Summary

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

Published: June 01, 2014
doi:

Summary

Vi presenterar en snabb och billig screening metod för att identifiera transkriptionsregulatorer med high-throughput robot transfections och en hemmagjord med dubbla glöd luciferas-analysen. Detta protokoll genererar snabbt direkt sida vid sida funktionella data för tusentals gener och är lätt modifieras för att rikta någon gen av intresse.

Abstract

Vi presenterar en snabb och billig high-throughput screening protokoll för att identifiera transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein, en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom. 293T-celler transfekterades transient med plasmider från en klädd ORF expressionsbibliotek tillsammans med luciferas-reporter-plasmider, i ett en-gen-per-brunnars mikroformat. Firefly luciferas aktivitet analyseras efter 48 timmar för att avgöra effekterna av varje bibliotek gen vid alfa-synuklein transkription, normaliserad till uttryck från en intern kontroll-konstruktion (en hCMV promotor styra Renilla luciferas). Detta protokoll underlättas av en bänk-topp robot inneslutna i en biosäkerhet skåp, som utför aseptisk vätskehantering i 96-brunnsformat. Vårt automatiska transfektion protokoll kan lätt anpassas till hög kapacitet Lentiviral bibliotek produktion eller andra funktionella screeningprotokoll kräver trippel transfektioner av ett stort antal unika biblioteks plasmider i konjugatnktion med en gemensam uppsättning av hjälpar-plasmider. Vi presenterar också ett billigt och validerade alternativ till kommersiellt tillgängliga, dubbla luciferasreagens som sysselsätter PTC124, EDTA, och pyrofosfat för att undertrycka firefly luciferasaktiviteten före mätningen av Renilla-luciferas. Genom att använda dessa metoder, skärmad vi 7670 mänskliga gener och identifierade 68 regulatorer av alfa-synuklein. Detta protokoll är lätt modifieras för att rikta andra gener av intresse.

Introduction

Förmågan att identifiera viktiga genetiska regulatoriska element och de faktorer som verkar på dem är grundläggande för utforskning av många biologiska processer. Men att identifiera faktorer som reglerar uttrycket av gener i sällsynta celltyper, till exempel specifika neuronala populationer, kan vara en utmaning. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera nya transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein (SNCA), en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom och som uttrycks i dopaminerga neuroner i substantianigra pars compacta-regionen i mitthjärnan. Detta åstadkommer vi med hjälp av en hög genomströmning, dual-luciferas, in vitro-reporter skärmen för att dekonstruera alfa-synuklein uttryck i 293T-celler. Den alfa-synuklein-promotorn klonas först in i en reporterplasmid innehållande eldflugeluciferasgenen. En kommersiellt tillgänglig plasmid innehållande Renilla luciferas under kontroll av en konstitutivt aktiv promotor tjänar som en inre kontroll. These reporterkonstruktioner är co-transfekterades in i 293T-celler i mikroplattor med plasmider från en DNA-expressionsbibliotek, till exempel att varje brunn transfekterades med ett enda bibliotek plasmid. Efter 48 timmar, luciferasaktiviteten för varje reporter mäts sekventiellt med hjälp av en dubbel-glöd-analysen. Den relativa expressionen av alfa-synuklein i beroende av varje bibliotek genen härledas genom förhållandet eldfluga: Renilla-luciferas-aktivitet i varje brunn (F: A-förhållandet) efter plattbaserad normalisering.

Detta protokoll ger möjlighet att screena ett stort antal gener (~ 2500 per vecka) för sin förmåga att transaktivera en reporter gen med hjälp av minimal arbetskraft (1-2 personer) och minimal kostnad (cirka 3 reagenskostnaden per mikroanalys). Transkriptionella regulatorer av neuronal gener (t.ex. alfa-synuklein), som är svåra att studera i odlade neuroner eldfasta för genetisk manipulering, kan jämföras sida vid sida i denna direkt funktionell analys. Vi ingår i vårprotokoll en detaljerad metod för kloning och tillväxt av plasmider innehållande alfa-synuklein-promotorn, eftersom vi fann att plasmider som innehåller denna region är instabila när de odlas med konventionella förfaranden (se Diskussion). Vi inkluderar även ett billigt alternativ till kommersiellt tillgängliga dubbla luciferas reagens för high-throughput assays. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att rikta andra reglerande element av intresse, eller till någon process som kräver hög genomströmning transienta transfektioner.

Protocol

För en experimentell överblick, se figur 1. 1. Förbered Reporter plasmider innehållande alfa-synuklein Promoter Regulatoriska element av alfa-synuklein-genen (Figur 2) sträcker sig över cirka 10 kb, från den uppströms belägna NACP (non-A-beta-komponenten av amyloidpeptid) dinukleotid-upprepningssekvens 1,2 genom intron 2 3. Vi inkluderar en del av denna region i vår reporter konstruktion. Vi fann att…

Representative Results

Typiska luciferas värden, F: R nyckeltal och induktionsvärden för en halv-platta visas i Figur 4 Observera träffen i väl H2, en 32-faldig inducerare.. Gener som orsakar en mycket hög toxicitet (t ex väl E3), eller brunnar som var dåligt transfekterade, kommer att producera låga värdena för både eldfluga och Renilla luciferaser, men en genomsnittlig induktionsvärde. Gener som orsakar icke-specifik induktion av luciferasaktivitet, kanske via interaktion med pGL4 ryggrad, kom…

Discussion

Alpha-synuclein har blandats in i Parkinsons sjukdom (PD) som en komponent i Lewy bodies 4, intracellulära inklusioner anses patognomona för sjukdomen. Många genomet hela föreningen studier har kopplat single nucleotide polymorfism i alfa-synuklein med ökad risk för sporadisk PD 5,6,7. Även mindre vanliga än sporadiska PD, kan familjär PD också orsakas av mutationer i alfa-synuklein 8, samt dubbelarbete och tredubbling av alfa-synuklein locus 9,10,11, ett fenomen ses…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar John Darga av MGH DNA Kärna för beredning av DNA-screening-biblioteket. Christopher Chigas av Perkin Elmer förutsatt ovärderligt stöd för vår Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco och Martin Thomae av Agilent gett stöd till Bravo roboten. Vi tackar Ron Johnson och Steve Titus vid NIH för generöst ge sin dubbla glöd luciferas analysprotokollet.

Materials

Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
Coenzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Play Video

Cite This Article
Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

View Video