Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması
Summary
Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.
Abstract
Bu alfa-sinüklein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir genin transkripsiyonel düzenleyici belirlemek için hızlı ve ucuz bir yüksek verimli tarama protokol mevcut. 293T hücreleri, bir tek gen başına oyuk mikro biçimde, bir arada lusiferaz haberci plazmidleriyle, bir dizilmiş ORF sentezleme kütüphanesinden plazmid ile transfekte edilir. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, bir iç kontrol yapısı (Renilla lusiferazı yönlendiren bir hCMV promotörü) ekspresyon normalize alfa-sinüklein transkripsiyon, üzerine her bir kütüphane genin etkilerini belirlemek için 48 saat sonra test edilir. Bu protokol, 96 kuyulu formatta aseptik sıvı taşıma yapan bir biyo-güvenlik kabini içinde bulunan bir tezgah üstü robot tarafından kolaylaştırılır. Bizim otomatik transfeksiyon protokol yüksek verimli bir kitaplık üretimi veya lentiviral konjugat olarak eşsiz bir kütüphane plazmidlerin çok sayıda üç transfections gerektiren diğer fonksiyonel eleme protokollere kolayca uyarlanabiliryardımcı plazmidin ortak bir set ile nction. Ayrıca, ucuz ve geçerli bir alternatif sunmak PTC124'ün, EDTA, ve önceki Renilla lusiferaz ölçümü ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için pirofosfat kullanan ticari olarak temin edilebilen, çift lusiferaz reaktifler için. Bu yöntemler kullanılarak, 7670 insan genleri elenir ve alfa-sinüklein 68 regülatörleri belirlenmiştir. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.
Introduction
Temel genetik düzenleyici unsurları ve onlara hareket faktörleri belirlemek için yeteneği çok sayıda biyolojik süreçlerin keşif için esastır. Bununla birlikte, bu spesifik sinir hücresi popülasyonları gibi nadir hücre tiplerinde gen ekspresyonunu düzenleyen faktörlerin tanımlanması, zor olabilir. Burada, alfa-sinüklein (SNCA) 'nin yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için bir protokol mevcut, Parkinson hastalığı ile ilişkili ve substantianigra dopaminerjik nöronların ifade edilen bir gen, orta beyin bölgesini pars compacta. Biz, 293T hücrelerinde alfa-sinüklein ifade yapısızlaştırmak bir yüksek verimli, çift-lusiferaz, in vitro raportör ekran kullanarak bunu. Alfa-sinüklein promoter birinci ateşböceği lusiferaz geni ihtiva eden bir raportör plazmid içine klonlanır. Yapısal olarak aktif bir promotörün kontrolü altında Renilla lusiferaz içeren bir plazmid, bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. These raportör yapılan, her biri de tek bir kütüphane bir plazmid ile transfekte edilir, öyle ki, bir DNA sentezleme kütüphanesinden plazmidleri ile mikroplakalarda 293T hücrelerine ko-transfekte edilir. 48 saat sonra, her bir muhabir için lusiferaz aktivitesi, bir çift ışıma analizi kullanılarak ardışık olarak ölçülür sonra. Plaka bazlı normale döndükten sonra (R oranı F) her bir Renilla lusiferaz aktivitesi: Her kitaplık genine karşılık olarak alfa-sinüklein nispi ekspresyon böceği oranı ile anlaşılmaktadır.
Bu protokol, insan gücü minimum (1-2 kişi) ve minimum maliyet (mikro-deney başına yaklaşık 3 $ maliyeti reaktifi) kullanılarak, raportör gen transaktivasyonu için kapasiteleri için genleri, çok sayıda (~ haftada 2500) taranması için olanağı sağlar. Genetik manipülasyon dirençli kültüre edilmiş nöronlarda çalışma zordur nöronal genlerin transkripsiyonel düzenleyici (örneğin, alfa-sinüklein), bu doğrudan fonksiyonel deneyde yan yana karşılaştırılabilir. Biz dahil bizimprotokolünün geleneksel prosedürler (Tartışma) ile yetiştirilen bu bölgeyi içeren plazmidler kararsız olduğu bulundu beri klonlama ve alfa-sinüklein promotörünü içeren plazmidlerin büyümesi için ayrıntılı bir yöntem. Ayrıca, yüksek verimli deneyler için ticari olarak temin edilebilen çift-lusiferaz reaktifler için ucuz bir alternatifi bulunmaktadır. Bu protokol, kolayca ilgili diğer düzenleyici elemanları, ya da yüksek verimli, geçici nakiller gerektiren herhangi bir işlem hedeflemek için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alfa-sinüklein Lewy 4, bu hastalık için patognomonik olarak hücre içi dahil olanlar bir bileşeni olarak, Parkinson hastalığı (PD) olarak işaret edilmiştir. Çok sayıda genom-geniş dernek çalışmaları sporadik PH 5,6,7 riski ile alfa-sinüklin tek nükleotid polimorfizmleri bağlantılı var. Sporadik PH daha az yaygın olsa da, ailesel PD aynı zamanda çoğaltılması ve alfa-sinüklein mahalinin 9,10,11 arasında triplication olarak, alfa-sinüklin 8 mutasyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu DNA tarama kütüphanesinin hazırlanması için MGH DNA Core John Darga ederiz. Perkin Elmer Christopher Chigas bizim VVallac 1420 luminometrede için çok değerli bir destek sağladı. Steven Ciacco ve Agilent Martin Thomae Bravo robot için destek sağladı. Biz cömertçe dual-kızdırma lusiferaz tahlil protokolü sağlamak için NIH Ron Johnson ve Steve Titus teşekkür ederim.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
