In vivo Macrophage avbildning med MR Riktad kontrastmedel för Längsgående Utvärdering av septisk artrit

Summary

Vi visar hur du utför makrofag MR avbildning med ultrasmall agent superparamagnetisk kontrast (USPIO) i septisk artrit, vilket en inledande och longitudinell

Abstract

Makrofager är viktiga-celler i initiering, utveckling och reglering av det inflammatoriska svaret på bakteriell infektion. Makrofager intensivt och alltmer rekryteras i septiska lederna från de tidiga faserna av infektionen och infiltration är tänkt att regrediera gång effektiv borttagning av patogener uppnås. Förmågan att identifiera in vivo makrofagaktiviteten i en infekterad gemensamt kan därför ge två huvudsakliga användningsområden: tidig upptäckt av akut synovit och övervakning av behandlingen.

In vivo noninvasive detektering av makrofager kan utföras med magnetisk resonans avbildning med järn nanopartiklar såsom ultrasmall superparamagnetisk järnoxid (USPIO). Efter intravaskulär eller intraartikulär administrering USPIO specifikt fagocyterats av aktiverade makrofager, och, på grund av sina magnetiska egenskaper, inducerar signalen ändras i vävnader som uppvisar makrofaginfiltrering. En quantitative utvärdering av infiltratet är genomförbart, eftersom området med signalförlust (antal mörka bildpunkter) observeras på gradienteko MR-bilder efter partiklar injektion är korrelerad med mängden järn i vävnaden och därför återspeglar antalet USPIO-laddade celler.

Vi presenterar här ett protokoll för att utföra makrofag avbildning med USPIO-förstärkt MR i en djurmodell av septisk artrit, vilket en inledande och longitudinell in vivo noninvasiv utvärdering av makrofager infiltration och en bedömning av terapi åtgärd.

Introduction

Magnetisk resonanstomografi (MRT) anses vara den avbildning modalitet i valet för demonstration av infektiös synovit grund av sin höga rumsliga upplösning och mjukdelar kontrast. Signal Observerade förändringar på MRI i artrit låg T1 och T2 hög signal vilket speglar den ökade närvaron av extracellulärt vattenhalt, och en markant förbättring efter gadolinium baserat-kontrastmedel administration, överensstämmer med histologiskt fynd av ökad vaskularitet grund av vasodilatation och angiogenes ^1. Ändå är MRI ofta inte kan visa upplösningen av infektion under antibiotikabehandling som ihållande förbättring kan observeras i lederna hos patienter med kliniskt och biologiskt läkt septisk artrit på grund av ihållande förstorad extracellulära rummet (granulationsvävnad, fibrotisk ärr) ^2. Förutom extracellulära förändringar, inflammatoriska celler inkluderande en intensiv rekrytering av makrofager infiltrera massivt inkas synovia. Makrofager spelar en viktig roll i både akuta och kroniska fasen av bakteriell infektion ^3. De inducerar inflammatoriska reaktionen som krävs för att utrota patogena mikroorganismer, och samordna inflammation upplösning, såsom makrofag-inducerad inflammation kvarstår så länge nekrotiska vävnad inte tas bort, förhindrar reparation för att börja ^4. Således kan en minskning av makrofaginfiltrering inom infekterade synovia efter effektiv terapi vara en tillförlitlig indikator på upplösningen av infektionen. Cellular Imaging kan visa specifik cellulär infiltration i patologisk vävnad. Specifik makrofag MR avbildning med riktade kontrastmedel allmänt har undersökts och har visat sin förmåga att visa ledinflammation eller infektion ^5-7. Efter intravenös injektion, är sådana riktade kontrastmedel såsom USPIO (ultrasmall superparamagnetiska järnoxider) partiklar tas upp av fagocytiska celler såsom makrofager och,på grund av deras magnetiska egenskaper, inducera signalen ändras i vävnader som uppvisar makrofaginfiltrering ^8. Den längsgående uppföljning av de MR-signalen ändras terapi möjliggör en in vivo noninvasive utvärdering av makrofag-infiltrering, och en minskning av USPIO loaded-makrofager relaterade signalförändringar skulle visa terapi framgång. Syftet med denna rapport är att presentera hur man utför makrofag MR till noninvasively övervaka septisk artrit genom att visa en minskning av makrofaginfiltrering inom synovia.

