Summary
Vi presenterar en snabb och billig screening metod för att identifiera transkriptionsregulatorer med high-throughput robot transfections och en hemmagjord med dubbla glöd luciferas-analysen. Detta protokoll genererar snabbt direkt sida vid sida funktionella data för tusentals gener och är lätt modifieras för att rikta någon gen av intresse.
Abstract
Vi presenterar en snabb och billig high-throughput screening protokoll för att identifiera transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein, en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom. 293T-celler transfekterades transient med plasmider från en klädd ORF expressionsbibliotek tillsammans med luciferas-reporter-plasmider, i ett en-gen-per-brunnars mikroformat. Firefly luciferas aktivitet analyseras efter 48 timmar för att avgöra effekterna av varje bibliotek gen vid alfa-synuklein transkription, normaliserad till uttryck från en intern kontroll-konstruktion (en hCMV promotor styra Renilla luciferas). Detta protokoll underlättas av en bänk-topp robot inneslutna i en biosäkerhet skåp, som utför aseptisk vätskehantering i 96-brunnsformat. Vårt automatiska transfektion protokoll kan lätt anpassas till hög kapacitet Lentiviral bibliotek produktion eller andra funktionella screeningprotokoll kräver trippel transfektioner av ett stort antal unika biblioteks plasmider i konjugatnktion med en gemensam uppsättning av hjälpar-plasmider. Vi presenterar också ett billigt och validerade alternativ till kommersiellt tillgängliga, dubbla luciferasreagens som sysselsätter PTC124, EDTA, och pyrofosfat för att undertrycka firefly luciferasaktiviteten före mätningen av Renilla-luciferas. Genom att använda dessa metoder, skärmad vi 7670 mänskliga gener och identifierade 68 regulatorer av alfa-synuklein. Detta protokoll är lätt modifieras för att rikta andra gener av intresse.
Introduction
Förmågan att identifiera viktiga genetiska regulatoriska element och de faktorer som verkar på dem är grundläggande för utforskning av många biologiska processer. Men att identifiera faktorer som reglerar uttrycket av gener i sällsynta celltyper, till exempel specifika neuronala populationer, kan vara en utmaning. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera nya transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein (SNCA), en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom och som uttrycks i dopaminerga neuroner i substantianigra pars compacta-regionen i mitthjärnan. Detta åstadkommer vi med hjälp av en hög genomströmning, dual-luciferas, in vitro-reporter skärmen för att dekonstruera alfa-synuklein uttryck i 293T-celler. Den alfa-synuklein-promotorn klonas först in i en reporterplasmid innehållande eldflugeluciferasgenen. En kommersiellt tillgänglig plasmid innehållande Renilla luciferas under kontroll av en konstitutivt aktiv promotor tjänar som en inre kontroll. These reporterkonstruktioner är co-transfekterades in i 293T-celler i mikroplattor med plasmider från en DNA-expressionsbibliotek, till exempel att varje brunn transfekterades med ett enda bibliotek plasmid. Efter 48 timmar, luciferasaktiviteten för varje reporter mäts sekventiellt med hjälp av en dubbel-glöd-analysen. Den relativa expressionen av alfa-synuklein i beroende av varje bibliotek genen härledas genom förhållandet eldfluga: Renilla-luciferas-aktivitet i varje brunn (F: A-förhållandet) efter plattbaserad normalisering.
Detta protokoll ger möjlighet att screena ett stort antal gener (~ 2500 per vecka) för sin förmåga att transaktivera en reporter gen med hjälp av minimal arbetskraft (1-2 personer) och minimal kostnad (cirka 3 reagenskostnaden per mikroanalys). Transkriptionella regulatorer av neuronal gener (t.ex. alfa-synuklein), som är svåra att studera i odlade neuroner eldfasta för genetisk manipulering, kan jämföras sida vid sida i denna direkt funktionell analys. Vi ingår i vårprotokoll en detaljerad metod för kloning och tillväxt av plasmider innehållande alfa-synuklein-promotorn, eftersom vi fann att plasmider som innehåller denna region är instabila när de odlas med konventionella förfaranden (se Diskussion). Vi inkluderar även ett billigt alternativ till kommersiellt tillgängliga dubbla luciferas reagens för high-throughput assays. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att rikta andra reglerande element av intresse, eller till någon process som kräver hög genomströmning transienta transfektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För en experimentell överblick, se figur 1.
1. Förbered Reporter plasmider innehållande alfa-synuklein Promoter
Regulatoriska element av alfa-synuklein-genen (Figur 2) sträcker sig över cirka 10 kb, från den uppströms belägna NACP (non-A-beta-komponenten av amyloidpeptid) dinukleotid-upprepningssekvens 1,2 genom intron 2 3. Vi inkluderar en del av denna region i vår reporter konstruktion. Vi fann att plasmider innehållande intron 2 krävs särskilda förfaranden för tillväxt, som beskrivs nedan. Luciferas-plasmider, pGL4.10 och pGL4.75 (figur 3), är kommersiellt tillgängliga från Promega och kan förökas med användning av konventionella molekylärbiologiska protokoll.
