Summary
Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.
Abstract
Wir stellen eine schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screening-Protokoll zur Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein-Gen mit einer Parkinson-Krankheit zu identifizieren. 293T-Zellen transient mit Plasmiden aus einem Array ORF Expressionsbibliothek transfiziert zusammen mit Luciferase-Reporter-Plasmide, in einem Ein-Gen-per-Well-Mikroformat. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird nach 48 Stunden, um die Wirkungen von jeder Bibliothek Gen auf alpha-Synuclein-Transkription, normiert auf die Expression von einer internen Kontrollkonstrukt (hCMV-Promotor, eine Renilla-Luciferase) zu bestimmen, untersucht. Dieses Protokoll wird von einer Bank-Top-Roboter in einer Biosicherheitsschrank eingeschlossen, die aseptische Handhabung von Flüssigkeiten in 96-Well-Format führt erleichtert. Unsere automatisierten Transfektionsprotokolls ist leicht an Hochdurchsatz-Bibliothek lentivirale Produktion oder andere funktionelle Screening-Protokolle Triple-Transfektionen von einer großen Anzahl von einzigartigen Bibliothek Plasmide in konjugierte erfordernnktion mit einem gemeinsamen Satz von Helfer-Plasmide. Wir stellen auch eine kostengünstige und validiert Alternative zu handelsüblichen, Dual-Luciferase-Reagenzien, PTC124, EDTA und Pyrophosphat Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität vor der Messung der Renilla-Luciferase verwendet drücken. Mit Hilfe dieser Methoden, abgeschirmt wir 7670 menschliche Gene identifiziert und 68 Regulatoren der alpha-Synuclein. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse abzielen.
Introduction
Die Fähigkeit, wichtige genetische Regulationselemente und die Faktoren, die auf sie einwirken zu identifizieren, ist für die Exploration von zahlreichen biologischen Prozessen fundamental. Jedoch Faktoren zu identifizieren, die die Expression von Genen in seltenen Zelltypen regulieren, wie spezifische neuronale Populationen, kann schwierig sein. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von neuartigen Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein (SNCA) präsentieren wir ein Gen, das mit der Parkinson-Krankheit und der dopaminergen Neuronen in der substantianigra ausgedrückt pars compacta Bereich des Mittelhirns. Wir erreichen dies mit einem Hochdurchsatz-, Dual-Luciferase, in-vitro-Reporter Bildschirm, um Alpha-Synuclein-Expression in 293T-Zellen zu dekonstruieren. Die alpha-Synuclein-Promotor wird zunächst in einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase-Gen kloniert. Ein handelsübliches Plasmid, das das Renilla-Luciferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors dient als interne Kontrolle. These-Reporter-Konstrukte in 293T-Zellen cotransfiziert in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek, so dass jede Vertiefung mit einer einzigen Bibliothek transfiziert. Nach 48 Stunden Luciferase-Aktivität für jeden Reporter sequentiell unter Verwendung eines Dual-Schein-Assay gemessen. Renilla-Luciferase-Aktivität in jeder Vertiefung (F: R-Verhältnis) nach der Plattenbasis Normalisierung der relativen Expression von alpha-Synuclein in Reaktion auf jede Bibliothek Gen wird durch das Verhältnis von Glühwürmchen abgeleitet.
Dieses Protokoll stellt die Fähigkeit, eine große Anzahl von Genen (~ 2.500 pro Woche) auf ihre Fähigkeit, ein Reportergen zu trans Verwendung minimaler Arbeitskraft (1-2 Personen) und minimalen Kosten (etwa 3 $ Reagenzienkosten pro Mikroassay) zu screenen. Transkriptionsregulatoren der neuronalen Gene (z. B. alpha-Synuclein), die schwierig in kultivierten Neuronen refraktär genetische Manipulation zu studieren, können Seite an Seite in dieser direkten funktionellen Assay verglichen werden. Wir sind in unsererProtokoll eine ausführliche Verfahren für das Klonen und das Wachstum der Plasmide, die das Alpha-Synuclein-Promotor, da wir festgestellt, dass Plasmide, die diese Region instabil sind, wenn sie mit herkömmlichen Verfahren (siehe Diskussion) gewachsen. Wir berücksichtigen auch eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien für die Hochdurchsatz-Assays. Dieses Protokoll kann leicht an andere regulatorische Elemente von Interesse, oder zu jedem Prozess eine hohe Durchsatz transienten Transfektionen Ziel werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Für eine experimentelle Übersicht siehe Abbildung 1.
1. Bereiten Reporter Plasmide, die die Alpha-Synuclein Promoter
Regulatorischen Elemente des alpha-Synuclein-Gen (Fig. 2) erstrecken etwa 10 kb, von der stromaufwärts NACP (Nicht-A-beta-Peptid Amyloid-Komponente) 1,2-Dinukleotid-Repeat-Sequenz durch Introns 2 3. Wir schließen einen Teil dieser Region unsere Reporter-Konstrukt. Wir fanden, daß Plasmide, die Intron 2 erforderliche spezielle Verfahren für das Wachstum, wie unten beschrieben. Die Luciferase-Plasmiden pGL4.10 und pGL4.75 (Fig. 3), sind im Handel von Promega und kann unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Protokollen vermehrt werden.
- Verstärken die zwei Komponenten des Alpha-Synuclein-Promotor in getrennten PCRs mit dem Rezept in Tabelle 1 und der Primer in Tabelle 2.
- Verify PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel und sauber unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) unter Elution in 50 &mgr; l TE (Tris-EDTA). Bewahren Sie die eluierten 0,9 kb-Fragment bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.
