In vivo Macrophage Imaging bruke MR Målrettet kontrastmiddel for Langsgående Evaluering av septisk artritt

Summary

Vi viser hvordan du utfører makrofag MR avbildning ved hjelp ultrasmall superparamagnetiske kontrastmiddel (USPIO) i septisk artritt, slik at en innledende og langsgående

Abstract

Makrofager er nøkkel-celler i initiering, utvikling og reguleringen av den inflammatoriske respons på bakteriell infeksjon. Makrofager er intensivt og i økende grad rekruttert i septisk leddene fra de tidlige fasene av infeksjon og infiltrasjon er ment å regress gang effektiv fjerning av patogener oppnås. Evnen til å identifisere in vivo makrofager aktivitet i en infisert felles kan derfor gi to viktigste programmene: Tidlig påvisning av akutt synovitt og overvåking av behandlingen.

In vivo-invasiv påvisning av makrofager kan utføres med magnetic resonance imaging bruker jern nanopartikler som ultrasmall superparamagnetiske jernoksid (USPIO). Etter intravaskulær eller intraartikulær administrasjon, er USPIO spesielt phagocytized av aktiverte makrofager, og på grunn av deres magnetiske egenskaper, indusere signal forandringer i vev presentere makrofaginfiltrering. En quantitative evaluering av infiltrere er gjennomførbart, som området med signaltap (antall mørke piksler) observert på gradient ekko-MR-bilder etter injeksjon partikler er korrelert med mengden av jern i vevet og således reflekterer antall USPIO-lastede celler.

Vi presenterer her en protokoll for å utføre makrofag avbildning ved hjelp USPIO-enhanced MR i en dyremodell av septisk artritt, slik at en innledende og langsgående in vivo-invasiv evaluering av makrofager infiltrasjon og en vurdering av terapi handling.

Introduction

Magnetic resonance imaging (MRI) er ansett å være den avbildningsfunksjonalitet valgfrihet for demonstrasjon av smittsomme synovitis grunn av høy romlig oppløsning og bløtvev kontrast. Signal observerte endringene på MR i leddgikt lav T1 og høy T2 signal gjenspeiler økt nærvær av ekstracellulær vanninnhold, og en markert forbedring etter gadolinium basert-kontrastmiddel administrasjon, i samsvar med histologisk funn av økt vascularity grunn til vasodilatasjon og angiogenese ^en. Likevel er MR ofte ikke i stand til å demonstrere oppløsning for smitte under antibiotikabehandling som vedvarende forbedring kan observeres i leddene av pasienter med klinisk og biologisk helbredet septisk artritt skyldes vedvarende forstørret ekstracellulært rom (granulasjonsvev, fibrotic arr) ^2. Foruten ekstracellulære endringer, inflammatoriske celler, inkludert en intens rekruttering av makrofager massivt infiltrere ifullkommengjort synovia. Makrofager spiller en viktig rolle i både den akutte og kroniske fase av bakteriell infeksjon ^3.. De indusere den inflammatoriske reaksjon som kreves for å fjerne patogene mikroorganismer, og koordinere betennelse oppløsning, som makrofag-indusert inflammasjon vedvarer så lenge som nekrotiske vev ikke er fjernet, forhindrer reparasjon å begynne ^4.. Dermed kan reduksjonen av makrofaginfiltrering innen infiserte synovia etter effektiv terapi være en pålitelig indikator for oppløsningen av infeksjonen. Cellular bildebehandling er i stand til å demonstrere bestemt cellulær infiltrasjon inne patologisk vev. Spesifikk makrofag MR avbildning ved hjelp av målrettet kontrastmiddel har vært mye undersøkt og har vist sin evne til å demonstrere felles betennelse eller infeksjon ^5-7. Etter intravenøs injeksjon, er slike målrettede kontrastmidler som USPIO (ultrasmall superparamagnetiske jernoksider) partiklene tatt opp av fagocytiske celler slik som makrofager og,på grunn av deres magnetiske egenskaper, indusere signal endringer i vev presentere makrofaginfiltrering ^åtte. Den langsgående oppfølging av de MR signal endringer terapi gir en in vivo-invasiv evaluering av makrofaginfiltrering, og en reduksjon på USPIO lastet-makrofager relaterte signalendringer ville demonstrere terapi suksess. Hensikten med denne rapporten er å presentere hvordan du utfører makrofag MR imaging til invasivt overvåke septisk artritt ved å demonstrere reduksjon av makrofaginfiltrering innenfor synovia.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Universitetssykehuset Institutional Animal Care komiteen.