- Amplify de två komponenterna i den alfa-synuklein-promotorn i separata PCR-reaktioner med användning av receptet i Tabell 1 och de primrar som anges i tabell 2.
- Verify PCR-produkter på en agarosgel och ren med användning av Qiaquick PCR Purification kit (Qiagen) och eluerades i 50 ^ il TE (Tris-EDTA). Förvara eluerade 0,9 kb-fragmentet vid -20 ° C för framtida användning.
- Digerera hela volymen av det 3,4 kb PCR-fragment, såväl som 5 | ig av pGL4.10, med SacI och Xhol. Behandla vektorn med alkaliskt kalvtarmfosfätas (Roche) och gel rening med användning av Purelink Snabb Gel Extraction-kit (Invitrogen).
- Ligera fragment och vektor med användning av T4 DNA-ligas (NEB). Rengör den fullbordade reaktionen med användning av Purelink PCR Micro-kit (Invitrogen), och eluerades i 10 | il TE-buffert.
- Omvandla 2 ul av den renade, ligeringsreaktion in i 20 | il av ElectroMAX Stbl4 kompetenta celler (Invitrogen) och elektroporera i enlighet med tillverkarens instruktioner. Skaka i en 30 ° C inkubator vid 225 rpm under 90 min. Sprid två volymer på LB-plattor innehållande 100 mg / ml ampicillin och inkubera vid 30 ° C under 2 dagar.
- Med hjälp av en tandpetare, väljer 4-6 små kolonier för ympning i 2 ml av TB (Terrific Broth). Odla dessa miniprep kulturer i en 30 ° C shaker O / N.
- Man renade plasmid-DNA från 1,5 ml av varje miniprep kultur med hjälp av Purelink HiPure Plasmid Miniprep-kit (Invitrogen).
- Smält det minipreparationer med BamHI och elektrofores på en agarosgel. Den korrekta klonen bör producera fragment av 2,8 kb och 4,9 kb.
- Restreak resterande miniprep kultur från den korrekta klonen på en färsk LB (Luria Broth) platta och växa vid 30 ° C under 2 dagar.
- Välj en liten koloni och ympa en 1,5 ml TB startkultur. Skaka O / N vid 30 ° C. Låt inte startkulturen växa till mättnad.
- Späd hela startkultur i 150 ml av förvärmt TB, och skaka vid 30 ° C under 2 dagar. Innan du går vidare till nästa steg, använd 1,5 ml av denna kultur för en extra miniprep och matsmältning att bekräfta att klonen inte mutera under replicati vidare.
- Rening av plasmid-DNA från den återstående kulturen med hjälp av Purelink HiPure Plasmid Maxiprep-kit (Invitrogen). Förväntad avkastning av denna mellanliggande plasmid är 50-150 mikrogram per 150 ml kultur.
- Tina 0,9 kb fragment frysta i Steg 1.2. Upprepa steg från 1,3 till 1,12 för att klona 0,9 kb fragmentet i den mellanliggande plasmiden, smälta istället med Kpnl och SacI. Ligatet, omvandla, välj, och växa för maxipreps enligt ovan. Digerering med BamHI borde ge fragment av 5,8 kb och 2,8 kb. Detta är den plasmid som kommer att användas för skärmen.
2. Förbered 293T celler, reporterplasmider och bibliotek DNA för screening
293T-celler först ympas i 96-brunnars plattor och transfekterades följande dag. Reporter plasmider och Bibliotek-DNA späddes ut i 96-brunnsplattor. Vi fick plattor av transfektion-grade bibliotek DNA från DNA Kärna vid Massachusetts General Hospital (få = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Detta protokoll transfects ett enda bibliotek plattan i två identiska plattor av 293T-celler (figur 1), bör således två plattor av celler ympas för varje bibliotek platta som skall screenas.
OBS: Väx celler i media utan fenolrött eller antibiotika, eftersom dessa stör de luciferasanalyser och öka toxiciteten under transfektion, respektive.
- För varje bibliotek platta som skall screenas, trypsiniserade resuspendera 293T-celler till en koncentration av 1,5 x 10 5 celler / ml i DMEM innehållande 14% FBS. Häll in i en steril behållare (Axygen).
- Placera behållaren, 2 klarbottnad, 96-hålsplattor (Corning), och en låda med filter pipettspetsar (Agilent) på robotdäcket. Dispensera 100 | il av celler i varje brunn av båda plattorna, till en densitet av 1,5 x 10 4 celler per brunn.
- Centrifugera cellplattorna vid 50 x g under 2 min, med användning av låga ramphastigheter för att säkerställa likacelltäthet under varje brunn. Inkubera vid 37 ° C och 10% CO 2 O / N.
- Späd eldfluga och Renilla reporterplasmider till 5 ng / ul i serumfria medier. Kombinera de spädningar i ett förhållande på 5:03 firefly till Renilla plasmid (i volym) i en 15 ml koniska rör.
