Summary
Мы представляем быстрый и недорогой метод скрининга для выявления транскрипционных регуляторов с использованием высокой пропускной роботов трансфекций и самодельный двойного свечения люциферазы. Этот протокол быстро генерирует прямые бок о бок функциональные данные для тысяч генов и легко изменяемый целевой любой интерес ген.
Abstract
Мы представляем быстрый и недорогой протокол высокопроизводительного скрининга для выявления транскрипционные регуляторы альфа-синуклеина, гена, связанного с болезнью Паркинсона. Клетки 293Т временно трансфицировали плазмидами, из упорядоченной библиотекой экспрессии ORF, вместе с репортера люциферазы плазмиды, в формате один ген-на-луночный микропланшет. Активность люциферазы Firefly анализируют после 48 часов, чтобы определить влияние каждого гена библиотеки на альфа-синуклеина транскрипции, нормированной к выражению из конструкции внутреннего контроля (промоутер ЦМВ направляя Renilla люциферазу). Этот протокол облегчается помощью настольного робота, заключенный в шкафу биобезопасности, который выполняет асептической обработки жидкого в формате 96-а. Наш автоматизированный протокол трансфекции легко адаптируется к высокой пропускной производства библиотеки лентивирусный или других функциональных протоколов скрининга, требующих тройных трансфекций большого числа уникальных библиотечных плазмид в сопряnction с общим набором вспомогательных плазмид. Мы также представляем недорогой и проверенную альтернативу коммерчески доступные, двойные люциферазы реагентов в которой работает PTC124, ЭДТА, и пирофосфат для подавления светлячка активность люциферазы перед измерением Renilla люциферазы. Используя эти методы, мы провели скрининг 7670 генов человека и определили 68 регуляторов альфа-синуклеина. Этот протокол можно легко модифицировать в отношении других представляющих интерес генов.
Introduction
Способность идентифицировать ключевые генетические регуляторные элементы и факторы, которые действуют на них имеет основополагающее значение для изучения многочисленных биологических процессов. Тем не менее, выявление факторов, которые регулируют экспрессию генов в редких типов клеток, таких как конкретных нейронных популяций, может оказаться непростой задачей. Здесь мы приводим протокол для выявления новых регуляторов транскрипции альфа-синуклеина (SNCA), ген, связанный с болезнью Паркинсона и выражается в дофаминергических нейронов в substantianigra Парс компакты область среднего мозга. Мы добиваемся этого с помощью высокой пропускной двойного люциферазы, в пробирке репортер экран деконструировать выражение альфа-синуклеина в клетках 293Т. Альфа-синуклеина промотор сначала клонировали в репортерной плазмидой, содержащей ген люциферазы светлячка. Коммерчески доступный плазмиду, содержащую люциферазы Renilla под контролем постоянно активной промотора служит в качестве внутреннего контроля. Фесе репортер конструкции котрансфицируют в клетках 293Т в микропланшетах с плазмидами с библиотекой экспрессии ДНК, так, что каждый хорошо трансфицируют с одной плазмидной библиотеки. Через 48 ч активность люциферазы для каждого репортера измеряется последовательно с использованием двойного свечения анализа. Относительную экспрессию альфа-синуклеина в ответ на каждый библиотеки генов выводится на отношение светлячка: активности люциферазы Renilla в каждой лунке (F: отношение R) после пластины на основе нормализации.
Этот протокол обеспечивает возможность экранировать большое количество генов (~ 2500 в неделю) за их способность трансактивировать ген-репортер с использованием минимального рабочей силы (на 1-2 человек) и минимальную стоимость (около $ 3 Стоимость реагента на микропланшет анализа). Транскрипционных регуляторов из нейрональных генов (например, альфа-синуклеина), которые трудно изучать в культуре нейронов огнеупорных в генетических манипуляций, можно сравнить бок о бок в этой прямой функциональном анализе. Мы включаем в нашПротокол подробный способ для клонирования и роста плазмид, содержащих альфа-синуклеина промотор, так как мы обнаружили, что плазмиды, содержащие эту область нестабильны при выращивании с обычными способами (см. обсуждение). Мы также включать недорогую альтернативу коммерчески доступные двойного люциферазы реагенты для высокой пропускной анализов. Этот протокол может быть легко адаптирована в отношении других регуляторных элементов, представляющих интерес, или к любому процессу, требующих высокой пропускной способности временной трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для экспериментального обзора, см. рисунок 1.
1. Подготовьте Reporter плазмиды, содержащие альфа-синуклеина Промоутер
Регуляторные элементы гена альфа-синуклеина (рис. 2) охватывают около 10 Кб, от вышестоящего NACP (не бета компонентом амилоидного пептида) динуклеотид повторного последовательности 1,2 через интрона 2 3. Мы включать в себя часть этого региона в наш корреспондент конструкция. Мы обнаружили, что плазмиды, содержащие интрон 2 необходимых специальных процедур для роста, как описано ниже. Люциферазы плазмиды, pGL4.10 и pGL4.75 (рис. 3), являются коммерчески доступными от Promega и можно размножать, используя обычные протоколы молекулярной биологии.