En. Intraarticular Bakteriell Inoculation

1. Før injeksjon anesthetize kaniner ved hjelp av intramuskulær injeksjon av ketamin (30 mg / kg kroppsvekt) som er blandet med xylazin (4 mg / kg) i løpet av Erector spinae muskel. Sikre dyrene er fullt bedøvet ved å sjekke at de ikke klarer å svare på labben klemme. Denne protokollen gir tilstrekkelig anestesi for intraartikulær injeksjon av kneleddet. Plasser dyrene i henhold oksygenmaske under anestesi.
2. Barbere dyrenes kneet. Forbered kneet for aseptisk injeksjon av tre vekslende våtservietter av povidonjodid kratt og alkohol etterfulgt av anvendelsen av povidon-jod-løsning.
3. Manuelt identifisere patellarsenen som en elastisk struktur ved den fremre del av kneet ved hjelp av en steril nål hetten som vist, eller en steril sonde.
4. Injiser hvert kne med 1 ml av en bakteriesuspensjon av Staphylococcus aureus (Neumann-stamme) ved en konsentrasjon på 10 ⁶ UFC / ml. En injeksjon uten motstand bekrefter intraartikulær plasseringen av tuppen av nålen.
5. Etter injeksjon prosedyrer, holde dyret i henhold konvektive kilde for å unngå varmetap og overvåke respirasjonsfrekvens ved å observere bevegelse av brystkassen. Når våken, holde dyr i bur med fri tilgang til mat og vann.
6. Administrer smerte ved administrering av en intramuskulær injeksjon av 0,1 mg / kg buprenorfin hver 8. time.
7. Klinisk observere kaniner hver dag, overvåking konsumert mengder mat og vann, vekttap, temperatur, og generell oppførsel.
8. Å avbilde den akutte fasen av infeksjonen utføre den første MR session så snartsom et dyr presenterer betydelig vekttap (10%); dette vanligvis skjer etter ca 2 dager.
9. Hvis intravenøs behandling med slike legemidler er nødvendig før MR-undersøkelse, kan en aurikulær venøs tilgang installeres (jf. nedenfor).

2. MR-undersøkelse

Når bildebehandling levende dyr, er et forsiktig dyr installasjon en viktig funksjon for å sikre dyr komfort og optimal anestesi. Dette vil gi rom for best tenkelig resultater og sikre en reproduktiv image oppkjøpet for longitudinelle studier. På grunn av størrelsen av dyret, er bruken av en klinisk størrelse MR enhet (1,5 T eller T 3) mest egnet. 8-kanals klinisk kne kveil er brukt som den gir passende oppløsning og kontrast-til-støy-forholdet for kanin kne leting.