- Pipet de kombinerade plasmider in i varje brunn i en 96-brunnars platta, dispensering 17 ul per bibliotek platta, plus 2-10 | il överskott, i varje brunn.
- Erhåll transfektion-grade DNA biblioteksplattorna som ovan och späddes till 13,3 ng / ul med endotoxin-fritt vatten. Minsta volym per brunn bör vara 28 pl.
3. Utför Transfektioner
På dag 2 av skärmen, är reporter plasmider och biblioteks DNA transfekterades i 293T-celler.
- För varje bibliotek platta, blanda 107,5 | il av RT Optifect (Invitrogen) med 4,3 ml serumfritt medium (1:40 utspädning) i ett polystyrenrör. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, och denn dosera 44 pl (per biblioteks platta) i varje brunn på en 96-håls, polystyren V-botten platta (Greiner).
- Placera plattan i utspädd Optifect, reporterplasmider (steg 2,5), biblioteks DNA (steg 2,6), och en låda med pipettspetsar på robotdäcket.
- Sug 17 l av reporter plasmider, 43 pl av utspädd Optifect och 26 l av biblioteks DNA, sätter en 5 pl luftspalt mellan varje aspiration. Biblioteket DNA ska sugas sist för att förhindra korskontaminering. Fördela innehållet i spetsarna in i en ny polystyren V-botten platta, blanda, lock, och ställ åt sidan i 20 minuter för att tillåta lipid / DNA-komplex bildas. Om transfektion flera biblioteksplattor, byta pipettspetsar och biblioteksplatta, och upprepa.
- Avslöja Optifect / DNA-blandningen tallrik och placera den på roboten däck med 2 plattor av 293T celler. Med hjälp av en enda låda med pipettspetsar, aspirera 80 ìl av Optifect: DNA-blandningen och långsamt dosera 40 pl på varje platta av celler. Om transstörande poster flera biblioteksplattor, upprepa för alla Optifect: DNA-plattor. Täck celler.
- Centrifugera cellplattorna vid 1200 x g under 30 min. Täck och återgå till inkubatorn.
- Inkubera cellerna under 4-6 timmar. Under denna inkubation bereda färsk media genom att blanda 12 ml DMEM innehållande 10% FBS och 10 ug / ml ciprofloxacin (Cellgro) för varje transfekterad bibliotek platta. Häll färsk medier i en steril behållare.
- Placera 2 lådor med robot tips, en enda skylt av celler, behållaren innehåller färskt medium, och en reservoar avfall på robotdäcket. Aspirera 100 | il media från cellerna och fördela i avfallsbehållaren delvis fylld med 70% etanol. Med färska tips, aspirera 100 pl av färska medier och långsamt dosera på cellerna. Upprepa för alla plattor av celler.
- Återgå plattorna till inkubatorn under 48 timmar.
4. Utför dubbla luciferasanalyser
På dag 4 av skärmen,firefly och Renilla luciferas analyser utförs.
Obs: dubbla luciferasanalysen kräver sekventiell tillsats av två analys buffertar, 3X eldfluga analysbuffert och 3X Renilla analysbuffert, som beskrivs i tabell 3 Firefly och Renilla luciferaser inte utsöndras, vilket celler skall lyseras före mätning av luciferasaktivitet. . Firefly analysbuffert lyserar celler och ger underlag för eldfluga luciferas, Renilla analysbuffert släcker eldfluga signalen och ger underlag för Renilla luciferas.
- För varje bibliotek platta, förbereda 8 ml 3X eldfluga analysbuffert från stamlösningarna som beskrivs i tabell 3, och dispensera 82 | il i varje brunn i en 96-brunnars V-bottnade platta.
- För varje bibliotek platta, även förbereda 12 ml 3X Renilla-analysbuffert och fördela 122 jil i varje brunn i en 96-brunnars V-bottnade platta. Ställ åt sidan bådeFirefly och Renilla analysbuffertar.
- Placera en låda med pipettspetsar, en reservoar av avfall, och 2 plattor av celler (transfekterade från samma bibliotek platta) på robotdäcket.
- Aspirera 60 | il medium från varje platta och kassera i avfallsreservoaren delvis fylld med 70% etanol. Täckplåtar och ställ åt sidan. Om transfektion flera biblioteksplattor, upprepa för alla olika typer av plåtar.
- Placera 2 lådor med pipettspetsar, plattan i 3X firefly analysbuffert, och en uppsättning av cellplattor på robotdäcket.
- Sug 40 fil 3X firefly analysbuffert och lägg till den första plattan av celler, blanda ordentligt. Att byta till nya pipettspetsar, upprepa för den andra cellen plattan. Placera cellerna vid RT under 10 min för att slutföra lys. Om transfektion flera biblioteksplattor, byta ut lådor med tips och cellplattor, och upprepa.
- Rekord luminiscens från varje brunn i varje cell plattan på en luminometer, inspelning i 1 sek per brunn. Återgå plattorna till robotendäck.
- Placera 2 lådor med pipettspetsar, plattan i 3X Renilla analysbuffert, och en uppsättning av cellplattor på robotdäcket.
