집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사
Summary
우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.
Abstract
우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 – 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.
Introduction
키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 – 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐라 루시퍼 활동 : 각 라이브러리 유전자에 대한 응답으로 알파 synuclein의 상대적 발현 반딧불의 비율로 유추됩니다.
이 프로토콜은 최소한의 인력 (1-2 명) 및 최소 비용 (마이크로 분석 당 약 3달러 시약 비용)를 사용하여 리포터 유전자를 전사 할 수있는 능력에 대한 유전자의 다수 (~ 주당 2,500)를 선별하는 기능을 제공한다. 유전자 조작에 불응 배양 신경 세포에서 공부하기 어려운 신경 세포의 유전자의 전사 규제 (예를 들어, 알파 – 시누 클레인)은,이 직접 기능 분석에서 나란히 비교 될 수있다. 우리는 우리에 포함프로토콜 우리가 통상적 인 방법 (토론 참조) 재배 할 때이 영역을 포함하는 플라스미드가 불안정한 것을 발견 이후 복제 및 α-synuclein의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 성장을위한 자세한 방법. 우리는 또한 높은 처리량 분석을위한 상용 듀얼 루시퍼 라제 시약에 대한 저렴한 대안이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 관심의 다른 규정 요소를, 또는 높은 처리량 과도 형질을 필요로하는 프로세스에 대상으로 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
알파 – 시누 클레인은 루이 기관 4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD 5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein 8 돌연변이에 의해…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 DNA 검사 라이브러리의 준비를 위해 MGH DNA 코어의 존 Darga 감사합니다. 퍼킨 엘머의 크리스토퍼 Chigas 우리 월락 1420 루미 매우 귀중한 지원을 제공했습니다. 스티븐 Ciacco 및 애질런트의 마틴 Thomae은 브라보 로봇에 대한 지원을 제공했다. 우리는 아낌없이 자신의 이중 글로 루시 페라 제 분석 프로토콜을 제공하기위한 NIH에 론 존슨 (Ron Johnson)과 스티브 디도 감사합니다.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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