Summary
Vi presenterer en rask og rimelig screening metode for å identifisere transcriptional regulatorer ved hjelp av høy gjennomstrømming robot transfections og en hjemmelaget dual-glød luciferase assay. Denne protokollen produserer raskt direkte side-ved-side-funksjonelle data for tusener av gener og er lett modifiserbar å målrette en hvilken som helst gen av interesse.
Abstract
Vi presenterer en rask og rimelig high-throughput screening protokoll for å identifisere transcriptional regulatorer av alfa-synuclein, et gen assosiert med Parkinsons sykdom. 293T-celler forbigående transfektert med plasmider fra et oppstilt ORF ekspresjonsbibliotek, sammen med luciferase reporter plasmider, i en ett-gen-per-brønns mikroplateformat. Ildflue luciferase aktivitet måles etter 48 timer for å bestemme effekten av hver bibliotek-genet ved alpha-synuclein transkripsjon, normalisert til ekspresjon fra en intern kontroll konstruksjon (et HCMV promoter dirigere Renilla-luciferase). Denne protokollen er tilrettelagt av en benk-top robot vedlagt i en biosikkerhet kabinett, som utfører aseptisk væskehåndtering i 96-brønners format. Det automatiserte transfeksjon protokoll tillempes high-throughput lentiviral bibliotek eller andre funksjonelle screeningprotokoller som krever trippel-transfections av et stort antall unike bibliotek plasmider i konjugertfunksjons med et felles sett av hjelpe plasmider. Vi presenterer også en billig og validert alternativ til kommersielt tilgjengelige, dual luciferase reagenser som syssels PTC124, EDTA, og pyro å undertrykke ildflueluciferase aktivitet før måling av Renilla luciferase. Ved hjelp av disse metodene, vi screenet 7670 menneskelige gener og identifisert 68 regulatorer av alfa-synuclein. Denne protokollen er lett modifiserbar å målrette andre gener av interesse.
Introduction
Evnen til å identifisere viktige genetiske regulatoriske elementer og de faktorer som virker på dem er grunnleggende for utforskningen av en rekke biologiske prosesser. Men å identifisere faktorer som regulerer uttrykket av gener i sjeldne celletyper, som for eksempel spesifikke nevronale populasjoner, kan være utfordrende. Her presenterer vi en protokoll for å identifisere nye transcriptional regulatorer av alfa-synuclein (SNCA), et gen assosiert med Parkinsons sykdom og uttrykt i dopaminerge nevroner i substantianigra pars comp regionen i midthjernen. Vi oppnår dette ved hjelp av en høy gjennomstrømning, dual-luciferase, in vitro reporter skjermen for å dekonstruere alfa-synuclein uttrykk i 293T celler. Den alfa-synuclein promoter blir først klonet inn i en reporter plasmid som inneholder det ildflue luciferase-genet. En kommersielt tilgjengelig plasmid som inneholder Renilla-luciferase under kontroll av en konstitutivt aktiv promoter tjener som en intern kontroll. These reporter-konstruksjoner er co-transfektert inn i 293T-celler i mikroplater med plasmider fra et DNA-ekspresjonsbibliotek, slik at hver brønn er transfektert med et enkelt bibliotek-plasmidet. Etter 48 hr, luciferase-aktivitet for hver reporter blir målt i rekkefølge ved bruk av en dual-glød assay. Den relative ekspresjon av alfa-synuclein som reaksjon på hvert bibliotek genet er avledet fra forholdet av ildflue: Renilla-luciferase-aktivitet i hver brønn (F: R-forhold) etter at plate-baserte normalisering.
Denne protokollen gir mulighet til å screene et stort antall gener (~ 2500 per uke) for deres evne til å transactivate en reporter-genet ved bruk av minimal arbeidskraft (1-2 personer) og minimal kostnad (omtrent $ 3 reagens kostnad per mikroplate-analysen). Transkripsjonelle regulering av neuronal gener (for eksempel alfa-synuclein), som er vanskelige å studere i dyrkede neuroner ildfaste genetisk manipulasjon, kan sammenlignes side om side i denne direkte funksjonell analyse. Vi har i vårProtokollen en detaljert fremgangsmåte for kloning og vekst av plasmider som inneholder alfa-synuclein promoter, siden vi har funnet at plasmider som inneholder denne regionen er ustabile når dyrket med konvensjonelle fremgangsmåter (se diskusjon). Vi har også et billig alternativ til kommersielt tilgjengelige dual-luciferase reagenser for high-throughput analyser. Denne protokollen kan enkelt tilpasses til å målrette andre regulatoriske elementer av interesse, eller til en hvilken som helst prosess som krever høy gjennomstrømming forbigående transfections.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For en eksperimentell oversikt, se figur 1.
En. Forbered Reporter plasmider som inneholder alfa-synuclein Arrangøren
Regulatoriske elementer av alpha-synuclein-genet (figur 2) strekker seg over omtrent 10 kb, fra den oppstrøms NACP (non-A beta komponent av amyloid peptid) dinukleotid repetisjonssekvensen 1,2 gjennom intron 2 3. Vi viser en del av denne regionen vår reporter konstruere. Vi fant ut at plasmider som inneholder intron 2 kreves spesielle prosedyrer for vekst, som beskrevet nedenfor. Luciferase plasmider, pGL4.10 og pGL4.75 (figur 3), er kommersielt tilgjengelig fra Promega, og kan formeres ved hjelp av konvensjonell molekylærbiologi protokoller.