- Aspirera 60 pl 3X Renilla analysbuffert, och lägg till den första plattan av celler, blanda ordentligt. Att byta till en ny låda med pipettspetsar, upprepa för den andra cellen plattan. Om transfektion flera biblioteksplattor, upprepa för alla olika typer av cellplattor.
- Rekord luminiscens från alla plattor på en luminometer, inspelning varje brunn i 1 sek enligt ovan. Kassera plattor.
5. Dataanalys
- Beräkna eldfluga: Renilla luminiscens förhållande ("F: R ratio") för varje brunn genom att dela räkningar av firefly signal från grevarna av Renilla signal.
- Beräkna induktionsvärde genom att dividera F: förhållandet R för varje brunn med den genomsnittliga F: N-förhållande av plattan, varvid de högsta och lägsta 25% av brunnarna.
- Medelvärdet induktionsvärden över replikatför en enda transfekterad bibliotek plattan. Gener som inducerar eller förtränga alfa-synuklein mer än tre-veck anses "träffar" på denna skärm och är föremål för ytterligare validering och sekundära skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska luciferas värden, F: R nyckeltal och induktionsvärden för en halv-platta visas i Figur 4 Observera träffen i väl H2, en 32-faldig inducerare.. Gener som orsakar en mycket hög toxicitet (t ex väl E3), eller brunnar som var dåligt transfekterade, kommer att producera låga värdena för både eldfluga och Renilla luciferaser, men en genomsnittlig induktionsvärde. Gener som orsakar icke-specifik induktion av luciferasaktivitet, kanske via interaktion med pGL4 ryggrad, kommer att inducera eldfluga och Renilla luciferaser lika, vilket resulterar i en genomsnittlig induktionsvärde. Stora skillnader i induktionsvärden mellan replikat bör höja misstanke för utförande fel. Det är viktigt att kontrollera att skärmen utföres inom det linjära intervallet för reporteranalyser så att kloner som orsakar ökat uttryck kommer att mätas som ökad luciferasaktivitet. Vi transfekterade ökande mängd av var och en reportergen för att validera linjäritetav reporteranalys under våra experimentella betingelser (Figur 5). Det är också viktigt för att utföra de analyser omedelbart efter inkubationssteget för att undvika icke-linjäriteten beror på substratskiktet. Vi observerade signifikant eldflugeluciferas aktivitet upp till 1 h efter tillsats av reagens (Figur 6).
Figur 1. Experimentell översikt. Varje enskild platta av biblioteks DNA kombineras med 2 reporter konstruktioner och användes för transfektion av dubbla plattor av celler. Efter 48 timmar, är aktiviteten hos varje luciferas reporter mäts sekventiellt. Den specifika induktionen av SNCA promotor plasmiden genom varje bibliotek plasmid beräknas genom förhållandet av eldfluga till Renilla-luciferas efter plattbaserad normalization.
Figur 2. Schematisk av 5'-regionen av alfa-synuklein (SNCA), belägen på kromosom 4, som används i eldfluga reporterplasmid. Primer namn motsvarar sekvenser i Tabell 2. Hatch markeringarna indikerar ett approximativt 8 kb segment elimineras från figur , annars i skala. ATG-startkodonet för SNCA är belägen i exon 3.
Figur 3. Luciferasreportergenen plasmider som används i detta screeningsprotokoll. Domstolsverket genomiska regioner klonas in i det multipla kloningsstället av pGL4.10 omedelbart uppströms om luciferas från eldfluga. En plasmid med hCMV-IE1 (humant cytomegalovirus omedelbara tidiga 1) promotor som styr uttryck av Renilla-luciferas användes som en intern kontroll. Båda plasmider är kommersiellt tillgängliga från Promega.
Figur 4. Representativa resultat för hälften av en enda 96-brunnsplatta. A. Raw eldfluga luciferas räknas B. Raw Renilla luciferas räknas C. F:.. R nyckeltal, som beräknas genom att värdet i A med värdet i B. D. Induktions värden för varje brunn, beräknas genom att varje F: R-förhållande med det genomsnittliga F:. förhållandet R för det platta, med undantag för den övre och nedre 25% av brunnarna E. Grafisk representation av induktionsvärden för en enda skylt, med väl H2, en träff, markeras. Hit H2 är en neuronal transkriptionsfaktor som inte tidigare i samband med Domstolsverkets uttryck. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Linjäritet analyser. Celler transfekterade med ökande mängder av firefly och Renilla luciferas plasmider under kontroll av den starka hCMV-IE1 promotor och analyseras med protokollet ovan. (Total mängd DNA transfekterade hölls konstant genom användning av en neutral balanse plasmid). A. Firefly linjäritet analys. Observera att firefly aktivitet förblir linjär genom en rad olika värderingar. B. Renilla linjäritet assay. Notera utplaning av kurvan över 15 ng / brunn.
.. Figur 6 Tidsförlopp för sönderfallssignalen för eldflugeluciferas assay Luciferas-reagens tillsattes till en enda platta transfekterade med en CMV-luciferas konstruera vid tiden 0; seriella mätningar gjordes utan tillsats av ytterligare reagens.