- Усиливать 2 компоненты альфа-синуклеина промотора в отдельных ПЦР с использованием рецепт в таблице 1 и праймеров в таблице 2.
- ВериFY продукты ПЦР в агарозном геле и чистым с использованием набора для очистки Qiaquick ПЦР (Qiagen), элюируя в 50 мкл ТЕ (Трис-ЭДТА). Хранить элюированной 0,9 т.п.н. фрагмент при -20 ° С для последующего использования.
- Дайджест весь объем 3,4 кб ПЦР фрагмента, а также 5 мкг pGL4.10, с SacI и XhoI. Treat вектор с щелочной фосфатазой кишечника теленка (Roche) и гель очищают с использованием набора Quick PureLink Gel Extraction (Invitrogen).
- Лигируют фрагмент и вектор использованием Т4 ДНК-лигазы (НЭБ). Очистите заполненную реакции с использованием набора PureLink ПЦР Micro (Invitrogen), элюируя в 10 мкл ТЕ-буфера.
- Transform 2 мкл очищенной, реакции связывания в 20 мкл Electromax Stbl4 компетентных клеток (Invitrogen) и электропорации в соответствии с инструкциями изготовителя. Взболтать в 30 ° C инкубаторе при 225 оборотах в минуту в течение 90 мин. Распространение 2 тома на LB-планшеты, содержащие 100 мг / мл ампициллина и инкубировали при 30 ° С в течение 2 дней.
- Используя зубочистку, выберите 4-6 небольшие колонии для прививки в 2 мл ТБ (Потрясающе Бульон). Вырастить эти Miniprep культур в 30 ° C шейкер O / N.
- Очищают плазмидной ДНК из 1,5 мл каждой культуры Miniprep с использованием набора PureLink HiPure Плазмиду Miniprep (Invitrogen).
- Дайджест минипрепараты с BamHI и électrophorèse на агарозном геле. Правильный клон должен производить фрагменты 2,8 кб и 4,9 кб.
- Restreak оставшееся минипрепаративную культуру от правильного клона на свежей LB (Luria Broth) пластины и расти при 30 ° С в течение 2 дней.
- Выберите небольшую колонию и инокуляции 1,5 мл ТБ закваски. Встряхнуть O / N при 30 ° С Не позволяйте закваска вырасти до насыщения.
- Развести всю культуру стартера в 150 мл нагретого ТБ и встряхните при 30 ° С в течение 2 дней. Прежде чем перейти к следующему шагу, используйте 1,5 мл этой культуры за дополнительную Miniprep и пищеварения, чтобы подтвердить, что клон не мутировал во replicati на.
- Очищают плазмидной ДНК от остальной культуры с использованием набора PureLink HiPure Плазмиду максипреп (Invitrogen). Ожидаемые выходы этой промежуточной плазмиды являются 50-150 мкг на 150 мл культуры.
- Оттепель 0,9 кб фрагмент заморожены в шаге 1.2. Повторите шаги 1,3 до 1,12 клонировать 0,9 кб фрагмент в промежуточный плазмиды, переваривая вместо с KpnI и SacI. Перевязывать, преобразования, выберите, и расти в течение maxipreps, как указано выше. Пищеварение с BamHI должно дать фрагменты 5,8 кб и 2,8 кб. Это плазмида, которая будет использоваться для экрана.
2. Подготовьте 293Т, корреспондент плазмиды и ДНК-библиотеки для скрининга
293T-клетки сначала высевали в 96-луночные планшеты и трансфицировали на следующий день. Reporter плазмиды и библиотеки ДНК разбавляют в 96-луночных планшетах. Мы получили тарелки трансфекции класса библиотеки ДНК из ДНК Ядра Массачусетского общего госпиталя (получить = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Этот протокол transfects единую библиотеку пластину на 2 одинаковых пластин 293Т (рис. 1), при этом 2 пластины клеток должны быть посеяны для каждой библиотеки пластины для экранированного.
Примечание: Рост клеток в средствах массовой информации без фенола красного или антибиотиков, так как они мешают люциферазы анализов и увеличить токсичность при трансфекции соответственно.
- Для каждой библиотеки пластина будет показан, ресуспендируют трипсином клетки 293Т до концентрации 1,5 × 10 5 клеток / мл в DMEM, содержащей 14% FBS. Налейте в стерильный резервуар (Axygen).
- Поместите резервуар, 2 ясно дном, 96-луночные планшеты (Corning), и коробку советы фильтр пипетки (Agilent) на робота палубе. Внесите 100 мкл клеток в каждую лунку обеих пластин, для плотности 1,5 х 10 4 клеток на лунку.
- Центрифуга клеток пластин при 50 мкг в течение 2 мин, используя низкую скорость рампы для обеспечения равныхплотность клеток на протяжении каждую лунку. Инкубируют при 37 ° С и 10% CO 2 O / N.
- Развести светлячка и Renilla репортер плазмиды до 5 нг / мкл в сыворотки среде. Смешайте разведений в соотношении 5:03 до светлячка Renilla плазмиды (по объему) в 15 мл коническую пробирку.
