एक घर का बना दोहरे चमक luciferase परख का उपयोग उच्च throughput कार्यात्मक स्क्रीनिंग
Summary
हम उच्च throughput रोबोट transfections और एक घर का बना दोहरे चमक luciferase परख का उपयोग transcriptional नियामकों की पहचान करने के लिए एक तेजी से और सस्ती जांच पद्धति प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल तेजी जीनों के हजारों के लिए प्रत्यक्ष पक्ष द्वारा साइड कार्यात्मक डेटा उत्पन्न करता है और ब्याज की किसी भी जीन लक्ष्य को आसानी से परिवर्तनीय है.
Abstract
हम अल्फा synuclein, पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े जीन की transcriptional नियामकों की पहचान करने के लिए एक तेजी से और सस्ती उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल उपस्थित थे. 293T कोशिकाओं transiently एक एक जीन प्रति अच्छी तरह से microplate प्रारूप में, एक साथ luciferase संवाददाता plasmids के साथ, एक arrayed ओआरएफ अभिव्यक्ति पुस्तकालय से plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. जुगनू luciferase गतिविधि एक आंतरिक नियंत्रण निर्माण (Renilla luciferase निर्देशन एक एचसीएम्वी प्रमोटर) से अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत अल्फा synuclein प्रतिलेखन, पर प्रत्येक पुस्तकालय जीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए 48 घंटे के बाद assayed है. इस प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह प्रारूप में सड़न रोकनेवाला तरल से निपटने से करता है जो एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में संलग्न एक पीठ टॉप रोबोट, से मदद की है. हमारी स्वचालित अभिकर्मक प्रोटोकॉल उच्च throughput lentiviral पुस्तकालय उत्पादन या conju में अद्वितीय पुस्तकालय plasmids के बड़ी संख्या में ट्रिपल transfections की आवश्यकता के अन्य कार्यात्मक प्रदर्शन के प्रोटोकॉल के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैसहायक plasmids के एक आम सेट के साथ nction. हम यह भी एक सस्ता और मान्य विकल्प मौजूद PTC124, EDTA, और पूर्व Renilla luciferase की माप के लिए जुगनू luciferase गतिविधि को दबाने के लिए पायरोफास्फेट रोजगार जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, दोहरी luciferase अभिकर्मकों के लिए. इन विधियों का प्रयोग, हम 7670 मानव जीन की जांच की और अल्फा synuclein के 68 नियामकों की पहचान की. इस प्रोटोकॉल हित के अन्य जीन लक्ष्य को आसानी से परिवर्तनीय है.
Introduction
प्रमुख आनुवंशिक नियामक तत्वों और उन पर कार्रवाई के कारकों की पहचान करने की क्षमता कई जैविक प्रक्रियाओं के अन्वेषण के लिए मौलिक है. हालांकि, इस तरह के विशिष्ट neuronal आबादी के रूप में दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले कारकों की पहचान करने, चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहाँ, हम अल्फा synuclein (SNCA) के उपन्यास transcriptional नियामकों की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश, पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े और substantianigra में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में व्यक्त एक जीन मध्यमस्तिष्क के कॉम्पेक्टा क्षेत्र pars. हम 293T कोशिकाओं में अल्फा synuclein अभिव्यक्ति deconstruct करने के लिए एक उच्च throughput, दोहरे luciferase, इन विट्रो संवाददाता स्क्रीन का प्रयोग करके यह पूरा. अल्फा synuclein प्रमोटर पहले जुगनू luciferase जीन से युक्त एक संवाददाता प्लाज्मिड में क्लोन है. एक अनिवार्यता से सक्रिय प्रमोटर के नियंत्रण में Renilla luciferase युक्त एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. थेसई संवाददाता निर्माणों प्रत्येक अच्छी तरह से एक भी पुस्तकालय प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है कि इस तरह, एक डीएनए अभिव्यक्ति पुस्तकालय से plasmids के साथ microplates में 293T कोशिकाओं में सह ट्रांसफ़ेक्ट हैं. 48 घंटा, हर पत्रकार के लिए luciferase गतिविधि एक दोहरे चमक परख का उपयोग क्रमिक रूप से मापा जाता है. प्लेट के आधार पर सामान्य बनाने के बाद: (नि. अनुपात एफ) प्रत्येक कुएं में Renilla luciferase गतिविधि: प्रत्येक पुस्तकालय जीन के जवाब में अल्फा synuclein के रिश्तेदार अभिव्यक्ति जुगनू के अनुपात से inferred है.
इस प्रोटोकॉल न्यूनतम जनशक्ति (1-2 लोगों) और न्यूनतम लागत (microplate परख प्रति बारे में $ 3 अभिकर्मक लागत) का उपयोग करते हुए एक पत्रकार जीन transactivate करने की क्षमता के लिए जीन की एक बड़ी संख्या (~ प्रति सप्ताह 2,500) स्क्रीन करने की क्षमता प्रदान करता है. आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए आग रोक सभ्य न्यूरॉन्स में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है जो neuronal जीन के transcriptional नियामकों (जैसे, अल्फा synuclein),, यह प्रत्यक्ष कार्यात्मक परख में पक्ष द्वारा साइड तुलना की जा सकती. हम में शामिल हमारेप्रोटोकॉल हम पारंपरिक प्रक्रियाओं (चर्चा देखने के लिए) के साथ हो गई जब इस क्षेत्र युक्त plasmids अस्थिर हो पाया क्योंकि क्लोनिंग और अल्फा synuclein प्रमोटर युक्त plasmids के विकास के लिए एक विस्तृत विधि,. हम भी उच्च throughput assays के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोहरे luciferase अभिकर्मकों के लिए एक सस्ता विकल्प शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल आसानी हित के अन्य नियामक तत्वों, या उच्च throughput क्षणिक transfections की आवश्यकता होती है किसी भी प्रक्रिया को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Protocol
Representative Results
Discussion
अल्फा synuclein Lewy निकायों 4, रोग के लिए pathognomonic माना intracellular समावेशन के एक घटक के रूप में पार्किंसंस रोग (पीडी) में शामिल किया गया है. कई जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन छिटपुट पीडी 5,6,7 के लिए बढ़ा जोखिम के साथ अल्फा synuclei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीएनए जांच पुस्तकालय की तैयारी के लिए MGH डीएनए कोर के जॉन दरगाह धन्यवाद. Perkin एल्मर के क्रिस्टोफर Chigas हमारे Wallac 1420 luminometer के लिए अमूल्य सहायता प्रदान की. स्टीवन Ciacco और Agilent के मार्टिन Thomae ब्रावो रोबोट के लिए सहायता प्रदान की. हम उदारता से उनके दोहरे चमक luciferase परख प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एनआईएच पर रॉन जॉनसन और स्टीव टाइटस धन्यवाद.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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