- Forsterke de to komponenter av alpha-synuclein promoter i separate PCRs hjelp av oppskriften i tabell 1, og primerne i tabell 2.
- Verify PCR-produkter på en agarosegel og ren ved hjelp av Qiaquick PCR Purification kit (Qiagen), eluert i 50 mL av TE (Tris-EDTA). Oppbevar det eluerte 0,9 kb fragment ved -20 ° C for fremtidig bruk.
- Fordøy hele volumet av det 3,4 kb PCR-fragmentet, så vel som 5 ug pGL4.10, med Saci og XhoI. Unn vektoren med Calf Tarm alkalisk fosfatase (Roche) og gel rense bruke PureLink Hurtig Gel Extraction kit (Invitrogen).
- Ligate fragment og vektor ved hjelp av T4 DNA ligase (NEB). Rengjør fullført reaksjon ved bruk av PureLink PCR Micro kit (Invitrogen), eluert i 10 mL TE buffer.
- Transform 2 mL av renset, ringsreaksjonen i 20 mL av Electromax Stbl4 kompetente celler (Invitrogen) og electroporate i henhold til produsentens instruksjoner. Rist i en 30 ° C inkubator ved 225 rpm i 90 min. Spre 2 volumer på LB-plater inneholdende 100 mg / ml ampicillin og inkuber ved 30 ° C i 2 dager.
- Ved hjelp av en tannpirker, velg 4-6 små kolonier for vaksinasjon i 2 ml av TB (Terrific buljong). Dyrke disse Miniprep kulturer i en 30 ° C shaker O / N.
- Rense plasmid-DNA fra 1,5 ml av hver minipreparering i kultur ved hjelp av PureLink HiPure Plasmid Miniprep-sett (Invitrogen).
- Fordøye minipreps med BamHI og electrophorese på en agarosegel. Den korrekte klone skal produsere fragmenter av 2,8 kb og 4,9 kb.
- Restreak den gjenværende minipreparering i kultur fra korrekt klon på en fersk LB (Luria Broth) plate og vokser ved 30 ° C i 2 dager.
- Velg en liten koloni og vaksinere en 1,5 ml TB startkultur. Rist O / N ved 30 ° C. Ikke la startkultur vokse til metning.
- Spe hele startkultur i 150 ml forvarmet TB og rist ved 30 ° C i 2 dager. Før du går videre til neste trinn, bruker 1,5 ml av denne kulturen for en ekstra miniprep og fordøyelsen å bekrefte at klonen ikke mutere under replicati på.
- Rense plasmid-DNA fra de gjenværende kultur ved hjelp av PureLink HiPure Plasmid Maxiprep sett (Invitrogen). Forventede utbytter av dette mellom plasmid er 50 til 150 pg pr 150 ml kultur.
- Tine 0,9 kb fragment frosset i trinn 1.2. Gjenta trinn 01.03 til 01.12 for å klone 0,9 kb fragment inn i mellom plasmid, bearbeider i stedet med KpnI og Saci. Ligate, transform, velge og vokse for maxipreps som ovenfor. Fordøyelse med BamHI bør gi fragmenter på 5,8 kb og 2,8 kb. Dette plasmidet som skal brukes for skjermen.
To. Forbered 293T Cells, Reporter Plasmider og Bibliotek DNA for Screening
293T celler er første seedet inn 96-brønners plater og tilført den påfølgende dagen. Rapportør plasmider og bibliotek DNA'er blir fortynnet i 96-brønners plater. Vi innhentet plater av transfeksjon-grade bibliotek DNA fra DNA Kjerne ved Massachusetts General Hospital (få = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Denne protokollen transfects et enkelt bibliotek platen i to identiske plater av 293T-celler (figur 1), bør således to plater av cellene utsådd for hvert bibliotek plate som skal siktes.
Merk: Grow celler i media uten fenol rød eller antibiotika, da disse forstyrre luciferase analyser og øke toksisitet under transfeksjon, henholdsvis.
- For hvert bibliotek plate som skal siktes, resuspender trypsinisert 293T-celler til en konsentrasjon på 1,5 x 10 5 celler / ml i DMEM inneholdende 14% FBS. Hell over i et sterilt reservoar (Axygen).
- Plasser beholderen, to flatebunnet, 96-brønners plater (Corning), og en boks av filterpipettespisser (Agilent) på roboten dekk. Tilsett 100 ul celler til hver brønn i begge plater, for en densitet på 1,5 x 10 4 celler pr brønn.
- Sentrifuger celleplatene ved 50 x g i 2 min, ved hjelp av lav rampehastigheter for å sikre likecelletettheten gjennom hver brønn. Inkuber ved 37 ° C og 10% CO 2 O / N.
- Fortynne ildflue og Renilla reporter plasmider til 5 ng / mL i serumfrie medier. Kombiner de fortynninger i et forhold på 5:03 ildflue til Renilla plasmid (etter volum) i et 15 ml konisk rør.