- Пипетка объединенные плазмид в каждую лунку 96-луночного планшета, дозирования 17 мкл на библиотеки пластины, плюс 2-10 мкл избыток, в каждую лунку.
- Получить трансфекции-класса библиотеки ДНК пластины, как указано выше и разбавить до 13,3 нг / мкл с эндотоксинов воде. Минимальный объем на лунку должно быть 28 мкл.
3. Выполните трансфекций
В день 2 части экрана, репортер плазмиды и библиотеки ДНК трансфицировали в клетки 293Т.
- Для каждой библиотеки планшета смешайте 107,5 мкл RT Optifect (Invitrogen) с 4,3 мл сыворотки среде (разведение 1:40) в полистирольной трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре ин обойтись 44 мкл (на библиотеки пластины) в каждую лунку 96-а, полистирол V-дном пластины (Greiner).
- Место пластины разбавленного Optifect, корреспондент плазмиды (шаг 2.5), Библиотека ДНК (шаг 2.6), и коробку пипетки советы по робота палубе.
- Аспирируйте 17 мкл репортер плазмид, 43 мкл разбавленного Optifect и 26 мкл библиотеки ДНК, вставляя воздушный зазор 5 мкл между каждой аспирации. Библиотека ДНК должны быть атмосферный прошлом, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Внесите содержимое советы в новый полистирола V дном тарелку, перемешать, крышку, и отложите в сторону в течение 20 мин, чтобы позволить комплексы липидов / ДНК с образованием. Если трансфекции нескольких библиотек пластины, заменить советы пипетки и библиотеки пластину, и повторите.
- Раскройте Optifect / ДНК смеси тарелку и положите его на робота палубе с 2 пластинами 293Т. Использование одного коробку советы пипетки, аспирируйте 80 мкл Optifect: смесь ДНК и медленно обойтись 40 мкл на каждой пластине клеток. Если трансfecting несколько библиотек тарелки, повторите для всех Optifect: тарелки ДНК. Обложка клетки.
- Центрифуга клеток пластин при 1200 мкг в течение 30 мин. Накройте и возвращают в инкубатор.
- Инкубируйте клетки в течение 4-6 часов. Во время этой инкубации подготовить свежей средой путем смешивания 12 мл DMEM, содержащей 10% FBS и 10 мкг / мл ципрофлоксацин (Cellgro) для каждого библиотечного трансфицированных пластины. Налейте свежей средой в стерильный резервуар.
- Поместите 2 коробки советы робот, одной пластины из клеток, резервуар, содержащий свежую среду, и резервуар с отходами на робота палубе. Аспирируйте 100 мкл СМИ из клеток и обойтись в резервуар отходов, частично заполненной 70% этанола. Использование свежих советы, аспирации 100 мкл свежей среды и медленно обойтись на клетки. Повторите эти действия для всех пластин клеток.
- Возврат пластины в инкубатор на 48 часа.
4. Выполните Dual-люциферазы Анализы
На 4 день экрана,светлячка и Renilla люциферазы анализы выполняются.
Примечание: двойной люциферазы Анализ требует последовательное добавление 2 анализа буферов, 3x светлячка буфере для анализа и 3X Renilla буфере для анализа, как описано в таблице 3 Firefly и Renilla люциферазы не секретируется, таким образом клетки лизируют необходимо перед измерением активности люциферазы. . Firefly аналитического буфера лизирует клетки и обеспечивает субстрат для люциферазы светляков; Renilla аналитического буфера утоляет светлячка сигнал и обеспечивает субстрат для люциферазы Renilla.
- Для каждой библиотеки пластины, готовить 8 мл 3X светлячка буфере для анализа из маточных растворов, как описано в таблице 3, и распределить 82 мкл в каждую лунку V дном 96-луночного планшета.
- Для каждой библиотеки пластины, также готовить 12 мл 3X Renilla буфере для анализа и обойтись 122 мкл в каждую лунку V дном 96-луночного планшета. Отложите каксветлячка и Renilla анализов буферы.
- Поместите коробку советы пипетки, резервуар с отходами и 2 тарелки клеток (трансфицированную из того же библиотеки пластины) на робота палубе.
- Аспирируйте 60 мкл СМИ из каждой чашки и отбросить в резервуаре отходов, частично заполненной 70% этанола. Накладки и отложите в сторону. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, повторите для всех наборов пластин.
- Поместите 2 коробки советы пипетки, тарелку с 3-кратным светлячка буфере для анализа, и набор клеток пластин на робота палубе.
- Аспирируйте 40 мкл 3Х светлячка буфере для анализа и добавить его к первой пластине клеток, тщательно перемешивая. Переход на новые подсказки пипетки, повторите для второго сотового пластины. Поместите клетки при комнатной температуре в течение 10 мин для завершения лизиса. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, замените коробки советы и клеточных пластин, и повторите.
- Запись люминесценции из каждой лунки каждой клеточной пластинки на люминометре, запись в течение 1 секунды на лунку. Возврат пластины к роботупалубе.
