Summary

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Published: June 01, 2014
doi:

Summary

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

Abstract

Apresenta-se um protocolo rápido e barato de rastreio de alto rendimento para identificar reguladores transcricionais de alfa-sinucleína, um gene associado com a doença de Parkinson. As células 293T são transfectadas transitoriamente com os plasmídeos a partir de uma biblioteca de expressão de ORF formado, em conjunto com os plasmídeos repórter da luciferase, em um formato de um gene-por-microplaca. A actividade da luciferase do pirilampo é ensaiado após 48 horas para determinar os efeitos de cada biblioteca de genes mediante transcrição alfa-sinucleína, normalizadas para a expressão de uma construção de controlo interno (de um promotor de hCMV dirige a luciferase da Renilla). Este protocolo é facilitada por um robô de bancada fechado numa cabine de segurança biológica, que executa a manipulação asséptica líquido em formato de 96 poços. O protocolo de transfecção automatizado é facilmente adaptável para maior rendimento da produção de biblioteca lentiviral ou outros protocolos de rastreio funcionais que requerem triple-transfecções de um grande número de plasmídeos biblioteca original em conjunction com um conjunto comum de plasmídeos auxiliares. Apresentamos também uma alternativa barata e validado para comercialmente disponíveis, dupla reagentes luciferase que emprega PTC124, EDTA, e pirofosfato de suprimir a atividade da luciferase de vaga-lume antes da medição de Renilla luciferase. Usando esses métodos, nós analisamos 7.670 genes humanos e identificou 68 reguladores de alfa-sinucleína. Este protocolo é facilmente modificável para atingir outros genes de interesse.

Introduction

A capacidade de identificar elementos reguladores genéticos chave e os fatores que atuam sobre eles é fundamental para a exploração de numerosos processos biológicos. No entanto, a identificação de fatores que regulam a expressão de genes em tipos de células raras, como populações neuronais específicas, pode ser um desafio. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a identificação de novos reguladores transcricionais de alfa-sinucleína (SNCA), um gene associado com a doença de Parkinson e expresso em neurónios dopaminérgicos na substantianigra região pars compacta do mesencéfalo. Nós conseguimos isso usando uma tela repórter de alto rendimento, dual-luciferase, in vitro para desconstruir expressão alfa-sinucleína em células 293T. O promotor de alfa-sinucleína é primeiro clonado num plasmídeo repórter contendo o gene da luciferase do pirilampo. Um plasmídeo disponível comercialmente contendo a luciferase de Renilla sob o controlo de um promotor constitutivamente activo serve como um controlo interno. Tsconstruções repórter e são co-transfectados para células 293T em microplacas com plasmídeos de uma biblioteca de expressão de ADN, de modo a que cada poço é transfectada com um único plasmídeo biblioteca. Após 48 horas, a atividade de luciferase para cada repórter é medido sequencialmente através de um ensaio duplo-brilho. A expressão relativa de alfa-sinucleína em resposta a cada gene biblioteca é inferida pela relação de pirilampo: a actividade da luciferase de Renilla em cada poço (F: razão R) após normalização com base em placa.

Este protocolo prevê a possibilidade de um número elevado de genes (~ 2.500 por semana) por sua capacidade de transativar um gene repórter utilizando mão de obra mínima (1-2 pessoas) e um custo mínimo (cerca de US $ 3 Custo reagente por ensaio microplaca). Reguladores da transcrição de genes neuronais (por exemplo, alfa-sinucleína), que são difíceis de estudar em neurónios cultivados refractários a manipulação genética, podem ser comparados lado a lado no presente ensaio funcional directa. Nós incluímos em nossoprotocolo de um método detalhado para a clonagem e crescimento de plasmídeos contendo o promotor de alfa-sinucleína, uma vez que descobrimos que os plasmídeos contendo esta região são instáveis ​​quando cultivadas com procedimentos convencionais (ver discussão). Nós também incluímos uma alternativa barata para comercialmente disponíveis reagentes dual-luciferase para ensaios de alto rendimento. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para atacar outros elementos reguladores de interesse, ou para qualquer processo que requer a high-throughput transfecções transientes.

Protocol

Para uma visão geral experimental, ver Figura 1. 1. Prepare plasmídeos repórter contendo a alfa-sinucleína Promotor Os elementos reguladores do gene da alfa-sinucleína (Figura 2) abranger cerca de 10 kb, a montante do PNS (A-beta não componente de peptídeo amilóide) dinucleótido sequência de repetição de 1,2 através de intrão 2 3. Nós incluem uma porção dessa região nossa construção repórt…

Representative Results

Os valores típicos da luciferase, F: rácios R e os valores de indução para um único semi-placa são mostrados na Figura 4 Nota da batida no bem H2, um indutor de 32 vezes.. Genes que causam toxicidade excessiva (por exemplo, bem E3), ou poços que foram mal transfectadas, irá produzir valores baixos, tanto para vaga-lume e luciferases Renilla, mas um valor médio de indução. Os genes que causam indução não específica da actividade da luciferase, talvez através da interacç…

Discussion

Alfa-sinucleína foi implicada na doença de Parkinson (PD), como um componente de corpos de Lewy, 4 inclusões intracelulares considerados patognomónico para a doença. Numerosos estudos de associação do genoma ligaram polimorfismos de nucleotídeo único em alfa-sinucleína com risco aumentado para esporádica PD 5,6,7. Embora menos comum do que a PD esporádica, PD familiar também pode ser causada por mutações em alfa-sinucleína 8, bem como a duplicação e triplicação do loc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a John Darga do MGH DNA do núcleo para a preparação da biblioteca triagem DNA. Christopher Chigas de Perkin Elmer forneceu apoio inestimável para o nosso Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco e Martin Thomae de Agilent forneceu apoio para o robô Bravo. Agradecemos a Ron Johnson e Steve Tito no NIH para generosamente fornecer seu protocolo de ensaio de luciferase dual-brilho.

Materials

Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
Coenzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

References

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Cite This Article
Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

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