- Pipetter de kombinerte plasmider inn i hver brønn av en 96-brønns plate, dispensering 17 mL per bibliotek plate, pluss 2 til 10 pl overskytende, i hver brønn.
- Skaff transfeksjon-grade DNA bibliotek plater som ovenfor og fortynne til 13,3 ng / mL med endotoksin-fritt vann. Minste volum per brønn bør være 28 mL.
Tre. Utfør transfections
På dag to av skjermen, er reporter plasmider og bibliotek DNAS transfektert inn 293T celler.
- For hvert bibliotek plate, bland 107,5 mL av RT Optifect (Invitrogen) med 4,3 ml serum-frie medier (1:40 fortynning) i et polystyren tube. Inkuber i 5 min ved RT, og denn dispensere 44 mL (per bibliotek plate) i hver brønn av en 96-vel, polystyren V-bunn plate (Greiner).
- Sett platen av fortynnet Optifect, reporter plasmider (Trinn 2,5), bibliotek DNAS (Trinn 2.6), og en boks med pipette tips om roboten dekk.
- Aspirer 17 mL av reporter plasmider, 43 mL fortynnet Optifect, og 26 mL av bibliotek DNA, sette inn en 5 mL luftspalte mellom hver aspirasjon. Biblioteket DNA bør aspirert siste for å unngå kryss-smitte. Tilsett innholdet i spissene i en ny polystyren V-bunnet plate, blandes, deksel, og satt til side i 20 min for å tillate lipid / DNA-komplekser for å danne. Hvis transfeksjon flere bibliotek plater, erstatte pipettespisser og bibliotek plate, og gjenta.
- Avdekk Optifect / DNA blanding plate og legg den på roboten dekk med to plater av 293T celler. Ved hjelp av en enkelt boks av pipettespisser, aspirer 80 mL av Optifect: DNA blandingen og sakte dispensere 40 mL på hver plate av celler. Hvis transfecting flere bibliotek plater, gjenta for alle Optifect: DNA-plater. Dekk-celler.
- Sentrifuger celleplatene ved 1200 xg i 30 min. Dekk til og gå tilbake til inkubatoren.
- Inkuber cellene for 4-6 hr. I løpet av denne inkubasjonen forberede friskt media ved å blande 12 ml DMEM inneholdende 10% FBS og 10 ug / ml ciprofloxacin (Cellgro) for hver transfektert bibliotek plate. Hell friskt media inn i et sterilt reservoar.
- Plasser to bokser av robot tips, en enkelt plate av celler, i reservoaret inneholdende friskt medium, og et avfallsreservoar på roboten dekk. Aspirer 100 mL av mediet fra cellene og dispensere inn i avfallsreservoaret delvis fylt med 70% etanol. Ved hjelp av ferske tips, aspirer 100 mL av friske media og sakte dispensere på cellene. Gjenta for alle plater av celler.
- Retur platene til inkubatoren i 48 timer.
4. Utfør Dual-luciferase Analyser
På dag fire av skjermen,Firefly og Renilla luciferase analysene er utført.
Merk: dual-luciferase assay krever sekvensiell tilsetning av 2 assay-buffere, 3X ildflue analysebuffer og 3X Renilla assay-buffer, som beskrevet i Tabell 3 Firefly og Renilla luciferases ikke skilles ut, og dermed celler må lysert før måling av luciferase-aktivitet. . Firefly analysebuffer lyserer celler og gir substrat for ildflueluciferase; Renilla analysebuffer slukker ildflue signal og gir substrat for Renilla luciferase.
- For hvert bibliotek plate, forberede 8 ml 3X ildflue analysebuffer fra stamløsninger, som beskrevet i tabell 3, og dispenser 82 ul i hver brønn av en 96-brønners V-bunnet plate.
- For hvert bibliotek plate, også forberede 12 ml 3X Renilla analysebuffer og dispenser 122 ul i hver brønn av en 96-brønners V-bunnet plate. Sett til side bådeFirefly og Renilla analyse buffere.
- Plasser en boks av pipettespisser, et avfallsreservoar, og 2 plater av celler (transfektert fra det samme bibliotek plate) på roboten dekk.
- Aspirer 60 mL av mediet fra hver plate og kastes i avfallsreservoaret delvis fylt med 70% etanol. Gerikter og sett til side. Hvis transfeksjon flere bibliotek plater, gjenta for alle sett av plater.
- Plasser to bokser av pipettespisser, plate av 3X ildflue analysebuffer, og et sett av celleplatene på roboten dekk.
- Aspirer 40 mL av 3X ildflue analysebuffer og legge den til i første plate av celler, blande grundig. Bytte til nye pipettespisser, gjenta for den andre cellen plate. Plasser celler ved RT i 10 min for å fullføre lyse. Hvis transfeksjon flere bibliotek plater, erstatte esker med tips og celleplatene, og gjenta.
- Record luminescens fra hver brønn av hver celleplate på et luminometer, opptak i 1 sek per brønn. Retur platene til robotendekk.
