Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade
Summary
Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.
Abstract
Se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento rápido y barato para identificar reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína, un gen asociado con la enfermedad de Parkinson. Células 293T se transfectaron de forma transitoria con plásmidos de una biblioteca de expresión ORF dispuestos, junto con plásmidos informadores de luciferasa, en un formato de microplaca de un gen-por-así. Actividad de la luciferasa de la luciérnaga se ensaya después de 48 horas para determinar los efectos de cada gen de la biblioteca después de la transcripción alfa-sinucleína, normalizada para la expresión de una construcción de control interno (un promotor de hCMV dirigir la luciferasa de Renilla). Este protocolo se ve facilitada por un robot de sobremesa encerrado en una cabina de bioseguridad, que realiza la manipulación de líquidos aséptica en formato de 96 pocillos. Nuestro protocolo de transfección automatizado es fácilmente adaptable a la producción de alto rendimiento biblioteca lentiviral u otros protocolos de cribado funcionales que requieren triples-transfecciones de un gran número de plásmidos de la biblioteca únicos en conjugadoFuncione con un conjunto común de plásmidos auxiliares. También presentamos una alternativa económica y validado para comercialmente disponibles reactivos de luciferasa duales, que emplea el PTC124, EDTA, y pirofosfato para suprimir la actividad luciferasa de luciérnaga antes de la medición de la luciferasa de Renilla. El uso de estos métodos, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 68 reguladores de la alfa-sinucleína. Este protocolo es fácilmente modificables para atacar otros genes de interés.
Introduction
La capacidad de identificar elementos reguladores genéticos clave y los factores que actúan sobre ellas es fundamental para la exploración de numerosos procesos biológicos. Sin embargo, los factores que regulan la expresión de genes en los tipos de células raras, como la identificación de poblaciones neuronales específicas, puede ser un reto. Aquí, se presenta un protocolo para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína (SNCA), un gen asociado con la enfermedad de Parkinson y expresado en las neuronas dopaminérgicas en la substantianigra pars compacta de la región del cerebro medio. Esto lo logramos mediante una pantalla reportero de alto rendimiento, doble luciferase, in vitro para deconstruir la expresión de alfa-sinucleína en las células 293T. El promotor de alfa-sinucleína se clona primero en un plásmido que contiene el gen reportero de luciferasa de luciérnaga. Un plásmido comercialmente disponible que contiene la luciferasa de Renilla bajo el control de un promotor constitutivamente activo sirve como un control interno. Thesconstrucciones e reportero se transfectan conjuntamente en células 293T en microplacas con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de tal manera que cada pocillo se transfectaron con un único plásmido de la biblioteca. Después de 48 horas, la actividad de la luciferasa para cada reportero se mide de forma secuencial utilizando un ensayo de doble resplandor. La expresión relativa de alfa-sinucleína en respuesta a cada gen biblioteca se deduce por la relación de luciérnaga: la actividad de luciferasa de Renilla en cada pocillo (F: relación R) después de la normalización a base de placa.
Este protocolo proporciona la capacidad de detectar un gran número de genes (~ 2,500 por semana) por su capacidad para transactivar un gen reportero usando mano de obra mínima (1-2 personas) y un costo mínimo (unos 3 dólares el costo de reactivos por ensayo de microplacas). Reguladores de la transcripción de los genes neuronales (por ejemplo, alfa-sinucleína), que son difíciles de estudiar en neuronas cultivadas refractarios a la manipulación genética, se pueden comparar lado a lado en este ensayo funcional directa. Incluimos en nuestroprotocolo de un método detallado para la clonación y el crecimiento de plásmidos que contienen el promotor de alfa-sinucleína, ya que encontramos que los plásmidos que contienen esta región son inestables cuando se cultivan con procedimientos convencionales (véase la discusión). También incluimos una alternativa económica a los reactivos disponibles en el mercado dual de luciferasa para ensayos de alto rendimiento. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros elementos reguladores de interés, o a cualquier proceso que requiere de alto rendimiento transfecciones transitorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alfa-sinucleína se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) como un componente de los cuerpos de Lewy 4, inclusiones intracelulares considerados patognomónicos de la enfermedad. Numerosos estudios de asociación del genoma han relacionado polimorfismos de nucleótido único en la alfa-sinucleína con un mayor riesgo para los esporádicos PD 5,6,7. Aunque menos común que la enfermedad de Parkinson esporádica, PD familiar puede estar también causada por mutaciones en alfa-sinucleína <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a John Darga del MGH ADN Core para la preparación de la biblioteca de detección de ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer prestó apoyo invalorable para nuestra Wallac 1420 luminómetro. Steven Ciacco y Martin Thomae de Agilent proporcionó apoyo para el robot Bravo. Damos las gracias a Ron Johnson y Steve Tito en el NIH para ofrecer generosamente su protocolo de ensayo de luciferasa dual resplandor.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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