- Verdauen das gesamte Volumen des 3,4 kb PCR-Fragment sowie 5 ug pGL4.10, mit SacI und XhoI. Behandeln Sie den Vektor mit Kalbsdarm-Alkalische Phosphatase (Roche) und Gel reinigen mit dem Purelink Schnell Gel Extraction Kit (Invitrogen).
- Ligation des Fragments und Vektor Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB). Reinigen Sie das ausgefüllte Reaktion unter Verwendung des Purelink Micro PCR-Kit (Invitrogen) unter Elution in 10 ul TE-Puffer.
- Transformations 2 ul des gereinigten, Ligation in 20 ul ElectroMAX Stbl4 kompetente Zellen (Invitrogen) und Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schütteln in einem 30 ° C Inkubator bei 225 Upm für 90 min. Verbreiten 2 Volumina auf LB-Platten, die 100 mg / ml Ampicillin und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage.
- Mit einem Zahnstocher, wählen Sie 4-6 kleine Kolonien für die Impfung in 2 ml TB (Terrific Broth). Wachsen diese Miniprep Kulturen in ein 30 º C-Schüttler O / N.
- Reinige Plasmid-DNA aus 1,5 ml jeder Kultur Miniprep mit dem Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen).
- Verdauen die Minipräparationen mit BamHI und Elektrophorese auf einem Agarose-Gel. Die richtige Klon sollte Fragmente von 2,8 kb und 4,9 kb zu produzieren.
- Restreak die verbleibende Miniprep-Kultur von der richtigen Klons auf eine frische LB (Luria Broth)-Platte und wachsen bei 30 ° C für 2 Tage.
- Wählen Sie einen kleinen Kolonie und impfen 1,5 ml TB Starterkultur. Schütteln Sie O / N bei 30 ° C Lassen Sie sich nicht die Starterkultur zur Sättigung wachsen.
- Verdünnt das gesamte Starterkultur in 150 ml vorgewärmtem TB und schüttelt bei 30 ° C für 2 Tage. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt, verwenden Sie 1,5 ml dieser Kultur für eine zusätzliche Miniprep und Verdauung zu bestätigen, dass der Klon nicht während replicati mutieren auf.
- Reinige Plasmid-DNA aus den verbleibenden Kultur mit dem Purelink HiPure Maxiprep Plasmid-Kit (Invitrogen). Erwartete Erträge dieses Zwischen Plasmid sind 50-150 g pro 150 ml der Kultur.
- Auftauen 0,9 kb-Fragment in Schritt 1.2 eingefroren. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.12, die 0,9 kb-Fragment in die Zwischen Plasmid klonen, zu verdauen, statt mit KpnI und SacI. Ligats, umzuwandeln, wählen Sie, und wachsen für Maxipreps wie oben. Digestion mit BamHI sollten Fragmente von 5,8 kb und 2,8 kb ergeben. Dies ist das Plasmid, das für den Bildschirm verwendet werden.
2. Bereiten 293T-Zellen, Reporter Plasmide und DNA-Bibliothek für Screening
293T-Zellen werden zunächst in 96-Well-Platten transfiziert und am folgenden Tag. Reporter-Plasmide und DNA-Bibliothek werden in 96-Well-Platten verdünnt. Wir erhaltenen Platten der Transfektion-Grade-Bibliothek-DNA aus der DNA-Core am Massachusetts General Hospital (bekommen = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Dieses Protokoll transfiziert eine einzelne Bibliothek Platte in zwei identische Platten von 293T-Zellen (Abbildung 1), sollten also 2 Platten von Zellen für jede Bibliothek Platte abgeschirmt werden ausgesät werden.
Hinweis: Wachsen Zellen in Medium ohne Phenolrot oder Antibiotika, da diese nicht mit den Luciferase-Assays und erhöhen Toxizität während der Transfektion sind.
- Für jede Bibliothek Platte, resuspendieren trypsiniert 293T Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10 5 Zellen / ml in DMEM, das 14% FBS gescreent werden. Gießen Sie in einen sterilen Behälter (Axygen).
- Setzen Sie den Behälter, 2 klarem Boden, 96-Well-Platten (Corning) und eine Schachtel Filterpipettenspitzen (Agilent) auf der Roboter-Deck. Verteilen von 100 &mgr; l Zellen in jede Vertiefung der beiden Platten bei einer Dichte von 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung.
- Zentrifugieren Sie die Zellplatten bei 50 g für 2 min, mit niedrigen Drehzahlen, gleiche Rampe zu gewährleistenZelldichte während jeder gut. Bei 37 ° C und 10% CO 2 O / N.
- Verdünnen Sie die Firefly-und Renilla Reporterplasmide bis 5 ng / ul in Serum-freien Medien. Kombinieren der Verdünnungen im Verhältnis 5:3 Glühwürmchen Renilla-Plasmid (das Volumen) in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Pipettieren die kombinierten Plasmide in jedes Well einer 96-Well-Platte, Abgabe 17 ul pro Bibliotheksplatte plus 2-10 ul Überschuss, in jede Vertiefung.
- Erhalten Transfektion-Grade-DNA-Bibliothek Platten wie oben und mit Wasser auf 13,3 ng / ul mit Endotoxin-freiem Wasser. Das Mindestvolumen pro Well 28 ul sein sollte.
3. Führen Transfektionen
Am Tag 2 des Bildschirms werden Reporterplasmide und Bibliotheks DNAs in 293T-Zellen transfiziert.