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration |
| BAC 2002-D6 på 5 ng / l | 4 pl | - |
| 5X Phusion GC-buffert | 20 | il | 1X |
| DMSO | 6 | il | 6% |
| dNTP (10 mm) | 2 | il | 200 pM |
| Forward Primer (100 pM) | 1 pl | 10 | iM |
| Reverse Primer (100 pM) | 1 pl | 10 | iM |
| DDH 2 O | 65 | il | - |
| Phusion DNA Polymerase | 1 pl | - |
| Totalt: 100 l |
Tabell 1. PCR set-up för att förstärka alfa-synuklein promotor.
| Namn | Sekvens | Begränsning Site |
| SNCA7 | 5'-gtc ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | Kpnl |
| SNCA8 | 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | SacI |
| SNCA1 | 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | SacI |
| SNCA2 | 5'-taggen CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | Xhol |
.. Tabell 2 Primers för förstärkning av alfa-synuklein promotor Den NACP Upprepa amplikonet ska producera en 0,9 kb-fragment; den andra amplicon längden är 3,4 kb. För primer platser, se Figur 2.
| A: 3X Firefly analysbuffert | ||
| Stamlösningar (förvaras vid -80 ° C) | Volym per 100 ml 3x Firefly analysbuffert | Slutlig koncentration (3X) |
| 500 mM DTT | 3,0 ml | 15 mM |
| 10 mM koenzym A | 6,0 ml | 0,6 mM |
| 100 mM ATP | 0,45 ml | 0,45 mM |
| 80 mg / mlluciferin | 0,525 ml </ Td> | 4,2 mg / ml |
| Triton lysbuffert | 90,025 ml | - |
| B. Triton Lysis Buffer | ||
| Komponent (förvaras vid rumstemperatur) | Volym per 100 ml Triton Lysis Buffer | Slutlig koncentration |
| Tris-HCl-pulver | 1,705 g | 0,1082 M |
| Tris-baspulver | 0,508 g | 0,0419 M |
| 5 M NaCl | 1,50 ml | 75 mM |
| 1 M MgCl2 | 0,30 ml | 3 mM |
| Triton X-100 ren vätska | 0,75 ml | 0,25% |
| Vatten | till 100 ml total volym | - |
| C. 3X Renilla analysbuffert | ||
| Volym per ~ 100 ml 3x Renilla analysbuffert | Slutlig koncentration (3X) | |
| 10 mM PTC124 i DMSO | 0,6 ml | 0,06 mM |
| 2 mM h-CTZ i etanol | 0,5 ml | 0.01 mM |
| Renilla Salter | 100 ml | - |
| D. Renilla Salter | ||
| Komponent (förvaras vid rumstemperatur) | Volym per 100 ml Renilla Salter | Slutlig koncentration |
| 0,5 M Na2EDTA | 9,0 ml | 45 mM |
| Na-pyrofosfat | 1,34 g | 30 mM |
| NaCl | 8,33 g | 1,425 M |
| Vatten till 100 ml total volym | - | |
Tabell 3. Stamlösningar och analysbuffertar för eldfluga och Renilla luciferas analyser. A. 3X eldfluga analys recept buffert. DTT, ditiotreitol. Om inget annat anges, alla komponenter är lösliga i vatten. B. Triton lysbuffert recept C. 3X Renilla analysbuffert recept.. h-CTZ, h-coelenterazine. Gör 2 mM h-CTZ genom att lägga till 10 mg h-CTZ till 12.2 ml 100% EtOH och 120 l av koncentrerad HCl. PTC124 är löslig i DMSO. D. Renilla salter recept. Triton lysbuffert och Renilla salter är stabila under flera veckor vid 4 ° C och rumstemperatur, respektive. 3X eldfluga analysbuffert och 3X Renilla analysbuffert ska blandas inom 3-4 timmar att utföra luciferasanalysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alpha-synuclein har blandats in i Parkinsons sjukdom (PD) som en komponent i Lewy bodies 4, intracellulära inklusioner anses patognomona för sjukdomen. Många genomet hela föreningen studier har kopplat single nucleotide polymorfism i alfa-synuklein med ökad risk för sporadisk PD 5,6,7. Även mindre vanliga än sporadiska PD, kan familjär PD också orsakas av mutationer i alfa-synuklein 8, samt dubbelarbete och tredubbling av alfa-synuklein locus 9,10,11, ett fenomen ses även vid sporadisk PD 12. Sammantaget visar dessa studier förstärker centralityen av alfa-synuklein i patogenesen av PD. Syftet med denna skärm var att identifiera gener som reglerar alfa-synuklein och därför kan spela en roll i patogenesen för Parkinsons sjukdom. Med hjälp av detta protokoll, skärmad vi 7670 mänskliga gener och identifierade 154 preliminära hits (minst 3 gånger inducerare), vilket motsvarar 140unika gener. Dessa träffar var föremål för sekundära analyser med hjälp av nya DNA-preparat för att bestämma träff reproducerbarhet. Träffar i 3-faldigt område återges i 28% av efterföljande luciferasanalyser. Reproducerbarheten ökade till 59%, 69%, och 78% i 4 -, 5 -, och 5-faldiga inducerare, respektive. Träffar med induktioner över 7-faldig återges 100% av tiden. Vi slutligen identifierat 68 nya regulatorer av alfa-synuklein transkription.
