High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay
Summary
We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.
Abstract
We presenteren een snelle en goedkope high-throughput screening protocol transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne, een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson te identificeren. 293T cellen transient getransfecteerd met plasmiden uit een array ORF expressiebibliotheek, samen met luciferase reporter plasmiden in een gen-per-well microplate format. Vuurvlieg luciferase activiteit bepaald na 48 uur om de effecten van elke bibliotheek gen op alfa-synucleine transcriptie, genormaliseerd op de expressie van een interne controle construct (een hCMV promoter Renilla luciferase) bepalen. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een tafelmodel robot ingesloten in een bio kast, die aseptisch vloeistofverwerking in 96-well formaat uitvoert. Onze geautomatiseerde transfectie protocol gemakkelijk aanpasbaar voor hoge-doorvoer lentivirale bibliotheek productie of andere functionele screening protocollen ter drievoudige transfecties van grote aantallen unieke bibliotheek plasmiden conjuncties met een gemeenschappelijke set van helper plasmiden. Presenteren we ook een goedkoop en gevalideerd alternatief voor in de handel verkrijgbare, dual luciferase reagentia die PTC124, EDTA, en pyrofosfaat te vuurvliegluciferase activiteit onderdrukken voorafgaand aan de meting van Renilla luciferase telt. Met behulp van deze methoden, gescreend we 7670 menselijke genen en geïdentificeerd 68 regulatoren van alfa-synucleïne. Dit protocol is gemakkelijk aanpasbaar aan andere genen van belang te richten.
Introduction
De mogelijkheid om belangrijke genetische regulerende elementen en de factoren die inwerken op hen te identificeren is fundamenteel voor de exploratie van talrijke biologische processen. Echter, het identificeren van factoren die de expressie van genen reguleren in zeldzame soorten cellen, zoals specifieke neuronale populaties, kan een uitdaging zijn. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van nieuwe transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne (SNCA), een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson en uitgedrukt in dopaminerge neuronen in de substantianigra pars compacta regio van de middenhersenen. We doen dit met behulp van een high-throughput, dual-luciferase, in vitro reporter scherm om alfa-synucleïne expressie deconstrueren in 293T-cellen. De alfa-synucleïne promoter wordt eerst gekloneerd in een reporter plasmide dat het vuurvlieg luciferase gen. Een commercieel verkrijgbaar plasmide dat het Renilla luciferase onder controle van een constitutief actieve promoter fungeert als een interne controle. These reporter constructen worden co-getransfecteerd in 293T-cellen in microtiterplaten met plasmiden uit een DNA-expressie-bibliotheek, zodat elk putje getransfecteerd met een plasmide bibliotheek. Na 48 uur werd luciferaseactiviteit voor elke reporter achtereenvolgens gemeten met een dual-glans assay. De relatieve expressie van alfa-synucleïne voor iedere bibliotheek gen wordt afgeleid door de verhouding van vuurvlieg: Renilla luciferaseactiviteit in elk putje (F: R verhouding) na plaat gebaseerde normalisatie.
Dit protocol geeft de mogelijkheid om een groot aantal genen (~ 2500 per week) screenen op hun vermogen om een reportergen transactiveren met minimale mankracht (1-2 personen) en minimale kosten (ongeveer $ 3 reagens kosten per microtiterplaat test). Transcriptiefactoren van neuronale genen (bijvoorbeeld alfa-synucleïne), die moeilijk te bestuderen in gekweekte neuronen vuurvaste genetische manipulatie kan worden vergeleken side-by-side in deze directe functionele test. We nemen in onzeprotocol een gedetailleerde methode voor het klonen en de groei van plasmiden die de alfa-synucleïne promotor, omdat we vonden dat plasmiden die deze regio zijn instabiel wanneer ze groeien met conventionele procedures (zie Discussie). We gebruiken ook een goedkoop alternatief voor handel verkrijgbare dubbele luciferase reagentia voor high-throughput assays. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere regelelementen van belang richten, of voor een werkwijze die een hoge-doorvoer transiënte transfecties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alpha-synucleïne is betrokken bij de ziekte van Parkinson (PD) als component van Lewy lichamen 4, intracellulaire inclusies beschouwd pathognomonische voor de ziekte. Tal van genoom-brede associatie studies hebben single nucleotide polymorfismen gekoppeld aan alfa-synucleïne met een verhoogd risico voor sporadische PD 5,6,7. Hoewel minder algemeen dan sporadische PD, kan familiale PD ook worden veroorzaakt door mutaties in alfa-synucleine 8, en dubbel en triplicatie van de alfa-synucle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken John Darga van de MGH DNA Core voor de bereiding van de DNA-screening bibliotheek. Christopher Chigas van Perkin Elmer voorzien onschatbare steun voor onze Wallac 1420 lichtmeter. Steven Ciacco en Martin Thomae van Agilent steun verleend voor de Bravo robot. Wij danken Ron Johnson en Steve Titus bij de NIH voor royaal verstrekken van hun dual-gloed luciferasetest protocol.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
