Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys
Summary
Vi presenterar en snabb och billig screening metod för att identifiera transkriptionsregulatorer med high-throughput robot transfections och en hemmagjord med dubbla glöd luciferas-analysen. Detta protokoll genererar snabbt direkt sida vid sida funktionella data för tusentals gener och är lätt modifieras för att rikta någon gen av intresse.
Abstract
Vi presenterar en snabb och billig high-throughput screening protokoll för att identifiera transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein, en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom. 293T-celler transfekterades transient med plasmider från en klädd ORF expressionsbibliotek tillsammans med luciferas-reporter-plasmider, i ett en-gen-per-brunnars mikroformat. Firefly luciferas aktivitet analyseras efter 48 timmar för att avgöra effekterna av varje bibliotek gen vid alfa-synuklein transkription, normaliserad till uttryck från en intern kontroll-konstruktion (en hCMV promotor styra Renilla luciferas). Detta protokoll underlättas av en bänk-topp robot inneslutna i en biosäkerhet skåp, som utför aseptisk vätskehantering i 96-brunnsformat. Vårt automatiska transfektion protokoll kan lätt anpassas till hög kapacitet Lentiviral bibliotek produktion eller andra funktionella screeningprotokoll kräver trippel transfektioner av ett stort antal unika biblioteks plasmider i konjugatnktion med en gemensam uppsättning av hjälpar-plasmider. Vi presenterar också ett billigt och validerade alternativ till kommersiellt tillgängliga, dubbla luciferasreagens som sysselsätter PTC124, EDTA, och pyrofosfat för att undertrycka firefly luciferasaktiviteten före mätningen av Renilla-luciferas. Genom att använda dessa metoder, skärmad vi 7670 mänskliga gener och identifierade 68 regulatorer av alfa-synuklein. Detta protokoll är lätt modifieras för att rikta andra gener av intresse.
Introduction
Förmågan att identifiera viktiga genetiska regulatoriska element och de faktorer som verkar på dem är grundläggande för utforskning av många biologiska processer. Men att identifiera faktorer som reglerar uttrycket av gener i sällsynta celltyper, till exempel specifika neuronala populationer, kan vara en utmaning. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera nya transkriptionsregulatorer av alfa-synuklein (SNCA), en gen som förknippas med Parkinsons sjukdom och som uttrycks i dopaminerga neuroner i substantianigra pars compacta-regionen i mitthjärnan. Detta åstadkommer vi med hjälp av en hög genomströmning, dual-luciferas, in vitro-reporter skärmen för att dekonstruera alfa-synuklein uttryck i 293T-celler. Den alfa-synuklein-promotorn klonas först in i en reporterplasmid innehållande eldflugeluciferasgenen. En kommersiellt tillgänglig plasmid innehållande Renilla luciferas under kontroll av en konstitutivt aktiv promotor tjänar som en inre kontroll. These reporterkonstruktioner är co-transfekterades in i 293T-celler i mikroplattor med plasmider från en DNA-expressionsbibliotek, till exempel att varje brunn transfekterades med ett enda bibliotek plasmid. Efter 48 timmar, luciferasaktiviteten för varje reporter mäts sekventiellt med hjälp av en dubbel-glöd-analysen. Den relativa expressionen av alfa-synuklein i beroende av varje bibliotek genen härledas genom förhållandet eldfluga: Renilla-luciferas-aktivitet i varje brunn (F: A-förhållandet) efter plattbaserad normalisering.
Detta protokoll ger möjlighet att screena ett stort antal gener (~ 2500 per vecka) för sin förmåga att transaktivera en reporter gen med hjälp av minimal arbetskraft (1-2 personer) och minimal kostnad (cirka 3 reagenskostnaden per mikroanalys). Transkriptionella regulatorer av neuronal gener (t.ex. alfa-synuklein), som är svåra att studera i odlade neuroner eldfasta för genetisk manipulering, kan jämföras sida vid sida i denna direkt funktionell analys. Vi ingår i vårprotokoll en detaljerad metod för kloning och tillväxt av plasmider innehållande alfa-synuklein-promotorn, eftersom vi fann att plasmider som innehåller denna region är instabila när de odlas med konventionella förfaranden (se Diskussion). Vi inkluderar även ett billigt alternativ till kommersiellt tillgängliga dubbla luciferas reagens för high-throughput assays. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att rikta andra reglerande element av intresse, eller till någon process som kräver hög genomströmning transienta transfektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alpha-synuclein har blandats in i Parkinsons sjukdom (PD) som en komponent i Lewy bodies 4, intracellulära inklusioner anses patognomona för sjukdomen. Många genomet hela föreningen studier har kopplat single nucleotide polymorfism i alfa-synuklein med ökad risk för sporadisk PD 5,6,7. Även mindre vanliga än sporadiska PD, kan familjär PD också orsakas av mutationer i alfa-synuklein 8, samt dubbelarbete och tredubbling av alfa-synuklein locus 9,10,11, ett fenomen ses…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar John Darga av MGH DNA Kärna för beredning av DNA-screening-biblioteket. Christopher Chigas av Perkin Elmer förutsatt ovärderligt stöd för vår Wallac 1420 luminometer. Steven Ciacco och Martin Thomae av Agilent gett stöd till Bravo roboten. Vi tackar Ron Johnson och Steve Titus vid NIH för generöst ge sin dubbla glöd luciferas analysprotokollet.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