- Plasser to bokser av pipettespisser, plate av 3X Renilla analysebuffer, og et sett av celleplatene på roboten dekk.
- Aspirer 60 mL av 3X Renilla analysebuffer, og legge den til den første platen av celler, blande grundig. Bytte til en ny boks av pipettespisser, gjenta for den andre cellen plate. Hvis transfeksjon flere bibliotek plater, gjenta for alle sett av celleplatene.
- Record luminescens fra alle platene på en luminometer, innspilling hver brønn for 1 sek som ovenfor. Kast plater.
5. Data Analysis
- Beregn Firefly: Renilla luminescens ratio ("F: R ratio") for hver brønn ved å dele tellinger av Firefly signal av grevene av Renilla signal.
- Beregn induksjonsverdi ved å dividere F: R-forhold på hver brønn av den gjennomsnittlige F: R-forhold til platen, med unntak av den høyeste og laveste 25% av brønnene.
- Gjennomsnittlig induksjons verdier på tvers gjentakfor en enkelt transfektert bibliotek plate. Gener som induserer eller repressing alfa-synuclein mer enn tre-folder regnes som "treff" på denne skjermen og er gjenstand for ytterligere validering og sekundære skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske luciferase-verdier, F: R-forhold og induksjonsverdier for en enkelt halvplate er vist i figur 4. Merk at treffet i brønn H2, 32-fold inducer.. Gener som forårsaker overdreven toksisitet (for eksempel vel E3), eller i brønner som var dårlig transfekterte, vil gi lave verdier for både ildflue-og Renilla luciferases, men en gjennomsnittsinduksjonsverdi. Gener som forårsaker ikke-spesifikk induksjon av luciferase aktivitet, kanskje via interaksjon med pGL4 ryggrad, vil indusere ildflue og Renilla luciferases likt, noe som resulterer i en gjennomsnittlig induksjon verdi. Store avvik i induksjons verdier mellom replikater bør heve mistanke for utførelsesfeil. Det er viktig å kontrollere at skjermen er utført i det lineære området av rapportør assays slik at kloner som forårsaker økt ekspresjon vil bli målt som økt luciferase-aktivitet. Vi transfektert økende mengde av hver reporter-genet for å validere linearitetav reporteren assay i henhold til våre forsøksbetingelser (Figur 5). Det er også viktig å utføre assays umiddelbart etter inkubering trinn for å unngå ikke-linearitet på grunn av substrat uttømming. Vi har observert signifikant ildflue luciferase-aktivitet opp til en time etter tilsetning av reagenser (figur 6).
Figur 1. Experimental oversikt. Hver enkelt plate av bibliotek-DNA blir kombinert med 2 reporter-konstruksjoner, og anvendt for å transfektere duplikate plater av celler. Etter 48 timer, blir aktiviteten til hver luciferase reporter målt sekvensielt. Den spesifikke induksjon av SNCA promotor plasmidet fra hver bibliotek-plasmidet blir beregnet ved forholdet av ildflue til Renilla-luciferase etter plate-baserte normalization.
Figur 2. Skjematisk av 5 'regionen av alfa-synuclein (SNCA), som ligger på kromosom 4, brukes i Firefly reporter plasmid. Primer navn tilsvarer sekvenser i tabell 2. Hatch merkene indikerer en ca 8 kb segment eliminert fra figuren , ellers til å skalere. ATG start-kodonet for SNCA er lokalisert i exon 3..
Figur 3. Luciferase reporter plasmider som brukes i denne screening-protokollen. De SNCA genomiske regioner blir klonet inn i det multiple kloningssete av pGL4.10 umiddelbart oppstrøms for ildflueluciferase. Et plasmid med HCMV-IE1 (human cytomegalovirus immediate early 1) promoter dirigere ekspresjon av Renilla-luciferase ble anvendt som en intern kontroll. Begge plasmider er kommersielt tilgjengelig fra Promega.
Figur 4 Representative resultater for halvparten av en enkelt 96-brønners plate.. A. Rå ildflueluciferase teller B. Raw Renilla luciferase teller C. F:.. R forhold beregnet ved å dele verdien i A med verdien i B. D. Induksjons verdier for hver brønn, beregnet ved å dele hver F: R ratio ved den gjennomsnittlige F:. R-forhold til platen, med unntak av den øverste og nederste 25% av brønnene E. Grafisk representasjon av induksjons verdier for en enkelt plate, med godt H2, en positiv hit, uthevet. Hit H2 er en neuronal transkripsjonsfaktor som ikke tidligere er forbundet med SNCA uttrykk. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Linearitet assays. Celler ble transfektert med økende mengder av ildflue-og Renilla luciferase plasmider under kontroll av den sterke HCMV-IE1 promotoren og analysert med protokollen ovenfor. (Total mengde DNA transfektert ble holdt konstant ved bruk av en nøytral balanseblokk plasmid). A. Firefly linearitet assay. Merk at firefly Aktiviteten er fortsatt lineær gjennom et bredt spekter av verdier. B. Renilla linearitet analyse. Legg merke til utflating av kurven over 15 ng / godt.