Flera rader av bevis tyder på att de 68 träffar vi som erhålls är verkliga regulatorer av alfa-synuklein. Vår lista över identifierade hits inkluderar GATA3, en medlem av GATA familj av transkriptionsfaktorer som tidigare visats reglera SNCA uttryck 3. Scoring en av de få kända Domstolsverket regulatorer ger stort förtroende för tillförlitligheten i vår skärm. Dessutom självständigt gjorde vi som träffar flera medlemmar av samma familj av neuronala transkriptionsfaktorer, vilket tyder på att skärmen är reproducerbar och inte identifiera generslumpmässigt. Viktigast i ytterligare uppföljande analyser, slår förmåga vår topp för att reglera endogen SNCA uttryck i neuronala celler validerades i överuttryck och knockdown analyser. Vi överuttryckt några av de bästa träffar använder BacMamvectors 3 i SY5Y dopaminerga celler och kunde öka endogena Domstolsverket nivåer 2-8 gånger, medan shRNA knockdown av dessa träffar ledde till minskade SNCA mRNA-nivåer. Dessa studier entydigt visar att våra bästa hits är regulatorer av endogena Domstolsverket nivåer och är inte helt enkelt artefakter i dekonstrueras luciferas systemet. Ytterligare uppföljande studier för andra hits kommer att krävas för att fastställa de verkliga falskt positiva och falskt negativa resultat för hela listan med träffar i vår skärm. En fullständig beskrivning av träffar och deras förhållande till Parkinsons sjukdom är under utarbetande 14.
Det är viktigt att beakta begränsningarna i vår screeningmetod. Det bör obvreverser att skärmen inte skulle identifiera någon regulator inte närvarande i screeningen biblioteket. Medan vår screening bibliotek var betydande, som innehåller ungefär en fjärdedel av det mänskliga genomet, det var inte fullständig. Med tanke på enkelheten i vår analys, kunde ytterligare bibliotek screenas med lätthet. Vi ökade antalet gener screenas på ett målinriktat sätt genom att inkludera paraloger av hits, när sådana finns, i våra sekundära analyser. Vi skulle också inte göra mål någon träff som bundet till genomiska regioner utanför de som ingår i vår reporter konstruktion. För att maximera chansen till inklusive korrekt region, innehöll vår reporter de omedelbara flankerande sekvenserna för de multipla transkriptionsstartställena som finns i SNCA promotorn. Det är troligt att ytterligare faktorer binder till regioner långt utanför den omedelbara promotorregionen för att reglera SNCA uttryck. Dessa skulle kunna detekteras genom att utföra skärmar med ytterligare uppströms-och nedströmsregioner, om så önskas, men endast ~ 10 kb i taget skulle kunna vara enssessed på detta sätt på grund av begränsningar för effektiv kloning i plasmidvektorer och stabiliteten i höga kopietal pGL4 vektorer. Alternativt skulle den luciferas-konstruktionen eftermonteras i BAC-DNA innehållande den SNCA lokuset. En nackdel med det senare är att transfektion av BAC även under ideala förhållanden är> 100 gånger mindre effektiv då plasmider 15. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara att "knock-in" luciferas reporter i den endogena Domstolsverket locus, en metod som är betydligt mer arbetskrävande då vår inställning. Vi skulle dessutom inte poäng alla träffar som redan uttrycks vid mättande nivåer så att överuttryck inte resulterar i ökad luciferasaktivitet. Därför valde vi att anställa icke-neuronala 293T celler, de har kanske inte neuronala faktorer som reglerar Domstolsverket, och faktiskt vi göra mål ett antal neuronala transkriptionsfaktorer. En potentiell nackdel med 293T-celler, är dock att vi inte skulle kunna göra mål vilken gen som helst som en hit, om det krävs enTTERLIGARE neuronala faktorer för att fungera korrekt. Således, liksom alla skärmar kan vår studie missar ett antal potentiella Domstolsverket regulatorer. Men i praktiken, de 68 träffar vi fått ökade antalet kända regulatorer av Domstolsverket med mer än 10-faldigt och kommer att kräva år av arbete för att följa upp, så ytterligare träffar kanske inte nödvändigt i vårt fall.