Protocol

Alla förfaranden som innefattar djurförsök har godkänts av Universitetssjukhuset Institutional Animal Care kommittén.

Ett. Intraartikulär Bakteriell Inokulering

1. Före injektion söva kaniner genom intramuskulär injektion av ketamin (30 mg / kg kroppsvikt) blandat med xylazin (4 mg / kg) inom Erector Spinae muskel. Se till djuren är helt bedövad genom att kontrollera att de inte svarar på tass nypa. Detta protokoll ger tillräcklig anestesi för intraartikulär injektion av knäleden. Placera djuren under syrgasmask under anestesi.
2. Shave djurens knä. Förbered knäet för aseptisk injektion med 3 växlande dukarna i povidon-jod scrub och alkohol följt av tillämpning av povidon-jodlösning.
3. Manuellt identifiera knäskålssenan som en elastisk struktur vid den anteriora aspekten av knät med en steril nål lock såsom visas, eller en steril sond.
4. Injicera varje knä med 1 ml av en bakteriesuspension av Staphylococcus aureus (Neumann-stam) vid en koncentration av 10 ⁶ UFC / ml. En injektion utan motstånd bekräftar intraartikulär placering av spetsen på nålen.
5. Efter injektion procedurer, hålla djuret under konvektiva källa för att undvika värmeförluster och övervaka andningsfrekvens genom att observera rörelser av bröstkorgen. När vaken, hålla djur i burar med fri tillgång till mat och vatten.
6. Hantera smärta genom administrering av en intramuskulär injektion av 0,1 mg / kg buprenorfin varje 8 tim.
7. Kliniskt observera kaninerna varje dag, övervakning konsumerade kvantiteter av mat och vatten, viktminskning, temperatur, och allmänna beteende.
8. Till bilden den akuta fasen av infektion utför den första MR avbildning session så snartsom ett djur uppvisar betydande viktnedgång (10%), oftast detta sker efter ca 2 dagar.
9. Om intravenös administrering av läkemedel krävs innan MRT-undersökning, kunde en aurikulär venkateter installeras (se nedan).

2. MRT-undersökning

När avbildning levande djur, är en noggrann djur installation en viktig funktion för att säkerställa djurens komfort och optimal anestesi. Detta kommer att möjliggöra bästa bildåtergivning resultat och säkerställa en reproduktiv bild förvärv för longitudinella studier. På grund av storleken på djuret, är användningen av en klinisk-sized MR-enhet (1,5 T eller 3 T) mest lämplig. 8-kanals klinisk knä spole används eftersom det ger lämplig upplösning och kontrast-till-brusförhållandet för kanin knä prospektering.