- Поместите 2 коробки советы пипетки, тарелку с 3X Renilla буфере для анализа, и набор клеток пластин на робота палубе.
- Аспирируйте 60 мкл 3X Renilla буфере для анализа, и добавить его в первой пластинки клеток, тщательно перемешивая. Переход на новую коробку советы пипетки, повторите для второго сотового пластины. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, повторите для всех наборов клеток пластин.
- Запись люминесценции от всех пластин на люминометре, записи в каждую лунку за 1 сек, что и выше. Откажитесь пластины.
5. Анализ данных
- Рассчитать светлячок: соотношение Renilla люминесценции ("F: R отношение") для каждой скважины путем деления графов светлячка сигнала по пунктам сигнала Renilla.
- Рассчитать значение индукции путем деления F: R отношение каждую лунку по средней F: R отношение пластины, за исключением самой высокой и самой низкой 25% скважин.
- Среднее значение на основании значения индукции через повторахдля одного трансфицированных библиотеки пластины. Гены, вызывающие или подавляя альфа-синуклеина более трех складок считаются "хиты" на этом экране и подлежат дальнейшему проверки и средних экранов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные значения люциферазы, F: отношения R и индукционные значения для одной половины пластины показано на рисунке 4 Обратите внимание на удар в а Н2, 32-кратным индуктора.. Гены, вызывающие чрезмерное токсичности (например, хорошо E3), или скважины, которые были плохо трансфицированными, будет производить низкие значения для обоих светлячка и Renilla люцифераз, но среднее значение индукции. Гены, вызывающие неспецифическую индукцию активности люциферазы, возможно, через взаимодействие с PGL4 позвоночника, будет вызывать светлячка и Renilla люциферазы в равной степени, в результате чего среднее значение индукции. Большие расхождения в индукционных значений между повторами должны вызвать подозрение на наличие ошибок выполнения. Важно, чтобы убедиться, что экран выполняется в пределах линейного диапазона репортера анализов, так что клоны, которые вызывают повышенную экспрессию будет оцениваться как повышенной активности люциферазы. Мы трансфецировали большее количество каждого гена-репортера для проверки линейностирепортера анализа в условиях нашего эксперимента (рис. 5). Важно также, чтобы выполнять анализы быстро после стадии инкубации, чтобы избежать нелинейность из-за истощения подложки. Мы наблюдали значительное активность люциферазы светлячка до 1 часа после добавлени реагентов (рис. 6).
Рисунок 1. Экспериментальная обзор. Каждая отдельная тарелка библиотеки ДНК в сочетании с 2-репортеров конструкций и использовали для трансфекции дубликаты пластины клеток. Через 48 ч активность каждого репортера люциферазы измеряют последовательно. Специфической индукции промотора плазмиды SNCA каждой плазмидной библиотеки рассчитывается по отношению к светлячка Renilla люциферазы после тарелки на основе normalizatioн.
Рисунок 2. Схема 5'-области альфа-синуклеина (SNCA), расположенный на хромосоме 4, используемой в светлячка репортерной плазмидой. Праймеров имена соответствуют последовательностей в таблице 2. Метками показывают около 8 кб сегмент исключены из фигуры В противном случае в масштабе. ATG стартовый кодон для SNCA находится в экзоне 3.
Фигура 3. Репортера люциферазы плазмиды, используемые в этом протоколе скрининга. Геномные регионы Snca клонируют в сайт множественного клонирования PGL4.10 непосредственно перед люциферазы светлячка. Плазмиду с HCMV-IE1 (цитомегаловируса человека немедленный ранний 1) промотор управлять экспрессией люциферазы Renilla был использован в качестве внутреннего контроля. Обе плазмиды являются коммерчески доступными от Promega.
Рисунок 4. Типичные результаты для половины одного 96-луночного планшета. А. Сырье люциферазы светляков рассчитывает подсчитывает люциферазы Б. Сырье Renilla С. F:.. Соотношение R: отношения R, рассчитанные путем деления стоимости в значением в значениях Б. Д. индукции для каждой скважины, рассчитывается путем деления каждого F на среднее F:. R отношение пластины, за исключением верхней и нижней 25% скважин E. Графическое представление значений для индукции однодисковое, с хорошо H2, положительного хит, подсвечивается. Хитов Н2 нейронов транскрипционный фактор не ранее связанные с выражением SNCA. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Линейности анализа. Клетки, трансфицированные с увеличением количества светлячка и Renilla люциферазы плазмиды под контролем сильного HCMV-IE1 промотора и анализировали с указанным протоколом. (Общее количество ДНК трансфицированных поддерживалась постоянной с использованием нейтрального балансировки плазмиды). A. Firefly линейность анализ. Следует отметить, что светлячка активность остается линейный через широком диапазоне значений линейности анализа B. Renilla.. Обратите внимание на уплощение выше 15 нг / лунку кривой.