Det är också viktigt att inse den potentiella artefakter som kan inträffa med användning av denna metod. I kemiska skärmar, är luciferas ökänd för artifactually poäng föreningar genom stabilisering av luciferasprotein snarare än genom induktion av transkription. För att utesluta proteinstabiliserings artefakter, vi skärmad våra hits mot flera andra promotor-luciferas konstruktioner och hittade inga träffar som verkade handla posttranskriptionellt genom att upphöja uttryck från konstitutiva promotorer. En annan potentiell artefakt kan vara en transaktiverande faktor som binder till pGL4 vektorryggraden i ställetDomstolsverkets promotorn. Vi använde pGL4 vektor som har omfattande muteras för att avlägsna transkriptionsfaktor bindningsställen för att undvika det här problemet. För att bedöma om någon av våra träffar krävs vektorn ryggraden för induktion, använde vi PCR för att förstärka Domstolsverket-luciferas vektorregionen saknar ryggrad och använde denna linjära fragment som reporter för sekundära analyser. Vi fann ingen signifikant skillnad i induktionsvärden mellan vår kompletta plasmid reporter och den linjära ryggraden fria konstruktion med ett undantag. GATA2 visade ~ 15-faldig induktion med plasmiden reportern, men endast ~ 2,7-faldigt med den linjära reporter, vilket tyder på att en del av GATA2 induktion kan bero på bindning till komponenter stamnät.
Ett antal andra metoder för att identifiera transkriptionsregulatorer har beskrivits. Nästan 30 år sedan, var kartläggningen av cis-verkande transkriptionskontrollelement i starka viruspromotorer via transfekterade reporter genuttryck established 16. Denna metod, som ibland kallas "promotor bashing", har fallit i onåd för kartläggning av cell-typspecifika tagare eftersom det är svårt att få och transfektera lämpliga primära cellinjer, och dessa rader kan inte korrekt representera deras vävnader av ursprung. Jästen en-hybridsystemet 17 kringgår detta problem genom att tillhandahålla en deconstructed reporter system för att upptäcka interaktioner mellan ett bibliotek av fusionsgener och ett specifikt cis-verkande elementet. Vår strategi liknar den jäst en-hybridsystemet i sin deconstructed utformning, men i vårt system som vi använder vanliga uttryck kloner istället genfusioner, vi anställer däggdjursceller snarare än jäst, och vi använder robotteknik som tillåter sida vid sida kvantitativ funktionella avläsning för varje test-genen. En lovande metod benämnd proteomics av isolerade kromatin segment (PICH), som tillåter identifiering av proteiner bundna till specifika genomregioner har beskrivits 18, men har ännu inteframgångsrikt tillämpats på lösnummer mänskliga gener. Genomvid kromatin immunoprecipitation (chip-artiklar och chip-chip) studier har använts för att identifiera cis-verkande regioner i stor skala 19. Denna metod är potentiellt kraftfullt, men liksom Pich, kan vara mindre användbara för celltyper såsom specifika neuronala populationer som inte är lätt framställda i homogen kultur. Dessutom, när vi har kontrollerat CHIP databaser för våra validerade hits, de har inte visat bindning av dessa träffar till Domstolsverkets promotorn. Anledningen till detta är inte klart, eftersom vi har kunnat påvisa bindning av dessa faktorer till Domstolsverket promotorn med konventionell chip 14; men det kan bero på avsaknaden av hela Domstolsverkets promoterregionen anställs chip studier med microarray avläsning (chip-chip). Pich, Chip-artiklar, och andra proteomik metoder kan därför vara mest användbart när kopplad till de direkta funktionella avläsning att vår metod genererar.
Dual-luciferasanalyser sysselsätter eldfluga och Renilla luciferases erbjuder en känslig metod för att studera många intracellulära processer i hög genomströmning format 20. Sammansmältningen av en mål-promotor för att eldflugeluciferas har använts för att studera transkriptionsreglering och promotorstrukturen i många mål in vitro, inklusive alfa-synuklein 1,2. Vi utvecklade ett billigt alternativ till kommersiellt tillgängliga dual-luciferas reagenser som tillhandahålls robust signal och var linjär i intervallet vår analys (Figur 6). Vår metod är anpassad från ett protokoll generöst tillhandahålls av Ron Johnson på NIH och en tidigare beskrivna icke-kommersiella dubbla luciferasanalys 21. Den eldfluga analysbuffert lyserar celler och ger ATP och luciferin, de substrat av eldfluga luciferas. Denna analys ger en glöd-reaktion med en halveringstid av approximativt 1 h (figur 7). Den Renilla analysbuffert släcker firefly signal och ger lämpliga substrat (coelenterazine). Observera att Renilla analysbuffert självt inte kommer att lysera celler och måste användas i kombination med antingen Triton lysbuffert eller eldfluga analysbuffert. Vi fann att tidigare beskrivna Renilla analysbuffertar lätt utfällda vid RT, vilket vi eliminerat natriumsulfat och minskade den mängd natriumpyrofosfat med 60%. Vår analys inkluderar också PTC124, en potent hämmare av eldflugeluciferas 22 som bidrar ytterligare härdning vid analysen. Släckning aktivitet är också av EDTA, NaCl, och pyrofosfat i Renilla buffert. Med dessa nya formuleringar, är cirka 99,5% av firefly aktivitet släcktes genom Renilla buffert. Intensiteten och reproducerbarhet både eldfluga och Renilla luciferas signaler förbättrades något genom blandning efter tillsats av buffertarna (stegen 4,6 och 4,10).