- Für jede Bibliothek Platte, mischen 107,5 ul RT Optifect (Invitrogen) mit 4,3 ml Serum-freien Medien (1:40-Verdünnung) in einem Polystyrolröhrchen. Inkubation für 5 min bei RT undn verzichten 44 ul (pro Bibliothek Platte) in jedes Well einer 96-Well-, Polystyrol V-Bodenplatte (Greiner).
- Die Platte des verwässerten Optifect, Reporter-Plasmide (Schritt 2.5), Bibliothek DNAs (Schritt 2.6), und eine Schachtel-Pipettenspitzen auf der Roboterplattform.
- Saugen Sie 17 ul Reporterplasmide, 43 ul verdünnte Optifect und 26 ul DNA-Bibliothek, Einfügen eines 5 ul Luftspalt zwischen den einzelnen Streben. Die Bibliothek DNA sollte zuletzt angesaugt werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Dispense den Inhalt der Tipps in eine neue Polystyrol V-förmigen Platte, mischen, Deckel, und beiseite stellen für 20 Minuten, damit Lipid / DNA-Komplexe zu bilden. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Pipettenspitzen und Bibliotheksplatte, und wiederholen.
- Entdecken Sie die Optifect / DNA-Gemisch Platte und legen Sie es auf die Roboterplattform mit 2 Platten von 293T-Zellen. Mit einer einzigen Box von Pipettenspitzen, aspirieren 80 ul der Optifect: DNA-Gemisch und langsam 40 ul verzichten auf jede Platte von Zellen. Wenn transkleinerung, Desinfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Optifect: DNA-Platten. Decken-Zellen.
- Zentrifugieren der Zellplatten bei 1200 × g für 30 min. Decken und zurück in den Inkubator.
- Inkubieren Sie die Zellen für 4-6 Stunden. Während dieser Inkubation bereiten frische Medien durch Mischen von 12 ml DMEM mit 10% FBS und 10 pg / ml Ciprofloxacin (CellGro) für jede Bibliothek transfiziert Platte. Gießen Sie frisches Medium in einem sterilen Behälter.
- Platz 2 Boxen der Roboter-Tipps, eine einzige Platte von Zellen, das Reservoir mit frischem Medium und einen Abfallbehälter auf der Roboterplattform. Aspirat 100 ul Medium aus den Zellen und Abgabe in den Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Mit frischen Tipps, absaugen 100 ml frisches Medien und langsam auf die Zellen zu verzichten. Wiederholung für alle Platten der Zellen.
- Rückgabe Platten in den Inkubator für 48 Stunden.
4. Führen Dual-Luciferase-Assays
Am Tag 4 des Bildschirms, dieGlühwürmchen-und Renilla-Luciferase-Assays durchgeführt werden.
Hinweis: Die Dual-Luciferase-Assay erfordert die sequentielle Zugabe von 2-Assay-Puffer, 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und 3X Renilla Assaypuffer, wie in Tabelle 3 beschrieben Firefly Luciferase und Renilla nicht sezerniert wird, so müssen die Zellen vor der Messung der Luciferase-Aktivität, lysiert werden. . Firefly-Assay-Puffer lysiert Zellen und bietet Substrat für die Firefly Luziferase; Renilla-Assay-Puffer löscht den Glühwürmchen-Signal und liefert Substrat für die Renilla-Luciferase.
- Für jede Bibliothek Platte, bereiten 8 ml 3X Glühwürmchen Testpuffer aus Stammlösungen, wie in Tabelle 3 beschrieben, und verzichten 82 ul in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte.
- Für jede Bibliothek Platte, bereiten auch 12 ml 3X Renilla-Assay-Puffer und 122 ul verzichten in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. Beiseite sowohl dieGlühwürmchen und Renilla-Assay-Puffer.
- Legen Sie ein Feld von Pipettenspitzen, ein Abfallbehälter und 2 Platten von Zellen (aus derselben Bibliothek Platte transfiziert) auf der Roboterplattform.
- Saugen Sie 60 ul Medien von jeder Platte und entsorgen in der Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Deckplatten und beiseite stellen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Sätze Teller.
- Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform.
- Saugen Sie 40 ul 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf neue Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Zeigen Zellen bei RT für 10 min, um die Lyse zu vervollständigen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Boxen von Tipps und Zellplatten, und wiederholen.
- Rekord Lumineszenz aus jeder Vertiefung jeder Zelle Platte auf einem Luminometer, Aufzeichnung für 1 Sekunde pro Vertiefung. Rückgabe Platten auf den RoboterDeck.
- Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Renilla-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform.
- Saugen Sie 60 ul 3X Renilla-Assay-Puffer, und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf eine neue Box von Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Gruppen von Zellplatten.
- Rekord Lumineszenz von allen Platten auf einem Luminometer, Aufzeichnen jeder gut 1 Sekunde wie oben. Entsorgen Platten.
5. Data Analysis
- Berechnen Sie die Glühwürmchen: Renilla-Lumineszenz-Verhältnis ("F: R-Verhältnis") für jede gut durch Teilung des Grafen von Glühwürmchen-Signal von den Grafen von Renilla-Signal.
- Berechnung der Induktion durch Teilen der F R-Verhältnis jedes vom durchschnittlichen F: R-Verhältnis der Platte, mit Ausnahme der höchsten und der niedrigsten 25% der Vertiefungen.
