De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase
Summary
Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.
Abstract
Apresenta-se um protocolo rápido e barato de rastreio de alto rendimento para identificar reguladores transcricionais de alfa-sinucleína, um gene associado com a doença de Parkinson. As células 293T são transfectadas transitoriamente com os plasmídeos a partir de uma biblioteca de expressão de ORF formado, em conjunto com os plasmídeos repórter da luciferase, em um formato de um gene-por-microplaca. A actividade da luciferase do pirilampo é ensaiado após 48 horas para determinar os efeitos de cada biblioteca de genes mediante transcrição alfa-sinucleína, normalizadas para a expressão de uma construção de controlo interno (de um promotor de hCMV dirige a luciferase da Renilla). Este protocolo é facilitada por um robô de bancada fechado numa cabine de segurança biológica, que executa a manipulação asséptica líquido em formato de 96 poços. O protocolo de transfecção automatizado é facilmente adaptável para maior rendimento da produção de biblioteca lentiviral ou outros protocolos de rastreio funcionais que requerem triple-transfecções de um grande número de plasmídeos biblioteca original em conjunction com um conjunto comum de plasmídeos auxiliares. Apresentamos também uma alternativa barata e validado para comercialmente disponíveis, dupla reagentes luciferase que emprega PTC124, EDTA, e pirofosfato de suprimir a atividade da luciferase de vaga-lume antes da medição de Renilla luciferase. Usando esses métodos, nós analisamos 7.670 genes humanos e identificou 68 reguladores de alfa-sinucleína. Este protocolo é facilmente modificável para atingir outros genes de interesse.
Introduction
A capacidade de identificar elementos reguladores genéticos chave e os fatores que atuam sobre eles é fundamental para a exploração de numerosos processos biológicos. No entanto, a identificação de fatores que regulam a expressão de genes em tipos de células raras, como populações neuronais específicas, pode ser um desafio. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a identificação de novos reguladores transcricionais de alfa-sinucleína (SNCA), um gene associado com a doença de Parkinson e expresso em neurónios dopaminérgicos na substantianigra região pars compacta do mesencéfalo. Nós conseguimos isso usando uma tela repórter de alto rendimento, dual-luciferase, in vitro para desconstruir expressão alfa-sinucleína em células 293T. O promotor de alfa-sinucleína é primeiro clonado num plasmídeo repórter contendo o gene da luciferase do pirilampo. Um plasmídeo disponível comercialmente contendo a luciferase de Renilla sob o controlo de um promotor constitutivamente activo serve como um controlo interno. Tsconstruções repórter e são co-transfectados para células 293T em microplacas com plasmídeos de uma biblioteca de expressão de ADN, de modo a que cada poço é transfectada com um único plasmídeo biblioteca. Após 48 horas, a atividade de luciferase para cada repórter é medido sequencialmente através de um ensaio duplo-brilho. A expressão relativa de alfa-sinucleína em resposta a cada gene biblioteca é inferida pela relação de pirilampo: a actividade da luciferase de Renilla em cada poço (F: razão R) após normalização com base em placa.
Este protocolo prevê a possibilidade de um número elevado de genes (~ 2.500 por semana) por sua capacidade de transativar um gene repórter utilizando mão de obra mínima (1-2 pessoas) e um custo mínimo (cerca de US $ 3 Custo reagente por ensaio microplaca). Reguladores da transcrição de genes neuronais (por exemplo, alfa-sinucleína), que são difíceis de estudar em neurónios cultivados refractários a manipulação genética, podem ser comparados lado a lado no presente ensaio funcional directa. Nós incluímos em nossoprotocolo de um método detalhado para a clonagem e crescimento de plasmídeos contendo o promotor de alfa-sinucleína, uma vez que descobrimos que os plasmídeos contendo esta região são instáveis quando cultivadas com procedimentos convencionais (ver discussão). Nós também incluímos uma alternativa barata para comercialmente disponíveis reagentes dual-luciferase para ensaios de alto rendimento. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para atacar outros elementos reguladores de interesse, ou para qualquer processo que requer a high-throughput transfecções transientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alfa-sinucleína foi implicada na doença de Parkinson (PD), como um componente de corpos de Lewy, 4 inclusões intracelulares considerados patognomónico para a doença. Numerosos estudos de associação do genoma ligaram polimorfismos de nucleotídeo único em alfa-sinucleína com risco aumentado para esporádica PD 5,6,7. Embora menos comum do que a PD esporádica, PD familiar também pode ser causada por mutações em alfa-sinucleína 8, bem como a duplicação e triplicação do loc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a John Darga do MGH DNA do núcleo para a preparação da biblioteca triagem DNA. Christopher Chigas de Perkin Elmer forneceu apoio inestimável para o nosso Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco e Martin Thomae de Agilent forneceu apoio para o robô Bravo. Agradecemos a Ron Johnson e Steve Tito no NIH para generosamente fornecer seu protocolo de ensaio de luciferase dual-brilho.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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