Fare Kısa ve Uzun Vadeli Lokomotor Aktivite video Takip Yazılımı ile Analiz

Summary

Lokomotor aktivite (LMA) farelerde davranış basit ve kolay uygulanabilir bir ölçüsüdür. Video izleme yazılımı (VTS) ve LMA Kaplin LMA analizi manuel, çizgi geçiş yöntemi ile karşılaştırıldığında, özellikle, özgüllük ve duyarlılık geliştirilmesi için izin verir. Ayrıca VTS fare LMA uzun vadeli izleme sağlar.

Abstract

Lokomotor aktivite (LMA) fare ve diğer kemirgenler davranış basit ve kolay uygulanabilir bir ölçüsüdür. Video izleme yazılımı (VTS) gelişmeler bu manuel puanlama ile hat geçişi yöntemi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde özgüllük ve duyarlılığı geliştirmek, LMA test birleştiğinde izin var. Buna ek olarak, VTS yüksek verimli bir deney sağlar. Açık alan testi (OFT) için kullanılan Otomatik film izleme benzer, LMA test benzersiz olmasına rağmen bu bu fareler kendi kafes içinde kalmasını sağlar ve ışık-karanlık aktif aşamasında parlak aydınlatma anksiyojenik uyarıcı kullanmak değildir döngüsü. Artık hareket çalışmaları (saat-gün) sık kullanılan vericileri ve biyotelemetri implante varken Geleneksel olarak, LMA, zaman (dakika) kısa bir süre için kullanılmıştır. Gerçek zamanlı izleme seçeneği ile, uzun, kısa vadeli LMA test gibi, şimdi çekmesi kullanılarak yapılabilir. Uzun vadeli LMA testler, uzman gerektirir, Ancak gıda ve su (ki genellikle kafes üzerine konumlandırılmış) video çekmesi engel olmadığını bu kadar kolay, kafes inşa. Önemlisi, videografisi ve VTS zor veya çizgi geçme ve / veya biyotelemetri ile ölçmek olanaksız olan bu tür fare hareket yolu gibi parametrelerin, miktarının sağlar. Özetle, VTS için birleştiğinde LMA test fare hareketi bir daha eksiksiz bir açıklaması ve uzun bir süre boyunca hareket incelemek yeteneği tanıyor.