1. Før installasjon på imaging system, installere en perifer venøs tilgang gjennom en auricular vein. Denne tilgangen vil tjene til å injisere kontrastmidlet.
   1. Barbering og desinfisere øret.
   2. Sett inn en 25 G kateter inne i lateral auricular vein.
   3. Vurdere permeabilitet ved injeksjon av 1 ml sterilt fysiologisk serum.
   4. Opprettholde kateteret med lim tapping.
2. Anesthetize dyrene ved hjelp av intramuskulær injeksjon av ketamin (30 mg / kg kroppsvekt) som er blandet med xylazin (4 mg / kg). Dyr er fullt bedøvet når de ikke klarer å svare på labben klemme. Plasser en ansikts-maske på kaninen, gir det oksygen med en strømningshastighet på 200 ml / min.
3. Når du er fullt bedøvet, ta dyrene til MR-enheten. La dyr, slik at knærne er lokalisert i sentrum av det MR coil. Plasser dyrenes ben i fullstendig forlengelse, slik at den lange akse av tibia er parallell med MR avbildning enhet tabell. Bruk borrelåser eller sandsekker for å opprettholde optimal benstilling.
4. Kardiorespiratorisk overvåking av dyrene er ikke nødvendig somanestesi-protokollen tillater dyp anestesi på spontan pusting, men dyrene må dekkes for å unngå anestesi-indusert varmetap.
5. MR-protokollen er beskrevet i Tabell 1.. Den gjennomsnittlige tiden for total anskaffelse inkludert optimal installasjon er ca 20 min.
6. Utfør MR i forskjellige plan. Ikke desto mindre er den tverrgående plan av knærne (ortogonal til tibia) referansen plan som den sikrer anatomiske reproduserbarheten bildeposisjon for sekvensiell langsgående undersøkelser og tillater optimal korrelasjon med histologiske snitt.
7. Ved ferdigstillelse av unenhanced sekvenser, injisere UPSIO kontrastmiddel gjennom aurikulær venøs tilgang. Sakte administrere jernoxydpartikler i en enkelt dose på 150 umol Fe / kg. Skyll kateteret ved injeksjon av 1 ml sterilt fysiologisk serum.
8. Gjenta den forbedrede GRE vektet sekvens 24 timer etter injeksjonen. Denne forsinkelsen tillater at partiklene som skal phagocytized vedmakrofagene.
9. For longitudinelle studier som evaluerte narkotika effekt (antibiotika, steroider, anti-makrofag antistoffer, etc.), Gjenta sekvensielle MR undersøkelser ved hjelp av den ovenfor beskrevne protokollen.

3. Bildeanalyse

1. For langsgående evaluering utføre målinger på samme anatomiske nivå, og definere en lett identifiserbar landemerke. For eksempel er ervervet gjennom aksialplan hvor den største diameter av patella det observeres en pålitelig måte for å oppnå reproduserbar måling (figur 1).
2. Utfør bildeanalyse ved hjelp av en DICOM-basert programvare (for eksempel Osirix) eller en bildebehandling (ImageJ).
3. Ved hjelp ImageJ programvare, utføre segmentering av synovial område som demonstrerer signaltap på USPIO-enhanced GRE T2-vektet bilde ved hjelp av "irregulær området" tegneverktøy. Når synovium med mørk signal er skissert, klikk på "Analyze" for å få området /antall piksler (figur 2).

Representative Results

På unenhanced bilder, presenterer synovium av infiserte knær en diffus hevelse av mellomliggende signal som ikke kan skjelnes fra det omgivende myke vev, mens femur og patella vises så lave signalnivåer strukturer (figur 1).

På USPIO-forbedrede bilder, vil 24 timer etter at kontrastmiddelet administrasjon, synovial område inneholdende USPIO-lastet makrofager demonstrere signaltap (figur 1 og 2).

Makrofaginfiltrering innenfor synovium kan påvises ved anvendelse av spesifikk farging (fig. 3). Perls 'prøyssiske blå flekken kan oppdage jern partikler, som vises som blå prikker (figur 4).

	GRE T2 vektet
Repetisjon tid (ms)	450
Echo tid (ms)	4	Vend vinkel	30
Turbo faktor
Fat undertrykkelse
Slice tykkelse (mm)	1.5
Intervall gap	0
Synsfelt (mm)	70
Matrix	448 x 360
Båndbredde	80
Signaler kjøpt	2
Skanne lengde	3'10

Tabell 1. Eksempel på parametere av GRE T2-vektet MR-sekvens på en 3T MR enhet.

Figur 1. Axial GRE T2-vektede bilder av en kanin kne ved akuttefase av infeksjonen, før (A) og 24 timer etter (B) for intravaskulær administrering av USPIO; bildene skal hentes på nivået av patella (p) og femur (f). På unenhanced bilde (A), er synovium tykkere (pil) og presenterer en homogen middels signal utydelig fra omkringliggende bløtvev. Etter USPIO administrering (B), vises nå synovium som band-lignende område i massivt mørke signal (pilspiss) på grunn av tilstedeværelsen av USPIO-lastet makrofager. (Gjengitt fra Lefevre S. et al. ⁹ med tillatelse).

Figur 2. Segmentering og bestemmelse av synovial området som presenteres signaltap hjelp ImageJ.