.. Figur 6 Tid løpet av forråtnelse signal for ildflue luciferase assay luciferase reagenser ble tilsatt til en enkelt plate transfektert med en CMV-luciferase konstruere ved tid 0; serie-målinger ble gjort uten tilsetning av ytterligere reagenser.
| Komponent | Volume | Endelig konsentrasjon |
| BAC 2002-D6 på 5 ng / mL | 4 mL | - |
| 5X Phusion GC Buffer | 20 mL | 1X |
| DMSO | 6 mL | 6% |
| dNTPs (10 mm) | 2 mL | 200 uM |
| Forward Primer (100 mm) | 1 mL | 10 mikrometer |
| Reverse Primer (100 mm) | 1 mL | 10 mikrometer |
| DDH 2 O | 65 mL | - |
| Phusion DNA Polymerase | 1 mL | - |
| Totalt: 100 mL |
Tabell 1. PCR-oppsett for å forsterke alfa-synuclein promoter.
| Navn | Sequence | Begrensning Side |
| SNCA7 | 5'-gtc ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI |
| SNCA8 | 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | Saci |
| SNCA1 | 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | Saci |
| SNCA2 | 5'-tag ctcgag ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI |
.. Tabell 2 Grunning for å forsterke alfa-synuclein arrangøren The NACP Gjenta amplicon skal produsere en 0,9 kb fragment; den andre fragment lengde er 3,4 kb. For primer steder, se Figur 2.
| A: 3X Firefly Assay Buffer | ||
| Aksje Solutions (oppbevares ved -80 ° C) | Volum per 100 ml 3X Firefly Assay Buffer | Endelig konsentrasjon (3X) |
| 500 mM DTT | 3,0 ml | 15 mM |
| 10 mM koenzym A | 6,0 ml | 0,6 mM |
| 100 mM ATP | 0,45 ml | 0,45 mM |
| 80 mg / mlluciferin | 0,525 ml </ Td> | 4,2 mg / ml |
| Triton lysis buffer | 90,025 ml | - |
| B. Triton Lysis Buffer | ||
| Komponent (butikk på RT) | Volum per 100 ml Triton Lysis Buffer | Endelig konsentrasjon |
| Tris-HCl-pulver | 1,705 g | 0,1082 M |
| Tris-basen pulver | 0.508 g | 0,0419 M |
| 5 M NaCl | 1,50 ml | 75 mM |
| 1 M MgCl 2 | 0,30 ml | 3 mm |
| Triton X-100 ren flytende | 0,75 ml | 0,25% |
| Vann | til 100 ml totalvolum | - |
| C. 3X Renilla Assay Buffer | ||
| Volum per ~ 100 ml 3X Renilla Assay Buffer | Endelig konsentrasjon (3X) | |
| 10 mM PTC124 i DMSO | 0,6 ml | 0,06 mm |
| 2 mm H-ctz i etanol | 0,5 ml | 0,01 mm |
| Renilla Salts | 100 ml | - |
| D. Renilla Salts | ||
| Komponent (butikk på RT) | Volum per 100 ml Renilla Salts | Endelig konsentrasjon |
| 0,5 M Na 2 EDTA | 9,0 ml | 45 mM |
| Na Pyrophosphate | 1,34 g | 30 mM |
| NaCl | 8,33 g | 1.425 M |
| Vann til 100 ml totalvolum | - | |
Tabell 3. Lager løsninger og analyse buffere for ildflue og Renilla luciferase analyser. A. 3X ildflue analysebuffer oppskrift. DTT, dithiothreitol. Dersom ikke er angitt, alle komponenter er oppløselige i vann. B. Triton lysebuffer oppskrift. C. 3X Renilla analysebuffer oppskrift. h-CTZ, h-coelenterazine. Gjør 2 mm H-CTZ ved å legge til 10 mg h-CTZ til 12,2 ml 100% EtOH og 120 mL konsentrert HCl. PTC124 er løselig i DMSO. D. Renilla salter oppskrift. Triton lysebuffer og Renilla salter er stabile i flere uker ved 4 ° C og RT, respektivt. 3X ildflue analysebuffer og 3X Renilla analysebuffer bør blandes i løpet av 3-4 timer for å utføre den luciferase-assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alpha-synuclein har vært innblandet i Parkinsons sykdom (PD) som en komponent av Lewy-legemer 4, intracellulære slutninger anses karakteristisk for sykdommen for sykdommen. Tallrike genome-wide forening studier har knyttet single nukleotid polymorfismer i alpha-synuclein med økt risiko for sporadisk PD 5,6,7. Selv om mindre vanlig enn sporadiske PD, kan familiær PD også bli forårsaket av mutasjoner i alfa-synuclein 8, så vel som kopiering og triplication av alfa-synuclein locus 9,10,11, et fenomen også sett i sporadisk PD 12.. Samlet utgjør disse studiene forsterke den sentrale alfa-synuclein til patogenesen av PD. Målet med denne skjerm var å identifisere gener som regulerer alfa-synuclein og kan derfor spille en rolle i patogenesen av Parkinsons sykdom. Ved hjelp av denne protokollen, vi screenet 7670 menneskelige gener og identifisert 154 foreløpige treff (minst tre ganger indusere), som representerer 140unike gener. Disse hits var gjenstand for sekundære analyser ved hjelp av nye DNA-forberedelser for å avgjøre hit reproduserbarhet. Treff i tre-fold range gjengitt i 28% av påfølgende luciferase analyser. Reproduserbarhet økt til 59%, 69% og 78% i 4 -, 5 -, og 5-fold induktorer, hhv. Treff med induksjoner over 7 ganger gjengitt 100% av tiden. Vi til slutt identifisert 68 nye regulatorer av alfa-synuclein transkripsjon.