- Mittelwert der Induktionswerte über Wiederholungenfür eine einzelne Bibliothek transfiziert Platte. Gene induzieren oder Unterdrückung alpha-Synuclein mehr als drei Falten werden in diesem Bildschirm als "Treffer" und unterliegen weiteren Validierung und sekundären Bildschirmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische Luciferase-Werte, F: R-Verhältnisse und Induktion Werte für ein einzelnes Halbplatte sind in Abbildung 4 dargestellt Beachten Sie die Hit in gut H2, einem 32-fach-Induktor.. Gene verursacht übermäßige Toxizität (z. B. auch E3), oder Brunnen, die schlecht transfiziert wurden, werden niedrige Werte sowohl für Glühwürmchen und Renilla Luciferase produzieren, aber eine durchschnittliche Induktionswert. Genen, die nicht-spezifische Induktion der Luciferase-Aktivität, möglicherweise über eine Wechselwirkung mit der Hauptkette pGL4 wird Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase ebenso zu induzieren, was zu einer durchschnittlichen Induktionswert. Große Unterschiede in der Induktion Werte zwischen Wiederholungen sollten Verdacht für Ausführungsfehler zu erhöhen. Es ist wichtig zu überprüfen, dass der Schirm innerhalb des linearen Bereichs der Reporter-Assays durchgeführt, dass Klone, die eine erhöhte Expression bewirken wird eine erhöhte Luciferaseaktivität gemessen werden. Wir transfizierten zunehmende Menge jedes Reportergens, um die Linearität zu überprüfender Reporter-Assay unter unseren experimentellen Bedingungen (Fig. 5). Es ist auch wichtig, um die Tests durchzuführen unverzüglich nach der Inkubationsschritt, um die Nichtlinearität aufgrund der Substratverbrauch zu vermeiden. Wir beobachteten signifikante Luciferase-Aktivität bis zu 1 h nach der Zugabe der Reagenzien (Abbildung 6).
Abbildung 1. Experimentelle Übersicht. Jede einzelne Platte von DNA-Bibliothek ist mit zwei Reporterkonstrukte kombiniert und verwendet werden, um doppelte Platten der Transfektion von Zellen. Nach 48 Stunden wird die Aktivität jedes Luciferase-Reporter nacheinander gemessen. Die spezifische Induktion des Promotors SNCA Plasmid durch jede Bibliothek Plasmid wird durch das Verhältnis der Leuchtkäfer-Luciferase Renilla nach Platte Basis berechnet normalization.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der 5'-Region von Alpha-Synuclein (SNCA), auf Chromosom 4, in der Glühwürmchen-Reporter-Plasmid verwendet. Primer Namen entsprechen den Sequenzen, die in Tabelle 2. Hatch Markierungen zeigen eine etwa 8 kb Segment aus der Figur eliminiert Andernfalls maßstäblich. Das ATG-Start-Codon für SNCA in Exon 3 befindet.
3. Luciferase-Reporter-Plasmide in diesem Screening-Protokoll verwendet. Die SNCA genomischen Regionen sind in die multiple Klonierungsstelle kloniert pGL4.10 unmittelbar vor der Firefly Luziferase. Ein Plasmid mit dem hCMV-IE1 (humanen Cytomegalovirus Immediate Early 1) Promotor, der die Expression von Renilla-Luciferase wurde als interne Kontrolle verwendet. Beide Plasmide sind im Handel erhältlich von Promega.
4. Repräsentative Ergebnisse für die Hälfte eines einzelnen 96-Well-Platte. A. Raw Firefly Luziferase zählt B. Raw Renilla Luciferase zählt C. F:.. R-Verhältnisse, indem der Wert in A durch den Wert in B. D. Induktionswerte für jeden gut, berechnet, indem jedes F berechnet: R-Verhältnis durch die durchschnittliche F:. R-Verhältnis von der Platte, ohne den oberen und unteren 25% der Brunnen E. Grafische Darstellung der Induktionswerte für eine einzelne Platte, mit gut H2, einem positiven Treffer, hervorgehoben. Hit H2 ist eine neuronale Transkriptionsfaktor die zuvor nicht mit SNCA Expression assoziiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
5. Linearität Assays. Die Zellen wurden mit steigenden Mengen von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Plasmiden unter der Kontrolle des starken hCMV-IE1-Promotor transfiziert und mit dem obigen Protokoll getestet. (Gesamtmenge an DNA transfiziert wurde konstant durch Verwendung eines neutralen Ausgleichs Plasmid gehalten). A. Firefly Linearitätstest. Beachten Sie, dass Glühwürmchen-Aktivität bleibt linear durch eine breite Palette von Werten. B. Linearität Renilla-Assay. Beachten Sie die Abflachung der Kurve oberhalb von 15 ng / well.
.. Abbildung 6 Zeitlicher Verlauf der Abfallsignal für Glühwürmchen-Luciferase Luciferase-Assay-Reagenzien wurden zu einer einzigen Platte mit einer CMV-Luciferase-Konstrukt transfiziert zum Zeitpunkt 0 zugegeben; Reihenmessungen wurden ohne die Zugabe weiterer Reagenzien hergestellt.
| Komponente | Volumen | Endgültige Konzentration |
| BAC 2002-D6 bei 5 ng / ul | 4 ul | - |
| 5X Phusion GC-Puffer | 20 ul | 1X |
| DMSO | 6 ul | 6% |
| dNTPs (10 mM) | 2 ul | 200 uM |
| Forward Primer (100 uM) | 1 ul | 10 uM |
| Reverse Primer (100 uM) | 1 ul | 10 uM |
| ddH2O | 65 ul | - |
| Phusion DNA Polymerase | 1 ul | - |
| Insgesamt wurden 100 ul |
Tabelle 1. PCR-Setup zur Verstärkung des Alpha-Synuclein-Promotors.