.. Рисунок 6 Временной ход сигнала распада для анализа люциферазы светл люциферазы реагенты были добавлены к одной пластине трансфицированных с CMV-люциферазы построить в момент времени 0; Последовательные измерения были сделаны без добавления дополнительных реагентов.
| Компонент | Объем | Конечная концентрация |
| BAC 2002-D6 при 5 нг / мкл | 4 мкл | - |
| 5X Phusion GC буфера | 20 мкл | 1X |
| ДМСО | 6 мкл | 6% |
| дНТФ (10 мм) | 2 мкл | 200 мкМ |
| Прямой праймер (100 мкМ) | 1 мкл | 10 мкм |
| Reverse Primer (100 мкМ) | 1 мкл | 10 мкм |
| DDH 2 O | 65 мкл | - |
| Phusion ДНК-полимеразы | 1 мкл | - |
| Всего: 100 мкл |
ПЦР Таблица 1. Настройка для усиления альфа-синуклеина промотор.
| Название | Последовательность | Ограничение сайта |
| SNCA7 | 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI |
| SNCA8 | 5'-ТГК gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | SacI |
| SNCA1 | 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' | SacI |
| SNCA2 | 5'-тег ctcgag ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI |
.. Таблица 2 Грунтовки для усиления альфа-синуклеина промотор NACP Повторите ампликон должны произвести 0,9 кб фрагмент; другое длина ампликон составляет 3,4 кб. Для мест праймеров, пожалуйста, см. рисунок 2.
| : 3X Светлячок буфера для анализа | ||
| Акции Решения (хранить при температуре -80 ° С) | Объем на 100 мл 3X Firefly буфером | Конечная концентрация (3X) |
| 500 мМ DTT | 3,0 мл | 15 мм |
| 10 мМ коэнзим А- | 6,0 мл | 0,6 мм |
| 100 мМ АТР | 0,45 мл | 0,45 мм |
| 80 мг / mlluciferin | 0,525 мл </ TD> | 4,2 мг / мл |
| Тритон буфера для лизиса | 90,025 мл | - |
| Б. Тритон буфера для лизиса | ||
| Компонент (хранить при комнатной температуре) | Объем на 100 мл буфера для лизиса Triton | Конечная концентрация |
| Порошок Трис-HCl | 1,705 г | 0.1082 М |
| Трис-основной порошок | 0,508 г | 0,0419 М |
| 5 М NaCl | 1,50 мл | 75 мм |
| 1 М MgCl 2 | 0,30 мл | 3 мм |
| Тритон Х-100 чистой жидкости | 0,75 мл | 0,25% |
| Воды | в 100 мл общего объема | - |
| С. 3X Renilla буфера для анализа | ||
| Объем за ~ 100 мл 3X Renilla буфером | Конечная концентрация (3X) | |
| 10 мМ PTC124 в ДМСО | 0,6 мл | 0,06 мм |
| 2 мМ ч-CTZ в этаноле | 0,5 мл | 0,01 мм |
| Renilla Соли | 100 мл | - |
| Д. Renilla Соли | ||
| Компонент (хранить при комнатной температуре) | Объем на 100 мл Renilla солей | Конечная концентрация |
| 0,5 М Na 2 ЭДТА | 9,0 мл | 45 мм |
| На пирофосфат | 1,34 г | 30 мм |
| NaCl | 8.33 г | 1,425 М |
| Воды в 100 мл общего объема | - | |
Таблица 3. Исходные растворы и аналитические буферы для светлячка и Renilla люциферазы анализов. А. 3X светлячка аналитического буфера рецепт. DTT, дитиотреитол. Если не указано, все компоненты растворимы в воде. B. Triton буфера для лизиса рецепт. C. 3X Renilla аналитического буфера рецепт. ч-ЧТЗ, ч-целентеразин. Сделать 2 мм Х-ЧТЗ, добавив 10 мг H-ЧТЗ до 12,2 мл 100% этанола и 120 мкл концентрированной соляной кислоты. PTC124 растворим в ДМСО. Д. Renilla солей рецепту. Triton буфера для лизиса и Renilla соли стабильны в течение нескольких недель при 4 ° С и комнатной температуре, соответственно. 3X светлячка Буфер для анализа и 3X Renilla аналитического буфера должны быть смешаны в 3-4 ч выполнения люциферазы анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Альфа-синуклеина был вовлечен в болезни Паркинсона (БП) в качестве компонента тельцами Леви, 4 внутриклеточных включений, рассмотренных патогномоничными для заболевания. Многочисленные генома исследования ассоциации связывают одиночных нуклеотидных полиморфизмов в альфа-синуклеина с повышенным риском развития спорадической PD 5,6,7. Хотя реже, чем спорадического PD, PD семейный могут быть также вызваны мутациями в альфа-синуклеина 8, а также дублирования и утроение альфа-синуклеина локуса 9,10,11, явление также рассматривается в спорадических PD 12. Взятые вместе, эти исследования укрепить центральную роль альфа-синуклеина в патогенезе PD. Целью этого экрана в том, чтобы идентифицировать гены, которые регулируют альфа-синуклеина и, следовательно, может играть роль в патогенезе болезни Паркинсона. Используя этот протокол, мы провели скрининг 7670 генов человека и определили 154 предварительных хитов (по крайней мере, в 3 раза индукторы), что составляет 140уникальные гены. Эти хиты подлежали вторичных анализов с помощью новых препаратов ДНК, чтобы определить, хит воспроизводимость. Просмотров в диапазоне от 3-кратного воспроизведена в 28% последующих люциферазы анализов. Воспроизводимость увеличилась до 59%, 69% и 78% в 4 -, 5 - и 5-кратное индукторов, соответственно. Хиты с индукцией более 7 раз воспроизведена 100% времени. Мы в конечном счете определили 68 новых регуляторов альфа-синуклеина транскрипции.