Flere linjer av bevis tyder på at de 68 treff vi oppnådd er reelle regulatorer av alfa-synuclein. Vår liste over identifiserte hits inkluderer GATA3, et medlem av GATA familien av transkripsjonsfaktorer som tidligere vist å regulere SNCA uttrykk tre. Scoring en av de få kjente SNCA regulatorer gir stor tillit til påliteligheten av vår skjermen. I tillegg har vi uavhengig scoret som treffer flere medlemmer av den samme familien av nevrale transkripsjonsfaktorer, noe som tyder på at skjermen er reproduserbare og ikke identifisere genertilfeldig. Viktigst, i flere oppfølgingstest, evne til vårt topp treffer å regulere endogent SNCA uttrykk i nervecellene ble validert i overekspresjon og knockdown analyser. Vi overexpressed noen av toppen treffer bruker BacMamvectors 3 i SY5Y dopaminerge celler og var i stand til å øke endogene SNCA nivåer 2-8 ganger, mens shRNA knockdown av disse treff resultert i redusert SNCA mRNA nivåer. Disse studiene endelig vise at våre øverste treff er regulatorer av endogene SNCA nivåer og er ikke bare gjenstander av dekonstruert luciferase system. Andre oppfølgingsstudier for andre treff vil være nødvendig for å fastslå den sanne falske positive og falske negative priser for den fullstendige listen over treff i vår skjerm. En fullstendig beskrivelse av hits og deres forhold til Parkinsons sykdom er under utarbeidelse 14.
Det er viktig å vurdere begrensningene i vår screening metodikk. Det bør obvIOUs at skjermen ikke ville identifisere noen regulator ikke presentere i screening-biblioteket. Mens vår screening av bibliotek var betydelig, inneholdende omtrent en fjerdedel av det humane genom, det var ikke fullstendig. Gitt enkelheten av analysen vår, kunne flere biblioteker bli screenet med letthet. Vi økte antall gener vist på en målrettet måte ved å inkludere paralogs av treff, når det er tilgjengelig, i våre sekundære analyser. Vi også ville ikke score noen hit som bundet til genomiske regioner utenom de som er inkludert i vår reporter konstruere. For å maksimere sjansen for herunder riktig region, vår reporter inneholdt de umiddelbare flankerer sekvenser for flere transkripsjonsstartstedene i SNCA promoter. Det er sannsynlig at flere faktorer binde seg til områder langt utenfor den umiddelbare promoter regionen for å regulere SNCA uttrykk. Dette kunne påvises ved å utføre skjermer med ytterligere oppstrøms og nedstrøms områder, hvis ønskelig, selv om bare ~ 10 kb av gangen kan være enssessed på denne måte på grunn av begrensninger på effektiv kloning i plasmidvektorer og stabiliteten av de med høyt kopitall pGL4 vektorer. Alternativt kunne luciferase konstruere ettermonteres i BAC DNA'er inneholder SNCA locus. En av ulempene med sistnevnte tilnærming er at transfeksjon av BACS selv under ideelle forhold er> 100 ganger mindre effektiv da plasmider 15. En annen tilnærming ville være å "knock-in" luciferase reporter i den endogene SNCA locus, en metode som er langt mer arbeidskrevende da vår tilnærming. Vi ville heller ikke scorer noen hit som allerede er uttrykt i mette nivåer, slik at overekspresjon ikke resulterer i økt luciferase aktivitet. Av denne grunn valgte vi å ansette ikke-nevronale 293T celler, som kanskje mangler nevrale faktorer som regulerer SNCA, og faktisk vi scorer en rekke nevrale transkripsjonsfaktorer. En potensiell ulempe av 293T celler, er imidlertid at vi ikke kan score noen genet som en hit hvis det kreves enNDRE nevronale faktorer for å fungere skikkelig. Dermed, som alle skjermer, kan vår studie glipp av en rekke potensielle SNCA regulatorer. Men i praksis, de 68 treff vi fått økt antall kjente regulatorer av SNCA med mer enn 10 ganger og vil kreve mange års arbeid for å følge opp, så flere treff kanskje ikke være nødvendig i vårt tilfelle.