| Name | Folge | Restriktionsstelle |
| SNCA7 | 5'-gtc GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI |
| SNCA8 | 5'-tgc gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | SacI |
| SNCA1 | 5'-tct gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | SacI |
| SNCA2 | 5'-Tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI |
.. Tabelle 2 Primer für die Amplifikation des Alpha-Synuclein-Promotor Die NACP Wiederholen Amplikon sollte ein 0,9 kb-Fragment zu erzeugen; die andere Amplikonlänge 3,4 kb. Für Primer Standorten, siehe Bild 2.
| A: 3X Firefly Assay-Puffer | ||
| Auf Solutions (bei -80 ° C) | Volumen pro 100 ml 3X Firefly Assaypuffer | Endgültige Konzentration (3X) |
| 500 mM DTT | 3,0 ml | 15 mM |
| 10 mM Coenzym A | 6,0 ml | 0,6 mM |
| 100 mM ATP | 0,45 ml | 0,45 mM |
| 80 mg / mlluciferin | 0,525 ml </ Td> | 4,2 mg / ml |
| Triton-Lyse-Puffer | 90,025 ml | - |
| B. Triton Lysis Buffer | ||
| Component (Lagerung bei RT) | Volumen pro 100 ml Triton-Lysepuffer | Endgültige Konzentration |
| Tris-HCl-Pulver | 1.705 g | 0,1082 M |
| Tris-Basenpulver | 0,508 g | 0,0419 M |
| 5 M NaCl | 1,50 ml | 75 mM |
| 1 M MgCl 2 | 0,30 ml | 3 mM |
| Triton X-100 reine Flüssigkeit | 0,75 ml | 0,25% |
| Wasser | auf 100 ml Gesamtvolumen | - |
| C. 3X Renilla Assaypuffer | ||
| Volumen pro ~ 100 ml 3X Renilla Assaypuffer | Endgültige Konzentration (3X) | |
| 10 mM in DMSO PTC124 | 0,6 ml | 0,06 mM |
| 2 mM h-CTZ in Ethanol | 0,5 ml | 0,01 mM |
| Renilla Salze | 100 ml | - |
| D. Renilla Salze | ||
| Component (Lagerung bei RT) | Volumen pro 100 ml Renilla Salze | Endgültige Konzentration |
| 0,5 M Na 2 EDTA | 9,0 ml | 45 mM |
| Na Pyrophosphat | 1,34 g | 30 mM |
| NaCl | 8,33 g | 1.425 M |
| Wasser auf 100 ml Gesamtvolumen | - | |
Tabelle 3. Stammlösungen und Assay-Puffer für die Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase-Assays. A. 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer Rezept. DTT Dithiothreitol. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Komponenten löslich in Wasser. B. Triton Lysepuffer Rezept. C. 3X Renilla Testpuffer Rezept. h-CTZ, h-Coelenterazins. Machen 2 mM H-CTZ durch Zugabe von 10 mg H-CTZ 12,2 ml 100% EtOH und 120 ul konzentrierter HCl. PTC124 ist in DMSO. D. Renilla Salze Rezept löslich. Triton-Lyse-Puffer und Renilla Salze sind stabil für mehrere Wochen bei 4 ° C und RT verbunden. 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und 3X Renilla-Assay-Puffer sollte innerhalb von 3-4 Stunden der Durchführung des Luciferase-Assay gemischt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit (PD) als Bestandteil der Lewy-Körper 4, intrazellulären Einschlüssen als pathognomonisch für die Krankheit in Verbindung gebracht. Zahlreiche genomweiten Assoziationsstudien haben Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Alpha-Synuclein mit einem erhöhten Risiko für sporadische PD 5,6,7 verbunden. Obwohl weniger verbreitet als sporadische PD, familiäre PD kann auch durch Mutationen im Alpha-Synuclein 8 verursacht werden, sowie Vervielfältigung und der Verdreifachung der Alpha-Synuclein-Locus 9,10,11, ein Phänomen, das auch in sporadischen PD 12 zu sehen. Zusammengenommen zeigen diese Studien verstärken die Zentralität von Alpha-Synuclein an der Pathogenese der PD. Das Ziel dieser Bildschirm war, um Gene, die Alpha-Synuclein regulieren zu identifizieren und können daher in der Pathogenese der Parkinson-Krankheit eine Rolle spielen. Unter Verwendung dieses Protokolls suchten wir 7.670 menschliche Gene identifiziert und 154 Vorab Treffern (mindestens 3-fach Induktoren), was 140einzigartige Gene. Diese Treffer waren Gegenstand Sekundärtests mit neuen DNA-Präparate zu Hit Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Treffer in der 3-fachen Bereich bei 28% der nachfolgende Luciferase-Assays wiedergegeben. Reproduzierbarkeit erhöht auf 59%, 69% und 78% in 4 -, 5 -, und 5-fach-Induktoren sind. Hits mit Induktion über 7-fach reproduziert 100% der Zeit. Wir letztlich identifiziert 68 neue Regulatoren von Alpha-Synuclein-Transkription.