Несколько линий доказательств показывают, что 68 хитов, которые мы получили реальные регуляторы альфа-синуклеина. Наш список выявленных хитов включает GATA3, член семьи GATA факторов транскрипции ранее показанных регулировать SNCA выражение 3. Забив один из немногих известных регуляторов Snca дает большую уверенность в надежности нашего экрана. Кроме того, мы самостоятельно забил как парад нескольких членов одной семьи нейронных транскрипционных факторов, предполагая, что экран является воспроизводимым, а не идентификации геновнаугад. Самое главное, в дополнительных последующих анализов, способность нашего Top Hits для регулирования эндогенной экспрессии SNCA в нервных клетках была подтверждена в избыточной экспрессии и бросовым анализов. Мы сверхэкспрессируется некоторые из верхней парад помощью BacMamvectors 3 в SY5Y дофаминергических клеток и смогли увеличить уровень эндогенного Snca 2-8 раза, а shRNA нокдаун этих хитов привело к снижению уровня SNCA мРНК. Эти исследования убедительно показывают, что наши главные хиты являются регуляторами уровня эндогенного SNCA и не просто артефакты деконструкции системы люциферазы. Дополнительные последующие исследования для других хитов будут обязаны определить истинные ложные положительные и ложно отрицательные тарифов на полный список хитов в нашем экране. Полное описание хитов и их отношения к болезни Паркинсона находится в стадии подготовки 14.
Это важно учитывать ограничения нашей методологии скрининга. Следует OBVдолговые расписки, что экран не будет выявлять любые регулятор нет в скрининга библиотеки. В то время как наш скрининг библиотеки был существенным, содержащий около четверти генома человека, это не было исчерпывающим. Учитывая простоту нашего анализа, дополнительные библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с легкостью. Мы увеличили количество генов, проверенной целенаправленно путем включения паралогов хитов, если это возможно, в наших средних анализов. Мы также не забил бы любой хит, который привязан к геномных регионах за пределами тех, которые включены в нашей репортерной конструкции. Чтобы максимизировать шансы включая надлежащее области, наш корреспондент содержится непосредственных фланговые последовательности для многочисленных транскрипции стартовых сайтов, найденных в промоутер SNCA. Вполне вероятно, что дополнительные факторы связываются в регионах, находящихся далеко за пределами непосредственной промоторной области, чтобы регулировать экспрессию SNCA. Они могут быть обнаружены путем выполнения экраны с дополнительными предшествующих и последующих областей, при желании, хотя только ~ 10 кб одновременно может бытьssessed таким образом из-за ограничений по эффективному клонирования в плазмидные векторы и стабильности большим числом копий PGL4 векторов. В качестве альтернативы, люцифераза конструкция может быть установлена в ВАС ДНК, содержащих локус SNCA. Одним из недостатков последнего подхода является то, что трансфекция БАС даже в идеальных условиях составляет> 100 раз менее эффективно, то плазмиды 15. Другой подход заключается в "нокаут в" репортера люциферазы в эндогенной SNCA локуса, метод, который является гораздо более трудоемким то наш подход. Мы также не забивать любой удар, который уже выраженную при насыщающих уровней так, что избыточная экспрессия не приводит к увеличению активности люциферазы. По этой причине мы решили использовать не-нейронные 293Т, которые могут не иметь нервных факторов, регулирующих SNCA, да и вообще мы забить ряд нейронных транскрипционных факторов. Одним из потенциальных недостатков 293Т, однако, является то, что мы не могли бы забить любой ген как хит, если она требуетсяопо лни тельная нейронные факторы, чтобы нормально функционировать. Таким образом, как и все экраны, наше исследование может пропустить ряд потенциальных регуляторов Snca. Однако с практической точки зрения, то 68 хитов мы получили увеличить число известных регуляторов SNCA более чем в 10 раз и нужны годы работы, чтобы следить, так что дополнительные хитов не может быть необходимым в нашем случае.