Protocol

1. Kısa vadeli LMA Kurma ve Prosedürü

1. Kısa vadeli LMA kafes kurmak
   1. Tek yer fare evde kafes içinde kısa vadeli LMA test edin. VTS bağımlı görüntü analizi kolaylaştırmak için, fare renk (beyaz fareler ve siyah fareler için açık renkli yatak için yani koyu renkli yatak) ile yüksek aksine yatak kullanın.
   2. Kısa vadeli LMA test sırasında, 11 x ¼ çaplı delikler uygun havalandırma destek ile pleksiglas net ¼ ile kafesleri kapsamaktadır.
2. Kısa vadeli LMA test odası
   1. En az 24 saat ⁸ için acclimated edildiği temiz bir ortamda fareler test edin.
   2. Test ortamı aydınlatmak için, kırmızı ampuller (<125 lümen) ile kuluçka makinesi kelepçe ışık kullanın. Videografisi önce, pleksiglas kafes başında gelen parlama veya yansımaları kaldırmak için ışık açısını ve konumunu ayarlayın.
   3. Oda gürültü çıkarmak veya önlemek70 dB üzerinde. Aralıklı arka plan gürültü fare test sırasında kaçınılmaz ise bir beyaz gürültü jeneratör kullanın.
   4. Kafesleri kafes yatak için kasap ya da benzer renk laboratuar tezgah kağıdı ile test odası yerleştirilir bunun üzerine test yüzeyini kaplayan, durumda kafes zemin videografisi sırasında maruz kalmaktadır.
3. Kısa vadeli LMA videografisi
   1. Merkezi ve test odasında kayıt alanı üzerinde bellek en az 120 GB ile bir tavana montajlı gece görüş özellikli video kamera yerleştirin. Video kamera görüntüsü kare (Noldus Bilgi Teknolojisi (Leesburg VA) örneğin Ethovision XT 7 aynı anda gerçek zamanlı olarak 8 fareler izleyebilirsiniz) içinde çok fazla kafes yerleştirilerek kullanılan VTS kararı yeteneği aşmayın.
4. Kısa vadeli LMA test prosedürü
   1. Işık döngüsünün karanlık / aktif faz esnasında kısa süreli LMA test edin. Işık döngüsü göre zaman inci olduğundan emin olunTüm gruplar arasında aynı e, LMA karanlık döngüsü ¹ erken ve daha geç dönem daha fazla aktivite ile bir alaca karanlık desen, aşağıdaki gibi. En aza indirilmiştir LMA içinde geçici farklılıkların olası etkilerini sağlamak için kaydedilen farelerin her grupta hem deney ve kontrol konuları içermektedir.
   2. Bireysel ev ve alışmak fareler en az 24 LMA test ⁸ başlamadan önce saat.
   3. Doğrudan kameraya altında kafes bölücüler ve kafesleri (bireysel fareler içeren) yerleştirin. Bu fare görünümü (fare Burrows / iç içe malzeme ile kendisini kapsıyorsa gibi) tıkayabilir ve VTS doğruluk engel olabilecek, kafesleri tüm yuvalama / zenginleştirme malzemelerini çıkarın. Kaydedilen her kafes net bir pleksiglas kapak yerleştirin.
   4. Aynı anda birden fazla kafes videoyu zaman, çözünürlük seçilen VTS ile uyumlu olduğundan emin olun. VTS analizi kolaylaştırmak için, (yani sağ üst köşesinde) her bölücü içinde aynı kafesleri konumlandırmak.
   5. Kaydı başlat. Herhangi bir ek olmayan-video belgelerin bağımsız videonun düzgün kimlik sağlamak için ilgili tüm deneysel bilgileri tanımlayan bir barut ile her video başlayın. LMA testi (5-10 dk) süresi izlemek için bir zamanlayıcı ya da kronometre kullanın. Zamanlama bilgileri kaybolur, video kayıt onu kurtarmak.
   6. Kısa vadeli LMA yöntemi kullanılarak tekrarlı ölçümler için, fareler olmayan ölçüm aralıkları sırasında yiyecek ve suya erişim sağlar.
   7. Test sırasında, farelerin görüş böylece harici bir görsel işaret olarak hareket için herhangi bir deneyci dışında tutmak.
   8. Test bittiğinde, geri / iç içe / zenginleştirme malzeme yerine, anksiyete gibi davranış ⁸ gelişimi için potansiyelini azaltmak için.
5. Kısa vadeli LMA analizi
   1. Test oturumdan kullanılan VTS ile uyumlu bir arşiv medya için video kayıtları saklayın. Ethovision XT 7, bir sabit disk için (HDD) kullanılır.
   2. Gerçek zamanlı olarak video analiz, ilgili medya oynatıcı kullanarak VTS de videoları tekrar. Şekil 1'de, algılama değişkenler: 2 cm / sn izleme başlar; 1.75 cm / sn durur izleme.
   3. Başlangıçta, izleme için ilgi bölgesi (ROI) gibi tüm kafes zemin seçin. Bu thigmotaxis değerlendirilmesi gibi gelişmiş analizler, için, birden içi kafes ROI oluşturun.
   4. Yüksek verimli çalışmalar için, tek tek her kafes zemin ROI ile eş zamanlı video içindeki tüm kafesleri analiz.
   5. Toplam mesafe, (cm) hareket hızı (cm / sn) ve hareket süresi (sn) taşındı hesaplamak için VTS kullanın. Ethovision XT 7 için, depolama ve ek analiz için Microsoft Excel'e üretilen verileri.