Verschiedene Hinweise deuten darauf hin, dass die von uns erlangten 68 Hits sind echte Regulatoren der alpha-Synuclein. Unsere Liste der identifizierten Hits enthält GATA3, ein Mitglied der GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren zuvor gezeigt SNCA Ausdruck 3 zu regeln. Scoring einer der wenigen bekannten SNCA Regulatoren gibt großes Vertrauen in die Zuverlässigkeit unserer Bildschirm. Darüber hinaus haben wir unabhängig erzielt als Treffer mehrere Mitglieder der gleichen Familie von Transkriptionsfaktoren neuronalen, was darauf hindeutet, dass der Bildschirm nicht reproduzierbar und Identifizierung von Genenzufällig. Am wichtigsten ist, in weiteren Follow-up-Tests, die Fähigkeit unserer Top-Hits, die endogene SNCA-Expression in neuronalen Zellen wurde im Überexpression und Knockdown-Tests validiert regulieren. Wir überexprimiert ein paar der Top-Hits mit BacMamvectors 3 in dopaminergen Zellen SY5Y und konnten endogene SNCA Spiegel erhöhen 2-8 fache, während shRNA Zuschlags dieser Treffer führte zu einer verringerten SNCA mRNA-Spiegel. Diese Studien zeigen schlüssig, dass unsere Top-Hits sind Regulatoren des endogenen SNCA Ebenen und sind nicht einfach nur Artefakte der dekonstruiert Luciferase-System. Zusätzliche Follow-up-Studien für andere Hits werden benötigt, um die wahren falsch positive und falsch negative Raten für die vollständige Liste der Treffer in unserem Bildschirm zu bestimmen. Eine vollständige Beschreibung der Hits und ihre Beziehung zu der Parkinson-Krankheit ist in Vorbereitung 14.
Es ist wichtig, die Grenzen der Screening-Methode prüfen. Es sollte obv werdenSchuldscheine, die der Bildschirm würde keine Regler nicht identifizieren in der Screening-Bibliothek zu präsentieren. Während unsere Screening-Bibliothek war beträchtlich, die etwa ein Viertel des menschlichen Genoms, war es nicht umfassend. Angesichts der Einfachheit unserer Test könnten zusätzliche Bibliotheken mit Leichtigkeit zu sehen sein. Wir erhöhten die Anzahl der Gene gezielt, indem Paralogen der Treffer, wenn verfügbar abgeschirmt, in unserer Sekundärtests. Wir würden auch keine Treffer, die genomischen Regionen außerhalb der in unserem Reporter-Konstrukt enthalten gebunden punkten. Um die Wahrscheinlichkeit zu, einschließlich der richtigen Region zu maximieren, enthielt unser Reporter die unmittelbaren flankierenden Sequenzen für die mehrere Transkriptionsstartstellen in der SNCA-Promotor gefunden. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Faktoren binden an Regionen weit außerhalb des unmittelbaren Promotorregion SNCA Expression regulieren. Dies könnte durch Ausführen Bildschirme mit zusätzlichen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Regionen erfasst werden, falls erwünscht, wenn auch nur ~ 10 kb zu einem Zeitpunkt könnte einauf diese Weise aufgrund der Beschränkungen auf effiziente Klonierung in Plasmid-Vektoren und die Stabilität der hohen Kopienzahl pGL4 Vektoren ssessed. Alternativ könnte die Luciferase-Konstrukt in BAC-DNA, die das SNCA Locus nachgerüstet werden. Ein Nachteil der letzteren Ansatz ist, dass die Transfektion von BAC selbst unter idealen Bedingungen> 100-fach weniger effizient dann Plasmide 15. Ein anderer Ansatz wäre, "Knock-in" das Luciferase-Reporter in das endogene SNCA Locus, eine Methode, die ist weit aufwändiger dann unser Ansatz. Wir würden auch keine Treffer, die bereits bei der Sättigungsniveaus, so dass die Überexpression nicht zu einer erhöhten Aktivität führen Luciferase exprimiert wird punkten. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden nicht-neuronalen 293T-Zellen, die neuronalen Faktoren Regel SNCA fehlen könnte, und in der Tat haben wir Gäste eine Reihe von Transkriptionsfaktoren neuronalen beschäftigen. Einen potentiellen Nachteil der 293T-Zellen, ist jedoch, daß wir jedes Gen nicht punkten kann als Treffer, wenn es erforderlich einW eitere neuronalen Faktoren richtig zu funktionieren. So, wie alle Bildschirme, unsere Studie eine Reihe von möglichen SNCA Regula verpassen. Doch in der Praxis, die 68 Hits Erhöhung erhalten wir die Anzahl der bekannten Regulatoren der SNCA um mehr als das 10-fache und wird Jahre Arbeit erfordern, zu verfolgen, so dass weitere Treffer nicht notwendig sein in unserem Fall.
Es ist auch wichtig, um die potentiellen Artefakte, die auftreten können mit dieser Methode zu realisieren. In der chemischen Bildschirme, ist berüchtigt für Luciferase artifactually Scoring-Verbindungen, die durch Stabilisierung des Luciferase-Protein nicht durch Induktion der Transkription. Um auszuschließen, Proteinstabilisierung Artefakte, abgeschirmt wir Treffern gegen mehrere andere Promoter-Luciferase-Konstrukte und brachte keine Treffer, die post-transkriptionell durch Erhöhung Ausdruck von konstitutiven Promotoren wirken erschien finden. Eine weitere potentielle Artefakt könnte eine transaktivierende Faktoren, die zu pGL4 Vektorgerüst nicht bindetdie SNCA-Promotors. Wir beschäftigten die pGL4 Vektor, der ausgiebig mutiert hat Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, um dieses Problem zu vermeiden, entfernen. Um zu beurteilen, ob einer unserer Treffern erforderlich, die den Vektor-Backbone für Induktion, PCR wir die SNCA-Luciferase-Vektor-Region frei von jeder Rückgrat verstärken und verwendet diese lineare Fragment als Reporter für Sekundärtests. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der Induktionswerte zwischen unseren vollständigen Plasmid-Reporter und der linearen Rückgrat freien Konstrukt mit einer Ausnahme. GATA2 zeigte ~ 15-fache Induktion der Reportergen-Plasmid, aber nur ~ 2,7 fache der linearen Reporter, was darauf hindeutet, dass einige der GATA2 Induktion kann durch Bindung an Backbone-Komponenten sein.