Важно также, чтобы реализовать потенциальные артефакты, которые могут возникнуть с использованием этой методики. В химических экранов, люциферазы печально известен artifactually голевых соединений по стабилизации белка люциферазы, а не по индукции транскрипции. Чтобы исключить белковые артефакты стабилизации, мы провели скрининг наши хиты против нескольких других промотор-люциферазы конструкций и не смогли найти ни хитов, которые появились действовать посттранскрипционно путем повышения выражение из конститутивных промоторов. Еще одна потенциальная артефакт может быть фактором трансактивирующий который связывается с вектором позвоночника PGL4, а непромоутер SNCA. Мы использовали вектор PGL4 который был широко мутагенеза удалить сайты связывания транскрипционных факторов, чтобы избежать этой проблемы. Чтобы оценить, насколько любой из наших хитов требуется вектор основу для индукции, мы использовали ПЦР для амплификации векторный район SNCA-люциферазы лишенным какого-либо позвоночника и использовали эту линейную фрагмент в качестве корреспондента вторичных анализов. Мы не обнаружили существенной разницы в индукционных значений между нашей полной плазмиды репортера и линейной магистральной без конструкции с одним исключением. GATA2 показали индукцию ~ 15-кратное с плазмидой репортера, но только ~ 2,7 раза с линейной репортера, предполагая, что некоторые из индукции GATA2 может быть связано с привязкой к магистральным компонентов.
Ряд других методов определения транскрипционных регуляторов были описаны. Почти 30 лет назад, отображение цис-действующие элементы транскрипции контроля в сильных вирусных промоторов через трансфицированной экспрессии генов репортер был ESTablished 16. Этот метод, иногда называют "промоутер избиение," упал в немилость для картирования конкретных промоутеров камерного типа, так как трудно получить и трансфекции подходящих линий первичных клеток, и такие линии не может точно представлять свои ткани происхождения. Дрожжи один-гибридной системы 17 обходит эту проблему, обеспечивая деконструкции репортер систему для обнаружения взаимодействия между библиотекой генов синтеза и конкретной цис-действующего элемента. Наш подход аналогичен дрожжей один-гибридной системы в ее вскрывают противоречия дизайна, но в нашей системе мы используем нормальные клонов выражение, а не генов слияния, мы используем клетки млекопитающих, а не дрожжи, и мы используем роботов что позволяет бок о бок количественные функциональные показания для каждого гена испытаний. Перспективным методом называется протеомики изолированных сегментов хроматина (Pich), который позволяет идентифицировать белков, связанных с конкретными участков генома был описан 18 лет, но еще неуспешно применяется для одного копирования генов человека. Геном всей иммунопреципитация хроматина (чип-след и чип-чип) исследования были использованы для идентификации цис-действующие регионы в больших масштабах 19. Этот способ потенциально мощный, но, как PICH, могут быть менее полезны для типов клеток, таких как специфических нейрональных популяций, которые не легко получить в гомогенной культуры. Более того, когда мы проверили ChIP баз данных для наших проверенных хитов, они не показали связывание этих хитов с промоутером SNCA. Причина этого не ясна, так как мы были в состоянии продемонстрировать связывание этих факторов на промоутера SNCA по обычной ChIP 14; но это может быть связано с отсутствием всей SNCA промоторной области время занятого в ChIP исследований с использованием микрочипов показания (чип-чип). Поэтому Pich, чип-след, и другие протеомные могут оказаться наиболее полезными в сочетании с прямыми функциональными показаний, что наш метод генерирует.
Dual-люциферазыанализов с использованием светлячка и Renilla люцифераз предлагают чувствительный метод для изучения многочисленных внутриклеточные процессы в формате высокой пропускной 20. Слияние целевой промоутер в люциферазы светляков был использован для изучения регуляции транскрипции и промоутер структуру многочисленных целей в пробирке, в том числе альфа-синуклеина 1,2. Мы разработали недорогую альтернативу с коммерчески доступными двойного люциферазы реагентов, которые проводили четкого сигнала и была линейной в диапазоне нашего анализа (рис. 6). Наш метод адаптирован из протокола щедро предоставляет Рон Джонсон в NIH и ранее описанного некоммерческого двойного люциферазы 21. Светлячка Буфер для анализа лизирует клетки и обеспечивает АТФ и люциферин, подложки из люциферазы светлячка. Этот анализ дает реакцию свечения с периодом полураспада около 1 часа (рис. 7). Анализ буфера Renilla гасит fireflу сигнализировать и обеспечивает соответствующий субстрат (коэлентеразина). Следует отметить, что сам буфер для анализа Renilla не будет лизировать клетки и должен быть использован в сочетании с любой Тритон буфера для лизиса или светлячка буфере для анализа. Мы обнаружили, что описанные выше Renilla анализов буферы легко выпадали в осадок при комнатной температуре, таким образом мы исключили сульфат натрия и снижение количества пирофосфата натрия на 60%. Наш анализ также включает PTC124, мощный ингибитор люциферазы светляков 22, что способствует дополнительной закалки в анализе. Тушение активность также обеспечивается ЭДТА, NaCl и пирофосфат в буфере Renilla. С помощью этих новых составов, примерно 99,5% светлячка активности гасят буфера Renilla. Интенсивность и воспроизводимость как светлячка и люциферазы Renilla сигналов были слегка улучшен путем смешивания после добавления буфера (шаги 4,6 и 4,10).