Det er også viktig å realisere de potensielle gjenstander som kan oppstå ved bruk av denne metoden. I kjemiske skjermer, er luciferase beryktet for artifactually scorings forbindelser ved stabilisering av luciferase protein snarere enn ved induksjon av transkripsjon. For å utelukke protein stabiliserings gjenstander, vi skjermet våre treff mot flere andre promoter-luciferase konstruerer og fant ikke noen treff som syntes å handle etter transcriptionally ved å heve uttrykk fra konstitutive arrangører. En annen potensiell gjenstand kan være en transactivating faktor som binder seg til pGL4 vektorryggraden i stedetden SNCA arrangøren. Vi benyttet den pGL4 vektor som har blitt grundig mutagenisert å fjerne transkripsjonsfaktor bindingssteder for å unngå dette problemet. For å vurdere om noen av våre hits kreves vektoren ryggrad for induksjon, brukte vi PCR for å forsterke SNCA-luciferase vektor regionen blottet for ryggrad og brukte denne lineære fragment som reporter for sekundære analyser. Vi fant ingen signifikant forskjell i induksjons verdier mellom vår komplett plasmid reporter og den lineære ryggrad-fri konstruksjon med ett unntak. GATA2 viste ~ 15 ganger induksjon med plasmidet reporter, men bare ~ 2,7 ganger med den lineære reporter, noe som tyder på at en del av GATA2 induksjon kan være grunn til å binde seg til ryggraden komponenter.
En rekke andre metoder for å identifisere transkripsjons-regulatorer har blitt beskrevet. Nesten 30 år siden, ble kartlegging av cis virkende transcriptional kontrollelementer i sterke viral arrangører via transfektert reporter genuttrykk established 16. Denne metoden, noen ganger betegnet "promoter knusing," har falt ut av tjeneste for kartlegging av celle-typespesifikke promotorer, siden det er vanskelig å få tak i og transfektere egnede primære cellelinjer, og disse linjer kan ikke nøyaktig representerer deres vev opprinnelse. Gjæren ett-hybrid system 17 omgår dette problemet ved å gi en dekonstruert reporter system for å oppdage interaksjoner mellom et bibliotek av fusjonsgener og en bestemt cis virkende element. Vår fremgangsmåte er lik den gjær en-hybrid systemet i sin deconstructed utforming, men i systemet benytter vi vanlige ekspresjonssystemer kloner fremfor gene fusions, vi anvende pattedyrceller i stedet for gjær, og vi benytter robotikk som tillater side-ved-side-kvantitativ funksjonelle avlesninger for hver test-genet. En lovende metode kalt proteomikk av isolerte kromatin segmenter (Pich) som gjør identifisering av proteiner bundet til bestemte genom regioner har blitt beskrevet 18, men har ikke ennåblitt brukt til løssalgs menneskelige gener. Genome-wide kromatin immunoprecipitation (chip-seq og chip-chip) studier har blitt brukt til å identifisere cis-fungerende regioner i stor skala 19. Denne metoden er potensielt kraftig, men som Pich, kan være mindre nyttig for celletyper som for eksempel spesifikke neuronale populasjoner som ikke lett oppnås i homogen kultur. Dessuten, når vi har sjekket chip databaser for våre validerte hits, de har ikke vist binding av disse treff til SNCA arrangøren. Grunnen til dette er ikke klart, siden vi har vært i stand til å demonstrere binding av disse faktorene til SNCA promoter ved konvensjonell chip 14; men det kan være på grunn av mangel av hele SNCA promoter-regionen blir anvendt i Chip-studier med mikromatriser avlesninger (ChIP-chip). Pich Chip-seq, og andre proteomikk tilnærminger kan derfor være mest nyttig når koblet til de direkte funksjonelle leselig at vår metode genererer.
Dual-luciferaseanalyser ansette ildflue og Renilla luciferases tilby en følsom metode for å studere en rekke intracellulære prosesser i høy gjennomstrømming format 20. Sammensmeltingen av en target-promoteren til ildflue luciferase er blitt brukt til å studere den transkripsjonelle regulering og promotorstruktur av flere mål in vitro, inkludert alfa-synuclein 1,2. Vi har utviklet et billig alternativ til vanlige dobbelt-luciferase reagenser som følger robust signal og var lineære i området fra vår analyse (figur 6). Vår fremgangsmåte er tilpasset fra en protokoll generøst gitt av Ron Johnson på NIH og en tidligere beskrevet ikke-kommersiell dual-luciferase assay 21.. Den ildflue analysebuffer lyserer celler og gir ATP og luciferin, substratet for ildflue luciferase. Denne analysen gir en gløde reaksjon med en halveringstid på ca 1 time (figur 7). Den Renilla analysebuffer slukker firefly signal og gir passende substrat (coelenterazine). Legg merke til at Renilla analysebuffer i seg selv ikke vil lysere cellene, og må anvendes i kombinasjon med enten Triton lyseringsbuffer eller ildflue analysebuffer. Vi har funnet at tidligere beskrevne Renilla analysebuffere lett utfelles ved RT, og dermed vi eliminert natriumsulfat og redusert mengden av natrium-pyrofosfat med 60%. Vår analyse inkluderer også PTC124, en potent inhibitor av ildflue luciferase 22 som bidrar ytterligere bråkjøling i analysen. Quenching aktivitet er også gitt av EDTA, NaCl, og pyrofosfat i Renilla buffer. Med disse nye formuleringer, er omtrent 99,5% av ildflue-aktivitet ble stoppet ved å Renilla buffer. Intensiteten og reproduserbarheten både ildflue luciferase og Renilla signalene ble noe forbedret ved blanding etter tilsetning av bufferne (trinn 4.6 og 4.10).