Eine Anzahl von anderen Verfahren zur Transkriptionsregulatoren identifiziert wurden beschrieben. Vor fast 30 Jahren, über die Abbildung der transfizierten Reportergenexpression cis-wirkende Transkriptionskontrollelemente in starken viralen Promotoren est wurdeablished 16. Diese Methode, die manchmal als "Promotor-bashing", hat in der Gunst für die Zuordnung von Zelltyp-spezifische Promotoren gefallen, da es schwierig ist, geeignete primäre Zelllinien zu erhalten und Transfektion und solche Leitungen können ihre Ursprungsgewebe nicht genau darstellen. Die Hefe-Hybrid-System ein 17 umgeht dieses Problem durch die Bereitstellung eines dekonstruierten Reportersystem, um Wechselwirkungen zwischen einer Bibliothek von Fusionsgenen und einer spezifischen cis-wirkendes Element zu erkennen. Unser Ansatz ist ähnlich dem einer Hefe-Hybridsystem in seinem zerlegten Design, aber in unserem System verwenden wir normale Expressionsklone nicht Genfusionen, beschäftigen wir Säugerzellen statt Hefe und beschäftigen Robotik die Seite-an-Seite ermöglicht quantitative Funktionsanzeigen für jeden Test-Gens. Eine vielversprechende Methode bezeichnet Proteomik von isolierten Chromatins Segmente (PICH) die Identifizierung von Proteinen an spezifische Genomregionen gebunden ist beschrieben worden, 18 ermöglicht, aber noch nichterfolgreich auf Einzelkopie-menschlichen Genen angelegt. Genomweite Chromatinimmunpräzipitation (ChIP-Seq-und Chip-Chip-) Studien verwendet worden, um cis-aktiven Regionen in großem Maßstab 19 zu identifizieren. Dieses Verfahren ist potentiell leistungsfähige, aber wie PICH, weniger nützlich für die Zelltypen, wie spezifische neuronale Populationen, die nicht leicht in homogene Kultur erhalten werden. Außerdem, wenn wir ChIP Datenbanken für unsere validierten Hits überprüft, können sie nicht Bindung dieser Treffer auf die SNCA-Promotor gezeigt haben. Der Grund dafür ist nicht klar, da wir in der Lage zu zeigen, Bindung dieser Faktoren an den Promotor durch SNCA herkömmlichen Chip-14; jedoch kann aufgrund des Fehlens der gesamten SNCA Promotor-Region ist in der Chip-Microarray-Studien unter Verwendung von Positionsanzeigen (Chip-Chip) verwendet werden. Pich, ChIP-seq und andere proteomische Ansätze kann daher sehr nützlich, wenn die direkten Funktionsanzeigen, die unsere Methode generiert gekoppelt.
Dual-LuciferaseAssays, die Firefly-und Renilla-Luciferase bieten eine empfindliche Methode für die Untersuchung zahlreicher intrazellulärer Prozesse in Hochdurchsatz-Format 20. Die Fusion eines Zielpromotors zu Glühwürmchen-Luciferase verwendet wurde, um die transkriptionelle Regulation und Promotorstruktur zahlreiche Ziele in vitro, einschließlich alpha-Synuclein 1,2 studieren. Wir entwickelten eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien, die robuste Signal zur Verfügung gestellt und war linear im Bereich von unseren Test (Abbildung 6). Unser Verfahren ist aus einem Protokoll großzügig von Ron Johnson am NIH und einer zuvor beschriebenen nicht-kommerzielle Dual-Luciferase-Assay 21 angepasst. Die Glühwürmchen-Assay-Puffer lysiert Zellen und liefert ATP und Luciferin, die Substrate von Firefly Luziferase. Dieser Test ergibt ein Glühen Reaktion mit einer Halbwertszeit von etwa 1 h (Fig. 7). Die Renilla-Assay-Puffer löscht den fireflY-Signal und stellt entsprechende Substrat (Coelenterazin). Beachten Sie, dass die Renilla-Assay-Puffer selbst nicht lysieren Zellen und muss in Kombination mit entweder Triton-Lyse-Puffer oder Glühwürmchen-Assay-Puffer verwendet werden. Wir fanden, dass die zuvor beschriebenen Renilla-Assay-Puffer bei RT leicht ausgefällt, so eliminiert man Natriumsulfat und verringert die Menge an Natriumpyrophosphat von 60%. Unser Assay schließt auch PTC124, ein potenter Inhibitor von Firefly Luziferase 22, die zusätzliche Abschreckung im Assay trägt. Abschrecken Aktivität wird auch durch EDTA, NaCl und Pyrophosphat in der Renilla-Puffer vorgesehen ist. Mit diesen neuen Formulierungen wird ca. 99,5% der Glühwürmchen-Aktivität durch die Renilla Puffer gelöscht. Die Intensität und die Reproduzierbarkeit von sowohl Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Signale leicht durch Mischen nach der Zugabe von Puffer (Schritte 4.6 und 4.10) verbessert.