По нашему опыту, полный сlpha-синуклеина промоутер в pGL4.10 однозначно трудно для усиления и клон, возможно, из-за GC-богатых регионов и сложной вторичной структуры в интрона 2. Мы были самым успешным с STBL4 компетентных клеток, которые оптимизированы для клонирования нестабильных вставками. Даже Соблюдение этих мер предосторожности мы часто восстановлены мутант, в котором Е. палочка геномной ДНК встраивали в 3'-конце этого конструкта. Этот мутант создает полосы примерно 5,8 кб и 4 кб, которые переваривали BamHI (по сравнению с 5,8 кб и 2,8 кб в правильном клона) и выглядит как больших колоний на селективных пластин. Тщательное рост компетентных клеток при 30 ° С и предотвращения культур от достижения уменьшается насыщенность, но не устраняет, вероятность восстановления мутанта. Мы рекомендуем проверить чистоту всех препаратов ДНК с помощью рестрикционного гидролизата и гель-электрофореза перед трансфекцией.
Этот протокол скрининга легко адаптированы для других промоутеров,д должны быть оптимизированы соответственно, с использованием в качестве позитивных и негативных генов уже известные элементы управления для регулирования целевой промотор. Несколько соображения применимы к клонированию и трансфекции репортер плазмид. При клонировании целевой промотор в люциферазы светлячка репортерной плазмидой, начало сайт люциферазы должно быть приблизительно поступательное стартового сайта в гене-мишени. Экраны Dual-люциферазы, как правило, размещать плазмиду Renilla под контролем минимального промотора, например, HSV-TK промотора, чтобы свести к минимуму воздействие на скелете плазмиды. Тем не менее, мы обнаружили, что один из наших положительных контролей индуцированных этот промотор, таким образом, мы выбрали промотора цитомегаловируса. Относительное количество каждого репортерной плазмидой должна быть определена эмпирически и зависит от конститутивной активности каждого промотора. Идеально базовый (трансфецировали, но неиндуцированных) люциферазы рассчитывает должно быть не менее пяти до десяти раз по сравнению фон из нетрансфицированных клеток, чтобы обнаружить Librarу гены, которые подавляют или, что причиной токсичности, которая приведет к снижению сигнала. До скрининга, убедитесь, что ожидаемые рассчитывает люциферазы попадают в линейном диапазоне каждого анализа, который может варьироваться от люминометров. (Заметим, что наша Renilla подсчитывает обычно попадают в верхний конец линейного диапазона в нашем анализе.) Мы обнаружили, что увеличение соотношения библиотеки ДНК к светлячка репортерной плазмидой привело к повышению индукции, таким образом, мы использовали минимальное количество этого репортера.
Протокол трансфекции должна быть оптимизирована, а также. Мы выбрали 293Т для их относительной легкости трансфекции, эффективность которого увеличилась в 50 раз с добавлением стадии центрифугирования (этап 3.5). Дофаминергическая линия SY5Y закончилась в 100 раз меньше transfectable в наших руках, и, как говорилось выше, не может быть оптимальным для выполнения избыточная экспрессия скрининг. Наш анализ оптимальное время было эмпирически установлено, что 48 ч, таким образом, наши клетки высевали при низкой начальной плотности, Что требует использования Optifect, которая предназначена для трансфекции клеток на 10-70% слияния. Другие клеточные линии могут потребовать разные стартовые плотности и различные реагенты трансфекции. Мы выбрали для изменения клеток СМИ после трансфекции добавить антибиотики (которые могут привести к токсичности, если присутствует во трансфекции). Хотя это уменьшает вероятность бактериального загрязнения, это увеличивает стоимость в материалах (особенно советы робот пипетки), таким образом, необходимость этого шага должны быть оценены при адаптации этот протокол для других систем. Люциферазы анализы могут быть использованы с минимальным оптимизации, но перед выполнением этого теста в высокой пропускной способностью с другим типом клеток, убедитесь, что клетки соответствующим образом лизируют в буфере для лизиса Тритона. Следует отметить, что Тритон Х-100 вызывает коэлентеразина аутофлюоресценция. Сигнал Renilla в нашем анализе, была достаточно сильна, чтобы принизить этот эффект, но при оптимизации этого анализа для других типов клеток, ограничить Тритон Х-100 томов в миНимал сумма, необходимая для лизиса клеток.
Мы представили быстрый и относительно недорогой метод скрининга для выявления новых регуляторов транскрипции альфа-синуклеина с использованием клеток трансфицированы с репортером системы двойного люциферазы. Этот протокол можно легко модифицировать в отношении других представляющих интерес генов, а также могут быть приспособлены для любых применений, требующих высокой пропускной трансфекции, такие как лентивирусов производства 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана роялти, полученных лицензионных BacMamreagents (патент США 5731182).
Acknowledgments
Мы благодарим Джона Darga в MGH ДНК сердечниками для подготовки скрининга ДНК библиотеки. Кристофер Chigas Перкин Элмер оказали неоценимую поддержку нашей Wallac 1420 люминометра. Стивен Ciacco и Мартин Thomae из Agilent оказала поддержку робота Браво. Мы благодарим Рон Джонсон и Стив Тита на NIH для щедро обеспечивая их протокол анализа люциферазы двойного свечения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