2. Uzun vadeli LMA Test Kurma ve Prosedürü

1. Uzun vadeli LMA test kafes yapı
   1. Kısa uç duvarda bir 5,5 cm çapında delikbir standart fare kafes. Galvanizli çelik hasır ¼ ile delik için bir kaplama oluşturun. Gıda fare erişime izin vermek için açıklıkları çeşitli ½ oluşturma, örgü kes. Keskin kenarları kaldırmak için herhangi bir kesim örgü parlatmak.
   2. Doğrudan 5.5 cm açıklığı kapatmak için kullanılan örgü bağlı harici haznesi oluşturmak için ek örgü kullanın. Delik karşılamak için kullanılan örgü için hazne bağlayın ve alüminyum perçin kullanarak kafesine düzeneğini gövdeye.
   3. Standart bir 50 ml konik (Corning) ve no-damla sipper tüp yerleştirme (Sta-Saf Sistemleri) sağlamak için aşırı delinmiş bir 1-delik lastik tıpa (Fisher) bir su şişesi oluşturun. Velcro bant ile kafes (3M) için su şişesi Güvenli ve örgü kaplı deliğinden sipper tüp yerleştirin.
   4. Uzun vadeli LMA test sırasında, 11 x ¼ çaplı delikler uygun havalandırma destek ile pleksiglas net ¼ ile kafesleri kapsamaktadır.
2. Uzun vadeli LMA test odası
   1. Kurmak uzun vadeli LMA test odası kısa vadeli LMA ile aynıdır. Işlem için bölüm 1.2.
3. Uzun vadeli LMA videografisi
   1. Merkezi ve doğrudan test odasında kayıt alanı üzerinde bir PC'ye bağlı bir tavana monte kızılötesi, güvenlik tarzı, kamera yerleştirin. Sadece (örneğin Ethovision XT 7 aynı anda gerçek zamanlı olarak 8 fareler izleyebilirsiniz) kullanılan VTS kapasitesine içinde tek tek kafes çözünürlükte bir kez bu sonuçlara kafes sayısını kaydedin.
4. Uzun vadeli LMA test prosedürü
   1. Işık döngüsünün karanlık / aktif aşamasında uzun vadeli LMA test edin. LMA karanlık döngüsü ¹ erken ve daha geç dönem daha fazla aktivite ile bir alaca karanlık desen aşağıdaki gibi ışık döngüsü göre zaman, tüm gruplar arasında aynı olduğundan emin olun. Kaydedilen farelerin her grupta hem deney ve kontrol grubu potansiyelinin azaltılması sağlamak için test edinLMA içinde zamansal farklılıkların etkileri.
   2. Bireysel ev ve en az 24 saat için modifiye kafeslerde test fareler gelmesini.
   3. Doğrudan kameraya altında kafes bölücüler ve kafesleri (bireysel fareler içeren) yerleştirin. Fare bakış engelsiz bir sağlamak için kafesleri tüm yuvalama / zenginleştirme malzemelerini çıkarın. Yuvalama malzeme içine burrowing fare fare izlemek için VTS kabiliyeti engel olacak. Kaydedilecek kafesleri her birinde açık bir pleksiglas kapak yerleştirin.
   4. Aynı anda birkaç kafesleri kaydederken, çözünürlük seçilen VTS ile uyumlu olduğundan emin olun. Her bölücü içinde aynı VTS analizi, pozisyon kafesleri kolaylaştırmak için (yani sağ üst köşesinde).
   5. Uzun vadeli LMA test genellikle gerçek zamanlı olarak analiz edilir, ve bir video kaydı genellikle oluşturulmaz. Bir video kaydı ikinci bir kamera kullanarak veya birincil kamera ile bağlantılı bir DVD kaydedici ile kaydedilebilir. Bireyin ayrıntılı kayıtlarını tutmak emin olunFare ve grup bilgileri.
   6. Gerçek zamanlı analiz için VTS ayarlayın. Tüm kafes zemin izleme için ROI kapsamalıdır. Kaydedilen tüm kafesleri için ROI ayarlayın. Toplam mesafe, (cm) hareket hızı (cm / sn) ve hareket süresi (sn) taşındı hesaplamak için VTS kullanın. Şekil 2'de, algılama değişkenler: 2 cm / sn izleme başlar; 1.75 cm / sn durur izleme.
   7. Fare uzun vadeli LMA kayıt başlayın. Analiz bilgisayar ile ilişkili saat ile uzun vadeli LMA test süresini izlemek.
   8. Test sırasında, farelerin görüş böylece harici bir görsel işaret olarak hareket etmek tüm deneyci dışında tutmak.
   9. Test bittiğinde, geri / iç içe / zenginleştirme malzeme yerine, anksiyete gibi davranış ⁸ gelişimi için potansiyelini azaltmak için.
5. Uzun vadeli LMA analizi
   1. Uzun vadeli LMA analizi bir video kaydının nesil olmadan gerçek zamanlı olarak ortaya çıkar. Ethovision XT 7 kullanıyorsanız, depolama ve analiz için Microsoft Excel'e veri verir.
   2. Uzun vadeli LMA için bir video kaydı oluşturmak için, ikinci bir kamera kullanın. Ikinci kamera potansiyel olarak uzun kayıt (lar) depolamak için yeterli geniş depolama kapasitesine sahip olduğundan emin olun.