Nach unserer Erfahrung die komplette einlpha-Synuclein-Promotor in pGL4.10 ist eindeutig zu schwer zu verstärken und zu klonen, vielleicht, weil der GC-reichen Regionen und komplexen Sekundärstruktur in Intron 2. Wir waren sehr erfolgreich STBL4 zuständigen Zellen, die für die Klonierung von instabilen Einsätze optimiert sind. Auch die folgenden Vorsichtsmaßnahmen, die wir häufig wieder eine Mutante, in der E. coli-Genom-DNA wurde in das 3'-Ende des Konstrukts eingefügt. Diese Mutante erzeugt Banden von etwa 5,8 kb und 4 kb BamHI, wenn sie mit (gegenüber 5,8 kb und 2,8 kb in der richtigen Klon) verdaut und erscheint als größere Kolonien auf selektiven Platten. Vorsichtig Wachstum von kompetenten Zellen bei 30 ° C und verhindert Kulturen aus der Sättigung verringert, aber nicht beseitigt, die Wahrscheinlichkeit der Gewinnung der Mutante. Wir empfehlen die Überprüfung der Reinheit aller DNA-Präparate durch Restriktionsverdau und Gelelektrophorese vor der Transfektion.
Dieses Screening-Protokoll ist leicht auf andere Promotoren angepasst, eined ist entsprechend optimiert werden, wobei als positive und negative Kontrollen bereits bekannt, die Zielpromotor Gene regulieren. Mehrere Überlegungen gelten für die Klonierung und Transfektion der Reporter-Plasmide. Beim Klonen des Zielpromotor in die Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Plasmid, sollte die Startstelle der Luciferase die Translationsstartstelle in dem Zielgen nähern. Dual-Luciferase-Bildschirme stellen typischerweise die Renilla-Plasmid unter der Kontrolle eines Minimalpromotors, wie die HSV-tk-Promotor, um Effekte der Plasmid-Rückgrat zu minimieren. Allerdings fanden wir, dass einer unserer positiven Kontrollen induziert diesen Promotor, damit für die CMV-Promotor entschieden wir uns. Die relative Menge jeder Reporter-Plasmid sollte empirisch bestimmt werden und wird durch die konstitutive Aktivität von jedem Promotor beeinflusst. Ideal Basislinie (transfiziert, aber nicht induzierten) Luciferase Zahl sollte mindestens fünf-bis zehnfach über dem Hintergrund von nicht transfizierten Zellen zu sein, um den Nachweis von Bibliotheken ermöglicheny Gene, verdrängen oder die Ursache Toxizität, welche im unteren Signal führen wird. Vor dem Screening sicher, dass erwartet Luciferase zählt im linearen Bereich von jedem Test fallen, die zwischen Luminometern variieren kann. (Beachten Sie, dass unsere Renilla zählt am oberen Ende des linearen Bereichs in unserem Test in der Regel fallen.) Wir fanden, dass die Erhöhung des Verhältnisses von DNA-Bibliothek, um Glühwürmchen-Reporter-Plasmid führte zu höheren Induktionen, wodurch die minimale Menge von dem Reporter haben wir.
Die Transfektion Protokoll muss ebenfalls optimiert werden. Wir wählten 293T-Zellen für ihre relative Einfachheit der Transfektion, deren Effizienz um 50-fach mit der Zugabe einer Zentrifugation (Schritt 3.5). Die dopaminergen Linie SY5Y ist über 100-mal weniger transfizierbar in unseren Händen, und, wie oben erläutert, kann nicht optimal für die Durchführung von Screening-Überexpression. Unsere optimale Testzeit wurde empirisch ermittelt, um 48 h sein, damit unsere Zellen wurden bei einer niedrigen Anfangsdichte vernickelt, Dass die Verwendung von Optifect, die entworfen ist, um Zellen bei 10-70% Konfluenz zu transfizieren. Andere Zelllinien können unterschiedliche Ausgangsdichten und verschiedenen Transfektionsreagenzien. Wir entschieden uns, die Zelle nach der Transfektion Medien ändern, um Antibiotika (die Toxizität falls vorhanden während der Transfektion führen könnten) hinzufügen. Obwohl dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen Kontamination, erhöht es Kosten für die Materialien (insbesondere Roboter Pipettenspitzen), wodurch die Notwendigkeit dieses Schrittes sollte bei der Anpassung dieses Protokoll auf andere Systeme evaluiert. Die Luciferase-Assays können mit minimalem Optimierung verwendet werden, aber vor der Durchführung dieses Assays mit hohem Durchsatz mit einem anderen Zelltyp, ob Zellen in geeigneter Weise von der Triton-Lyse-Puffer lysiert. Beachten Sie, dass Triton X-100 bewirkt Coelenterazin Autofluoreszenz. Die Renilla-Signal in unserem Test war stark genug, um diesen Effekt zu verharmlosen, aber bei der Optimierung dieses Tests für andere Zelltypen zu begrenzen Triton X-100-Mengen in die minimal Menge zur Zelllyse erforderlich.
Wir haben eine schnelle und relativ kostengünstige Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung neuer Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein unter Verwendung von Zellen, die transient mit einem Dual-Luciferase-Reporter transfiziert dargestellt. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse, Ziel und kann auch für jede Anwendung, die Hochdurchsatz-Transfektion, wie Lentiviren Produktions 23 angepasst werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Diese Arbeit wurde durch Lizenzgebühren von der Lizenzierung BacMamreagents (US Patent 5.731.182) erhalten unterstützt.
Acknowledgments
Wir danken John Darga der MGH DNA-Core für die Erstellung des DNA-Screening-Bibliothek. Christopher Chigas von Perkin Elmer unschätzbare Unterstützung für unsere Wallac 1420 Luminometer. Steven Ciacco und Martin Thomae von Agilent unterstützte die Bravo-Roboter. Wir danken Ron Johnson und Steve Titus am NIH für die großzügige Bereitstellung ihrer Dual-Luciferase-Assay-Protokoll glühen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