Figur 3.. Mikrofotografi av spesifikke makrofag farging demonstrerer den intense infiltrasjon av makrofager innenfor den infiserte synovium (pil). (RAM 11 farging, original forstørrelse 40X).

Figur 4. Mikrofotografi (Perls 'prøyssiske blå flekken, original forstørrelse 40X) viser flere blå-fargede celler correspondig til USPIO-lastet makrofager (pil). (Gjengitt fra Lefevre S. et al. ⁹ med tillatelse).

Discussion

Mens uspesifikke gadolinium-baserte kontrastmidler gi informasjon om volum og perfusjon av ekstracellulært rom, kan makrofag avbildning av USPIO-enhanced MR en presis anatomisk lokalisering og en kvalitativ vurdering av makrofaginfiltrering innen infiserte synovium uten behov for prøvetaking av vev ^ni. På grunn av sin høye følsomhet, kan USPIO demonstrere selv subtile cellular infiltrere stede i de tidlige fasene av infeksjon. Under vellykket antibiotikabehandling patogener blir progressivt fjernet, er denne infiltrering anses å minke, noe som fører til reduksjon av USPIO opptak i synovium. Som området av mørk signal er korrelert til tissular jerninnhold, kan synovial signal etter USPIO administrering bli betraktet som en biomarkør, en kvantitativ representasjon av cellulær infiltrasjon som kan være langsgående evaluert ^10.. I tillegg, og i motsetning til andre imaging modaliteter som optical avbildning eller isotoper bildebehandling, cellular MR har evnen til å generere høy oppløsning anatomiske bilder som tillater presis lokalisering av celler-relaterte signal endringer.

Macrophage avbildning tillater estimering av cellen tilstedeværelse og fordeling innenfor vev av interesse uten behov for prøvetaking av vev. Det unngår derfor to viktigste ulempene ved gjentatt prøvetaking av vev ofte kreves i in vivo biologiske studier som er invasiveness og modifikasjon av innfødte vev normal biologi. Dessuten kan sekvensiell prøvetaking av vev ikke være mulig i små dyr som ikke tåler gjentatte stressende prosedyrer, utelukker langsgående evaluering. I kontrast, in vivo oppfølging avbildning av makrofag-innhold innenfor et vev ved hjelp av sekvensiell USPIO-forbedret MR-skanning kan lett anvendes på små dyr for den langsgående overvåking av antibiotisk terapi i infeksjonssykdommer, av anti-inflammatorisk terapi i modeller av Noninsmittsomme leddgikt, eller behandling i noen makrofager-involverte sykdommer.

Når modellen av interesse er valgt (leddgikt, septisk synovitt, etc.), Er kontrastmiddel administrasjon lett utføres gjennom langsom intravaskulær injeksjon og er generelt ikke teknisk utfordrende. Den viktigste begrensning av MR mobilnettet avbildning ved hjelp USPIO kontrastmiddel er behovet for gjentatt skanning 24 timers injeksjon, denne forsinkelsen slik at den spesifikke fagocytose av makrofager ^5-7. Derfor, for å få sammenlignbare imaging data, er en nøyaktig dyr installasjon innenfor MR enhet obligatorisk. I vår erfaring, observerte vi at dyr installasjon i liggende stilling innenfor MR spolen assosiert med leggen komplett forlengelse innhentet av limet taping tillatt svært reproduserbare og sammenlignbare bilder.

Vi presenteres i denne rapporten hvordan du enkelt merke in vivo makrofager med USPIO, drar nytte av deres naturligefagocytisk aktivitet. Selv om en ekstra innledende ex vivo prosedyre kan være nødvendig (for å tillate kontrastmiddel penetrasjon inn ikke er naturlig-fagocytiske celler), kan celle merking med svært følsom MR-kontrastmiddel, for eksempel jernoxydpartikler anvendes på andre celletyper slik som lymfocytter, polymorfonukleære leukocytter eller mastceller. Cellular MR kan derfor være en meget interessant verktøy for invasivt etterforskningen av sekvensiell rekruttering av alle celletyper som er involvert i infeksjon-relaterte betennelse, og å evaluere virkningen av general samt celle-målrettet terapi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122