Representative Results

Tekrarlanan bir önlem elde edilen sonuçların bir örnek, kısa süreli LMA testi Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu rakam lipopolisakkarid (LPS) uygulamasından sonra, fareler daha hızlı ortam çevre kafes (AEC) ⁶ içinde yer farelere göre daha kısa vadeli lokomotor aktivite kurtarmak tek tek havalandırmalı kafes (IVC) içinde yer olduğunu göstermektedir. Lokomotor aktivite ilk kaybı LPS enjekte gruplar arasında benzer olsa da, bazal LMA için kurtarma IVC-ev sahipliği farelerde daha hızlı olduğu gibi hareketin hızı (Şekil 1b) ve hareket (Şekil 1c) süresi oldu. Bu kısa vadeli LMA testi ile bir tekrarlayan ölçümler modelin kullanımı farklı gruplar arasında zaman içinde gözlem ve kurtarma karşılaştırılması sağlar.

Uzun süreli bir LMA Test örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu rakam 2 birbirini izleyen gün boyunca her gün test 12 saat boyunca fare hareket gösteriyor. Önemli bir sorumluluk yönün mesafede rence hareketi (Şekil 2b) veya hareketi (Şekil 2c) süresi hızının bu 2 gün (yayınlanmamış Pilot veri) arasında bulunmuştur (Şekil 2a) taşındı. Küçük bir numune boyutu nedeniyle hata önemli bir miktarda olsa da, bu sonuçlar, daha uzun süreli hareket potansiyeli çalışmaları için implante arasında gerek kalmadan yapılmasına olanak sağlayan, tutarlı ve tekrarlanabilir bir veri ardışık gün boyunca oluşturulabilir olduğunu göstermektedir vericiler ve biyotelemetri. Yeterince güçlü olsa da, mesafe 2 gün fark karşı 1 gün hareketinin süresi (Şekil 2c) ve olmayan hız bir fark (Şekil 2b) bir farklılık nedeniyle görünür (Şekil 2a) taşındı.

pg "/>
Şekil 1. AEC veya IVC konut birinden LPS kaynaklı ortam çevre kafes (AEC) ev sahipliği farelerde lokomotor aktivite kaybı ve ayrı ayrı havalandırmalı kafes (IVC). Grup ev sahipliği fareler (kafes başına 4) ayrı ayrı kısa vadeli LMA başlamadan önce ev sahipliği edildi test. Fareler LPS (100 ug / kg) enjekte edildi ve (a) mesafesi (b) hareketi (cm / sn) ve hareket (ler), (c) süresinin hız belirtilen zamanlarda değerlendirildi, (cm) taşındı. Sonuçlar yüzde başlangıç ​​(ön-LPS) LMA olarak ifade edilmiştir, ± SEM, n = 6 anlamına gelir. Mesafe temel etkisi taşındı: süresi (F (3,77) = 13.08, p <0.01), konut tipi (F (1,77) = 3.69, p = 0.06), zaman x konut tipi etkileşimi (F (3,77) = 3.31, p = 0.02). Hareketin hızı temel etkileri: süresi (F (3,77) = 13.08, p <0.01), konut tipi (F (1,77) = 3.69, p = 0.06), zaman x konut ing tipi etkileşimi (F (3,77) = 3.31, p = 0.0243). Hareket Süresi ana etkiler: süresi (F (3,77) = 12.92, p <0.01), konut tipi (F (1,77) = 0.69, p = 0.41), zaman x konut tipi etkileşimi (F (3,77 ) = 3.26, p = 0.03). Ortak üst simge harfleriyle olmadan bireysel zaman noktalarında içinde Barlar (p <0.05) önemli ölçüde farklıdır. Beyin Behav: # den yeniden basılmıştır. ve İmmun., 26 (6), York, JM, et al., Bireysel havalandırılmış kafesler Elsevier izni ile, hematolojik ve davranışsal kronik düşük dereceli hipoksi etkileyen fare, 951-958, Copyright 2012 neden. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

load/50252/50252fig2.jpg "/>
Şekil 2. Fare uzun vadeli LMA. Grubu ev sahipliği fareler (kafes başına 4) ayrı ayrı uzun vadeli LMA test başlamadan önce yerleştirildiler. Fare LMA 12 saat (1. gün) için gerçek zamanlı olarak analiz edildi ve 1 gün sonra aynı fareler (2 gün) içinde. Sonuçları (a) toplam mesafe, (cm x 1.000) hareket olarak ifade edilmiştir (b) hareket (cm / sn) ve (c) hareketin süresi (sn x 1.000) ortalama ± SEM, n = 4 (anlamlı fark hızı 0 ve 24 saat) arasındaki (yayınlanmamış Pilot verileri).