I vår erfaring, komplett etlpha-synuclein promoter i pGL4.10 er unikt vanskelig å forsterke og klone, kanskje på grunn av GC-rike regioner og kompleks sekundær struktur i intron 2. Vi var mest vellykket med STBL4 kompetente celler, som er optimalisert for kloning av ustabile inserts. Selv følger disse forholdsreglene, vi ofte utvinnes en mutant som E. coli genomisk DNA ble satt inn i 3'-enden av konstruksjonen. Dette mutant skaper bånd på ca 5,8 kb og 4 kb når fordøyd med BamHI (versus 5,8 kb og 2,8 kb i riktig klone) og fremstår som større kolonier på selektive plater. Nøye vekst av kompetente celler ved 30 ° C og forebygge kulturer fra å nå metnings synker, men ikke eliminere, er sannsynligheten for å utvinne mutanten. Det anbefales å kontrollere renheten av alle DNA-preparater med restriksjons digest og gel-elektroforese før transfeksjon.
Denne screeningprotokollen er lett tilpasses andre promotorer, etd må optimaliseres tilsvarende, ved hjelp av til positive og negative kontroller gener som allerede er kjent for å regulere target-promotoren. Flere betraktninger gjelder for kloning og transfeksjon av rapportør plasmider. Ved kloning målet promoter inn i ildflue luciferase reporter plasmid, må startstedet luciferase tilnærmet den translasjonelle start-stedet i målgenet. Dual-luciferase skjermer vanligvis plassere Renilla plasmid under kontroll av en minimal promoter, slik som HSV-tk-promoteren, for å minimalisere virkningene av plasmid ryggrad. Men vi fant ut at en av våre positive kontroller indusert denne arrangøren, og dermed har vi valgt CMV arrangøren. Den relative mengden av hver reporter plasmid bør bestemmes empirisk og er påvirket av den konstitutive aktivitet av hver promoter. Ideell baseline (transfektert, men uninduced) luciferase teller bør være minst fem til ti ganger i løpet bakgrunn fra untransfected celler, slik at påvisning av library gener som undertrykker eller at årsaken toksisitet, noe som vil resultere i lavere signal. Før screening bekrefte at forventet luciferase teller faller innenfor det lineære området av hver analyse, som kan variere mellom luminometers. (Legg merke til at vår Renilla teller typisk faller på den øvre enden av det lineære område i vår analyse.) Vi har funnet at økning av forholdet mellom bibliotek DNA til ildflue reporter plasmid resulterte i høyere induksjoner, og dermed vi brukte den minimale mengde av denne reporter.
Den transfeksjon protokollen må optimaliseres i tillegg. Vi valgte 293T-celler for deres relative letthet for transfeksjon, effektiviteten som økte 50 ganger, med tillegg av et sentrifugeringstrinn (trinn 3.5). Den dopaminerge linje SY5Y er over 100 ganger mindre transfectable i våre hender, og, som beskrevet ovenfor, er ikke optimal for å utføre overekspresjon screening. Vår optimale analyse tid ble empirisk bestemt til å være 48 timer, således cellene ble sådd ut ved en lav initial densitet, Nødvendiggjør bruken av Optifect, som er utformet til å transfektere celler med 10-70% konfluens. Andre cellelinjer kan kreve forskjellige starttetthet og forskjellige transfeksjon reagenser. Vi valgte å endre celle media etter transfeksjon å legge antibiotika (som kan forårsake forgiftning hvis stede under transfeksjon). Selv om dette reduserer sannsynligheten for bakteriell forurensning, det øker kostnaden i materialer (spesielt robot pipette tips), og dermed nødvendigheten av dette trinnet bør vurderes når man tilpasser denne protokollen til andre systemer. Luciferase assay kan anvendes med minimale optimalisering, men før denne analysen i high-throughput med en annen celletype, bekrefte at cellene er hensiktsmessig lysert med Triton lysis buffer. Merk at Triton X-100 forårsaker coelenterazine autofluorescence. Den Renilla signal i vår analyse var sterk nok til å bagatell denne effekt, men når optimalisere denne analysen for andre celletyper, begrenser Triton X-100 volumer til minimal beløpet som kreves for cellelyse.
Vi har presentert en hurtig og relativt billig metode for screening identifisere nye transkripsjonelle regulering av alpha-synuclein ved hjelp av celler forbigående transfektert med en dual-luciferase reporter-system. Denne protokollen er lett modifiserbar å målrette andre gener av interesse og kan også være tilrettelagt for alle applikasjoner som krever høy gjennomstrømming transfections, for eksempel lentivirus produksjon 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av royalties innhentet av konsesjons BacMamreagents (US Patent 5,731,182).
Acknowledgments
Vi takker John Darga av MGH DNA Kjerne for utarbeidelse av DNA screening biblioteket. Christopher Chigas av Perkin Elmer gitt uvurderlig støtte for vårt Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco og Martin Thomae av Agilent gitt støtte til Bravo robot. Vi takker Ron Johnson og Steve Titus på NIH for sjenerøst å gi sin dual-glød luciferase assay protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