I vår erfarenhet, hela enlpha-synuklein-promotorn i pGL4.10 är unikt svårt att amplifiera och klona, kanske på grund av GC-rika regioner och komplexa sekundärstruktur i intron 2. Vi var mest framgångsrika med STBL4 kompetenta celler, vilka är optimerade för kloning av instabila skär. Även efter dessa försiktighetsåtgärder, återhämtade vi ofta en mutant i vilken E. coli genom-DNA infördes i 3'-änden av konstruktionen. Denna mutant skapar band av ca 5,8 kb och 4 kb då med BamHI (kontra 5,8 kb och 2,8 kb i korrekt klon) och visas som större kolonier på selektiva plattor. Försiktig tillväxt av kompetenta celler vid 30 ° C och förhindra kulturer från att nå mättnads minskar, men eliminerar inte, sannolikheten för att återvinna mutant. Vi rekommenderar att verifiera renheten hos alla DNA-beredningar genom restriktionsdigerering och gelelektrofores före transfektion.
Detta screeningsprotokoll kan lätt anpassas till andra promotorer, end måste optimeras i enlighet därmed, med användning som positiva och negativa kontroller gener som redan är kända för att reglera målet promotorn. Flera överväganden gäller för kloning och transfektion av reporterplasmider. Vid kloning av mål-promotorn in i eldflugeluciferas reporterplasmid bör startstället för luciferas approximera translationsstartstället i målgenen. Dual-luciferas skärmar placera typiskt Renilla-plasmid under kontroll av en minimal promotor, såsom HSV-tk-promotorn, för att minimera effekterna av plasmidskelettet. Dock fann vi att en av våra positiva kontroller inducerade denna promotor, därmed valde vi CMV-promotorn. Den relativa mängden av varje reporterplasmid bör bestämmas empiriskt och påverkas av den konstitutiva aktiviteten hos varje promotor. Idealisk baslinjen (transfekterade, men icke inducerade) luciferas räknas bör vara minst fem till tio gånger över bakgrund från otransfekterade celler, för att möjliggöra upptäckt av library gener som undertrycker eller som orsakar toxicitet, vilket kommer att resultera i lägre signal. Före screening, verifiera att förväntade luciferas räknas faller inom det linjära intervallet för varje analys, som kan variera mellan luminometrar. (Observera att våra Renilla räknas normalt faller i den övre delen av det linjära området i vår analys.) Vi fann att en ökning av förhållandet mellan biblioteks DNA till firefly reporter plasmid resulterade i högre induktioner, vilket vi använde minimalt med denna reporter.
Den transfektion protokollet måste optimeras också. Vi valde 293T-celler för deras relativa lätthet av transfektion, vilkas verkningsgrad ökade 50-faldigt med tillsats av ett centrifugeringssteg (steg 3,5). Den dopaminerga linje SY5Y är över 100 gånger mindre transfekterbara i våra händer, och, som diskuterats ovan, kanske inte optimalt för att utföra överuttryck screening. Vår optimala analystiden var empiriskt bestämts vara 48 tim, vilket våra celler ströks ut med en låg initial densitet, Vilket nödvändiggör användning av Optifect, som är utformad för att transfektera celler vid 10-70% sammanflytning. Andra cellinjer kan kräva olika utgångstäthet och olika transfektionsreagens. Vi valde att ändra cellmedie efter transfektion för att lägga till antibiotika (som kan orsaka toxicitet om närvarande under transfektion). Även om detta minskar risken för bakterieangrepp, det ökar kostnaden i material (särskilt robot pipettspetsar), alltså nödvändigheten av detta steg bör utvärderas när man anpassa detta protokoll till andra system. Luciferas-analyser kan användas med minimal optimering, men innan denna analys i hög genomströmning med en annan celltyp, verifiera att cellerna på lämpligt lyseras genom Triton lyseringsbuffert. Observera att Triton X-100 orsakar coelenterazine autofluorescens. Den Renilla signal i vår analys var stark nog att bagatellisera denna effekt, men när optimera denna analys för andra celltyper, begränsa Triton X-100 liter till milnimal mängd som erfordras för cell-lys.
Vi har presenterat en snabb och relativt billig screening-metod för identifiering av nya transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein använda celler transient transfekterade med en dual-luciferas-reportersystem. Detta protokoll är lätt modifieras för att rikta andra gener av intresse och kan även anpassas för tillämpningar som kräver hög genomströmning transfektion, såsom lentivirus produktion 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av royalties som erhålls genom licensiering BacMamreagents (US patent 5.731.182).
Acknowledgments
Vi tackar John Darga av MGH DNA Kärna för beredning av DNA-screening-biblioteket. Christopher Chigas av Perkin Elmer förutsatt ovärderligt stöd för vår Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco och Martin Thomae av Agilent gett stöd till Bravo roboten. Vi tackar Ron Johnson och Steve Titus vid NIH för generöst ge sin dubbla glöd luciferas analysprotokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
