, Phenotyper, Intellecage, sistemas photobeam), análisis de LMA con VTS es relativamente barato debido a varias jaulas se pueden grabar / analizadas simultáneamente. Aunque no se utiliza aquí, el análisis adicional de las actividades de LMA como la cría y el muro de escalada se puede lograr a través del uso deuna cámara de montaje lateral. Con VTS, LMA es de alto rendimiento adaptable. VTS también permite un examen más a fondo de movimiento incluyendo la determinación de la duración, distancia, velocidad y la ruta ^5. Seguimiento de la trayectoria es especialmente eficaz, puesto que subyace en los comportamientos de ansiedad.

A pesar de sus muchas ventajas, una trampa potencial inherente a la LMA con VTS es el aislamiento / vivienda única de los ratones durante un máximo de (y posiblemente superior) 24 hr. El aislamiento social puede inducir una respuesta de estrés y la agresión cuando prolongada ^11. Los investigadores deben ser conscientes de esta limitación y tomar medidas para asegurar el control experimental e interpretación de resultados.

Durante todas las pruebas de comportamiento, incluyendo ratón LMA, mucha atención a las consideraciones pre-experimentales es fundamental para lograr resultados consistentes. La aclimatación a la sala de pruebas y entornos jaula de prueba es esencial. Ruido aberrante, la luz y el sonido son especialmente interfeanillo, ya que pueden provocar una respuesta de sobresalto y / o el comportamiento de ansiedad ^7-8. Idealmente, LMA prueba debe ocurrir en un ambiente de temperatura y humedad controladas libre de malos olores (olores de depredadores naturales sobre todo). Un conjunto de pruebas de comportamiento fijo que permite para alojamiento de los animales durante largos períodos de tiempo (días) es deseable. La capacidad para volver a los ratones la instalación de cuidado animal es ventajosa ya que las pruebas repetidas es muy útil en el estudio del envejecimiento o enfermedades crónicas.

Por último, las pruebas de LMA se debe realizar en conjunto con casi todas las otras pruebas de comportamiento, ya que casi todas estas pruebas requieren el movimiento del ratón. Perturbado LMA impactos pruebas de cognición (Barnes laberinto, laberinto Y, T laberinto, novela de reconocimiento de objetos), la ansiedad-como comportamiento (Zero laberinto, campo abierto), la búsqueda del placer (rueda para correr), el comportamiento de tipo depresivo (sacarosa / sacarina preferencia ) y enfermedad (aislamiento social y la madriguera) ^8-9. Al poner a prueba a corto y long plazo LMA, las diferencias fenotípicas entre ¹⁰ mouse sub-cepas, genotipos y las enfermedades / modelos de intervención se puede evaluar rápidamente sin influir significativamente las pruebas de comportamiento posteriores. Por otra parte, si se detectan diferencias significativas movimiento las medidas adecuadas se pueden tomar antes de la promulgación de las pruebas de comportamiento más complejos que están limitados por los factores de confusión inherentes que provocan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.