Discussion

Farelerde hastalık belirtileri uyuşukluk, sosyal ve çevresel ortamda ilgi kaybı, halsizlik ve iştahsızlık ^2-3 içerir. Farenin ve kemirgenlerde, LMA immün aktivasyon ^4-5 sonra hastalık değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, uzun vadeli LMA sirkadiyen davranış veya uyku / uyanıklık desen bozuklukları tedavi bağlı değişiklikler analizi sağlayan 24 saat (veya daha büyük) süre içinde hareketini takip olanağı sunar. Bu non-invaziv, kolayca tekrar ölçü veya sürekli yöntemi olarak gerçekleştirilen ve minimal karıştırıcı olduğunu çünkü LMA hastalık için diğer testler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Çoklu kafesler kaydedilen / aynı anda analiz edilebilir, çünkü diğer yöntem ve sistemleri (örneğin Phenotyper, Intellecage, photobeam sistemleri), VTS ile LMA analizi ile karşılaştırıldığında nispeten ucuzdur. Burada kullanılan olmasa da, yetiştirme ve tırmanma duvarı gibi LMA faaliyetlerin ek analiz kullanımı ile elde edilebiliryan monte kamera. VTS ile, LMA uyarlanabilir yüksek verimli olduğunu. VTS da süresi, mesafe, hız ve yol ⁵ belirlenmesi de dahil olmak üzere hareketin daha kapsamlı bir inceleme için izin verir. Anksiyete davranışları altında yatan bu yana yol izleme özellikle güçlü.

Pek çok avantajlara rağmen, VTS ile LMA için potansiyel bir tuzak doğasında kadar için izolasyon / farelerin tek konut (ve muhtemelen aşan) 24 saat olduğunu. Sosyal izolasyon bir stres yanıtı ve saldırganlık uzun süreli ¹¹ neden olabilir. Araştırmacılar bu sınırlama farkında olmak ve uygun deneysel kontrolü ve sonuç yorumlama sağlamak için önlemler almalıdır.

Tüm davranış testi sırasında, fare LMA, önceden deneysel hususlar yakın ilgi de dahil olmak üzere tutarlı sonuçlar elde etmek önemlidir. Test odası ve test kafes ortamlara iklimlendirme gereklidir. Anormal gürültü, ışık ve ses özellikle müdahaleye olanonlar ^7-8 bir irkilme tepkisi ve / veya anksiyete davranışları kışkırtmak olabilir halka. İdeal olarak, LMA test zararlı kokular (özellikle doğal yırtıcı kokuları) ücretsiz sıcaklık ve nem kontrollü bir ortamda yapılmalıdır. Süresi (gün) uzun süre hayvanların barınma sağlayan sabit bir davranış test paketi tercih edilir. Tekrar test yaşlanma ya da kronik hastalıkların çalışmada çok yararlı olduğu hayvan bakım tesisi için farenin dönebilen avantajlıdır.

Hemen hemen tüm bu testler fare hareketi gerektirir, çünkü Son olarak, LMA test hemen hemen tüm diğer davranış testleri ile bağlantılı olarak yapılmalıdır. Biliş için LMA etkileri testleri (Barnes labirent, Y labirent, T labirent, roman nesne tanıma), davranış (Sıfır labirent, açık alanda), zevk-arayan (Tekerlek çalışan), depresif-benzeri davranışlar (sakaroz / tatlı tercih anksiyete benzeri tedirgin ) ve hastalık (sosyal geri çekilme ve burrowing) ^8-9. Kısa ve ben test ederekönemli ölçüde daha sonraki davranış testleri etkileyen değil iken ong vadeli LMA, fare alt suşları, genotip ve hastalık / müdahale modelleri arasında ¹⁰ fenotipik farklılıklar hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Önemli hareket farklılıklar belirlenmiştir Dahası, uygun önlemleri onlar neden doğal boşa ile sınırlıdır daha karmaşık davranış testleri yürürlüğe girmesi öncesinde alınabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.