Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase
Summary
Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt.
Abstract
Nous présentons un protocole de criblage à haut débit rapide et peu coûteux pour identifier des régulateurs transcriptionnels de l'alpha-synucléine, un gène associé à la maladie de Parkinson. Des cellules 293T sont transfectées de manière transitoire avec des plasmides provenant d'une banque d'expression de l'ORF parée, en même temps que les plasmides rapporteurs de luciférase, dans un format de microplaque à un gène par puits. L'activité de la luciférase de luciole est analysée après 48 heures pour déterminer les effets de chaque gène de la bibliothèque sur l'alpha-synucléine transcription, normalisée à partir d'un produit d'assemblage d'expression de contrôle interne (un promoteur hCMV diriger la luciférase de Renilla). Ce protocole est facilitée par un robot de paillasse enfermé dans une enceinte de sécurité biologique, qui exécute une manipulation de liquide aseptique en format 96 puits. Notre protocole de transfection automatisé est facilement adaptable à la production de la bibliothèque de lentiviral à haut débit ou d'autres protocoles de dépistage fonctionnels nécessitant une triple-transfections de grands nombres de plasmides de la banque uniques dans conjunction avec un ensemble commun de plasmides auxiliaires. Nous présentons également une alternative peu coûteuse et validé à disponibles dans le commerce, deux réactifs luciférase qui emploie PTC124, EDTA, et le pyrophosphate de supprimer l'activité luciférase de luciole avant la mesure de Renilla. En utilisant ces méthodes, nous avons criblé 7670 gènes humains et identifié 68 organismes de réglementation de l'alpha-synucléine. Ce protocole est facilement modifiable pour cibler d'autres gènes d'intérêt.
Introduction
La capacité à identifier des éléments régulateurs génétiques clés et les facteurs qui agissent sur eux est fondamental pour l'exploration de nombreux processus biologiques. Toutefois, l'identification des facteurs qui régulent l'expression de gènes dans des types de cellules rares, telles que les populations neuronales spécifiques, peut être difficile. Ici, nous présentons un protocole pour identifier de nouveaux régulateurs de la transcription de l'alpha-synucléine (SNCA), un gène associé à la maladie de Parkinson et exprimé dans les neurones dopaminergiques dans la substantianigra la pars compacta de la région du cerveau moyen. Nous accomplissons cela en utilisant un écran à haut débit, double-luciférase, in vitro reporter à déconstruire expression alpha-synucléine dans les cellules 293T. Le promoteur d'alpha-synucléine est d'abord clone dans un plasmide rapporteur contenant le gène de la luciférase de luciole. Un plasmide disponible dans le commerce contenant de la luciférase de Renilla sous le contrôle d'un promoteur constitutivement actif sert de contrôle interne. The constructions rapporteurs sont co-transfectés dans des cellules 293T avec les plasmides dans des microplaques à partir d'une banque d'expression d'ADN, de telle sorte que chaque puits est transfectée avec un plasmide unique de la bibliothèque. Après 48 heures, l'activité de la luciférase pour chaque rapporteur est mesurée séquentiellement en utilisant un dosage double lueur. L'expression relative de l'alpha-synucléine en réponse à chaque gène bibliothèque est déduite par le rapport de la luciole: l'activité de la luciférase de Renilla dans chaque puits (F: rapport R) après normalisation sur la base de plaque.
Ce protocole permet de cribler un grand nombre de gènes (~ 2 500 par semaine) pour leur capacité à transactiver un gène rapporteur en utilisant un minimum de personnel (1-2 personnes) et un coût minime (environ 3 $ le coût d'un réactif par essai de microplaques). Régulateurs de la transcription de gènes neuronaux (par exemple, l'alpha-synucléine), qui sont difficiles à étudier dans des cultures de neurones réfractaires à la manipulation génétique, peuvent être comparés côte à côte dans cette analyse fonctionnelle directe. Nous incluons dans notreprotocole une méthode détaillée pour le clonage et la croissance des plasmides contenant le promoteur alpha-synucléine, car nous avons constaté que les plasmides contenant cette région sont instables lorsqu'elles sont cultivées avec les procédures classiques (voir Discussion). Nous incluons également une alternative peu coûteuse à des réactifs disponibles dans le commerce à double luciférase pour tests à haut débit. Ce protocole peut être facilement adaptée pour cibler d'autres éléments de régulation d'intérêt, ou à tout processus exigeant à haut débit transfections transitoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'alpha-synucléine a été impliquée dans la maladie de Parkinson (PD) en tant que composant de corps de Lewy, des inclusions intracellulaires 4 considérés pathognomonique de cette maladie. De nombreuses études d'association pangénomiques ont lié polymorphismes de nucléotides simples dans l'alpha-synucléine à un risque accru pour sporadique PD 5,6,7. Bien que moins fréquente que PD sporadique, maladie de Parkinson familiale peut aussi être causée par des mutations dans l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions John Darga du MGH ADN de base pour la préparation de la bibliothèque de dépistage de l'ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer a fourni un soutien inestimable pour notre Wallac 1420 luminomètre. Steven Ciacco et Martin Thomae de Agilent fourni un appui pour le robot Bravo. Nous remercions Ron Johnson et Steve Titus au NIH pour offrir généreusement leur protocole de dosage de la luciférase double lueur.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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