1. Före installationen på imaging system, installera en perifer venös access via en öronvenen. Denna tillgång kommer att tjäna till att injicera kontrastmedel.
   1. Raka och desinficera örat.
   2. Sätt en 25 G kateter inuti laterala öronvenen.
   3. Bedöm permeabiliteten genom injektion av 1 ml sterilt fysiologiskt serum.
   4. Behåll katetern med självhäftande avlyssning.
2. Söva djuren genom intramuskulär injektion av ketamin (30 mg / kg kroppsvikt) blandat med xylazin (4 mg / kg). Djur är helt bedövad när de misslyckas med att svara på tass nypa. Placera en ansiktsmask på kanin, vilket ger syre med en flödeshastighet av 200 ml / min.
3. När helt bedövad, ta djur till MR-enheten. Placera djuren så att knäna är belägna i centrum av den MR spole. Placera djurens ben i fullständig förlängning, så att den långa axeln av skenbenet är parallell med MR bildbehandlingsenheten tabell. Använd kardborreband eller sandsäckar för att bibehålla optimal benställning.
4. Cardio-andningsövervakning av djuren krävs inte eftersomanestesi protokoll möjliggör djup anestesi på spontan andning, men djuren måste täckas för att undvika anestesi-inducerad värmeförlust.
5. MR-protokollet är i detalj i Tabell 1. Den genomsnittliga tiden för total förvärv inklusive optimal installation är ca 20 min.
6. Utför MR i olika plan. Ändå är det tvärgående plan knäna (vinkelrätt mot skenbenet) hänvisningen planen eftersom det säkerställer anatomiska reproducerbarhet Bildens position sekventiella longitudinella undersökningar och möjliggör optimal korrelation med histologiska snitt.
7. Vid slutförandet av icke kontrastförstärkt sekvenser, injicera UPSIO kontrastmedlet genom aurikulär venös access. Långsamt administrera järnoxidpartiklarna i en enda dos av 150 pmol Fe / kg. Skölj katetern genom injektion av 1 ml steril fysiologiskt serum.
8. Upprepa förbättrade GRE viktade sekvens 24 timmar efter injektionen. Denna försening gör att partiklarna ska fagocyterats avmakrofagerna.
9. För longitudinella studier som utvärderar droger effekt (antibiotika, steroider, anti-makrofag antikroppar, osv.), Upprepa sekventiella MR-undersökningar med hjälp av det ovan beskrivna protokollet.

Tre. Bildanalys

1. För longitudinell utvärdering utföra mätningar på samma anatomiska nivå, och definiera en lätt identifierbar landmärke. Till exempel är förvärvet genom axialplanet där den största diametern av knäskålen observeras ett tillförlitligt sätt att få reproducerbara mätningar (Figur 1).
2. Utför bildanalys med hjälp av en DICOM-baserad programvara (t.ex. OsiriX) eller bildbehandlingsprogram (ImageJ).
3. Använda ImageJ mjukvara, utföra segmenteringen av synovial område som visar signal förlust på USPIO-förstärkt GRE T2-viktad bild med "irreguljär området" ritverktyg. När synovium med mörka signaler beskrivs, klicka på "Analyze" för att få området /antalet pixlar (figur 2).

Representative Results

På icke kontrastförstärkt bilder, presenterar synoviumen av infekterade knän en diffus svullnad av intermediär signal som är icke särskiljas från omgivande mjukdelar, medan lårbenet och patella visas som låga signalnivåer strukturer (Figur 1).

På USPIO-förstärkta bilder, kommer 24 timmar efter kontrastmedlet administration, synovial område som innehåller USPIO-lastade makrofager visa signalförlust (figur 1 och 2).

Makrofaginfiltrering inom synoviumen kan påvisas med hjälp av specifika immunfärgning (Figur 3). Perls "Prussian blånad kan detektera järn partiklar, som visas som blå prickar (Figur 4).

	GRE T2 viktade
Repetition tid (ms)	450
Echo tid (ms)	4	Flip vinkel	30
Turbo faktor
Fett undertryckande
Slice tjocklek (mm)	1,5
Intervall gap	0
Synfält (mm)	70
Matrix	448 x 360
Bandbredd	80
Signaler förvärvade	2
Scan längd	3'10

Tabell 1. Exempel på parametrar för GRE T2-viktade MR-sekvens på en 3T MR-enhet.

Figur 1. Axial GRE T2-viktade bilder av en kanin knä vid akutafasen av infektion, före (A) och 24 h efter (B) intravaskulär administrering av USPIO; är bilder genomgått de studier av knäskålen (p) och lårbenet (f). På den icke kontrastförstärkt bild (A), är synovium förtjockad (pil) och presenterar en homogen mellansignal otydligt från omgivande mjuka vävnader. Efter USPIO administrering (B), visas synovium nu som ett band-liknande område av massivt mörka signaler (pilspets) på grund av närvaron av USPIO-laddade makrofager. (Omtryckt från Lefevre S. et al. ⁹ med tillstånd).

Figur 2. Segmentering och bestämning av synovial område som presenterade signalförlust med ImageJ.

Figur 3. Photomicrograph av specifika makrofag immunofärgningen visar den intensiva infiltration av makrofager i den infekterade synovium (pil). (RAM 11 immunostaining, ursprunglig förstoring 40X).

Figur 4. Mikrofotografi (Perls 'berlinerblått fläck, ursprunglig förstoring 40X) visar flera blå-färgade celler correspondig till de USPIO-laddade makrofager (pil). (Utdrag ur Lefevre S. et al. ⁹ med tillstånd).

Discussion

Medan ospecifika gadolinium-baserade kontrastmedel ger information om volym och perfusion av det extracellulära utrymmet, gör makrofag avbildning av USPIO-förstärkt MR en exakt anatomisk lokalisering och en kvalitativ utvärdering av makrofaginfiltrering inom infekterade synovialmembran utan behov av vävnad provtagning ^9. På grund av deras höga känslighet, kan USPIO påvisa ens subtila cellulära infiltrera närvarande i de tidiga faserna av infektionen. Under framgångsrik antibiotikabehandling, eftersom patogener successivt bort, är denna infiltration anses minska, vilket leder till en minskning av USPIO upptag inom synoviumen. Eftersom området för mörka signaler är korrelerad till tissular järnhalten kan synovial signal efter USPIO administrering betraktas som en biomarkör, en kvantitativ representation av cellulär infiltration som kan vara längsgående utvärderas ^10. Dessutom, och i motsats till andra avbildningsmetoder såsom optical imaging eller isotopisk avbildning, cellulär MR-avbildning har förmågan att generera högupplösta anatomiska bilder som möjliggör exakt lokalisering av celler-relaterade signalförändringar.

Macrophage bildbehandling gör uppskattningen av cellens närvaro och distribution inom vävnaden av intresse utan behov av vävnad provtagning. Man undviker därför två huvudsakliga nackdelarna med upprepad vävnad provtagning ofta krävs i in vivo biologiska studier som är invasiv och modifiering av naturliga vävnaden normal biologi. Dessutom kan sekventiell vävnadsprovtagning inte vara möjligt i små djur som inte tål upprepade stressande förfaranden, något som utesluter längsgående utvärdering. Däremot i vivo uppföljning avbildning av makrofag innehåll inom en vävnad med användning sekventiell USPIO-förstärkt MR scanning lätt kan tillämpas på små djur för längsgående övervakning av antibiotikabehandling i smittosam sjukdom antiinflammatorisk terapi i modeller av Noninfectious artrit, eller behandling i någon makrofager-involverade sjukdomar.

När modellen av intresse väljs (artrit, septisk synovit, osv.), Är kontrastmedel administration enkelt utföras genom långsam intravaskulär injektion och är i allmänhet inte tekniskt utmanande. Den största begränsningen av MR cellulär avbildning med USPIO kontrastmedel är behovet av upprepade skanning 24 hr injektion, denna fördröjning låta specifika fagocytos av makrofager ^5-7. Därför, för att ha jämförbara bilddata, är en exakt djur installation inom MR-enheten obligatorisk. I vår erfarenhet, konstaterade vi att djur installation i liggande ställning inom MR spole samband med underbenet fullständig förlängning erhålls genom självhäftande tejpning tillät mycket reproducerbara och jämförbara bilder.

Vi presenteras i denna rapport hur lätt att märka in vivo makrofager med USPIO, dra fördel av sin naturligafagocytiska aktiviteten. Även om en ytterligare preliminär ex vivo förfarande kan komma att krävas (för att möjliggöra penetrering kontrastmedlet in ej naturligt-fagocytiska celler), kan cellmärkning med mycket känsliga MR kontrastmedel såsom järnoxidpartiklar appliceras på andra celltyper såsom lymfocyter, polymorfonukleära leukocyter eller mastceller. Cellular MR kan därför vara ett mycket intressant verktyg för icke-invasiv undersökning av sekventiella rekrytering av alla celltyper är involverade i infektion-relaterad inflammation, och att utvärdera effekterna av den generella såväl som cell-inriktade terapier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122