Summary
ونحن لشرح كيفية تنفيذ بلعم MR التصوير باستخدام الصغر مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic عامل تباين (USPIO) في التفسخ التهاب المفاصل، مما يسمح أولية والطولية
Abstract
الضامة هي خلايا رئيسية في بدء وتطوير وتنظيم الاستجابة الالتهابية للعدوى البكتيرية. يتم بشكل مكثف ومتزايد المعينين الضامة في المفاصل التفسخ من المراحل المبكرة من العدوى ويفترض أن تسلل إلى الوراء مرة واحدة يتم الحصول على إزالة فعالة من مسببات الأمراض. وبالتالي يمكن أن القدرة على تحديد النشاط في الجسم الحي في بلعم مشتركة المصابة توفير اثنين من التطبيقات الرئيسية: الكشف المبكر عن داء التهاب الغشاء المفصلي الحاد ورصد العلاج.
في الجسم الحي كشف موسع الضامة لا يمكن أن يؤديها مع التصوير بالرنين المغناطيسي استخدام الجسيمات النانوية مثل الحديد الصغر أكسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (USPIO). بعد تناوله داخل الأوعية الدموية أو داخل المفصل، USPIO يتم phagocytized على وجه التحديد من قبل الضامة تفعيلها، و، نظرا لخواصها المغناطيسية، تحدث تغييرات في الأنسجة إشارة تقديم تسلل البلاعم. A quantitativالتقييم (ه) من التسلل ممكنا، كما المنطقة مع فقدان إشارة (عدد البكسل الظلام) لوحظ على التدرج صدى صور الرنين المغناطيسي بعد حقن جزيئات يرتبط مع كمية من الحديد داخل الأنسجة، وبالتالي يعكس عدد الخلايا USPIO محملة.
نقدم هنا البروتوكول لأداء التصوير بلعم باستخدام USPIO محسنة MR التصوير في نموذج حيواني من التهاب المفاصل التفسخ، مما يسمح أولية والطولية في تقييم موسع المجراة من الضامة التسلل وتقييما لعمل العلاج.
Introduction
يعتبر التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لتكون طريقة التصوير من خيار للمظاهرة من الزليل المعدية نتيجة لقرارها مكانية عالية وعلى النقيض من الأنسجة الرخوة. التغيرات إشارة لوحظ على التصوير بالرنين المغناطيسي في التهاب المفاصل منخفض T1 وإشارة T2 عالية مما يعكس تزايد وجود محتوى الماء خارج الخلية، وتعزيز ملحوظ بعد الجادولينيوم الإدارة وكيل القائم على النقيض من ذلك، بما يتفق مع النتائج التي توصل إليها تشريحيا زيادة الأوعية الدموية بسبب توسع الأوعية والأوعية الدموية 1. ومع ذلك، التصوير بالرنين المغناطيسي هو في كثير من الأحيان غير قادر على إثبات القرار من عدوى أثناء العلاج بالمضادات الحيوية كما يمكن ملاحظة زيادة المستمرة في مفاصل المرضى الذين يعانون سريريا وبيولوجيا تلتئم التفسخ التهاب المفاصل بسبب استمرار الفضاء خارج الخلية الموسع (النسيج الحبيبي، ندبة متليفة) 2. وإلى جانب التغييرات خارج الخلية، الخلايا الالتهابية بما في ذلك تجنيد مكثفة من الضامة التسلل على نطاق واسع لفيالمصابة الزليل. الضامة تلعب دورا رئيسيا في كل من المرحلة الحادة والمزمنة من العدوى البكتيرية 3. أنها تحفز رد فعل للالتهابات المطلوبة للقضاء على الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض، وتنسيق القرار التهاب، كما استمرت التهاب البلاعم التي يسببها طالما لا تتم إزالة الأنسجة نخرية، ومنع إصلاح لبدء 4. وبالتالي، يمكن الحد من تسلل داخل البلاعم الزليل المصابة بعد العلاج الفعال يكون مؤشرا موثوقا من القرار من العدوى. الخلوية التصوير هو قادرة على إثبات تسلل الخلوية محددة داخل الأنسجة المرضية. محددة بلعم MR التصوير باستخدام استهدفت وقد تم التحقيق عامل تباين على نطاق واسع وأثبتت قدرته على إظهار التهاب المفاصل أو التهاب 5-7. بعد الحقن في الوريد، وتؤخذ هذه عوامل التباين المستهدفة مثل USPIO (الصغر أكاسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic) جزيئات من قبل الخلايا البلعمية مثل الضامة و،نظرا لخواصها المغناطيسية، تحدث تغييرات في الأنسجة إشارة تقديم بلعم تسلل 8. والطولية متابعة تلك إشارة MR العلاج التغيرات يسمح لفي تقييم موسع المجراة من تسلل بلعم، وسيكون تخفيض USPIO محملة-الضامة التغييرات إشارة ذات صلة تثبت نجاح العلاج. والغرض من هذا التقرير هو تقديم كيفية تنفيذ بلعم MR التصوير لرصد noninvasively التهاب المفاصل الصرف الصحي من خلال البرهنة على الحد من تسلل البلاعم داخل الزليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المؤسسية للجنة رعاية الحيوان جامعة مستشفى.
1. التلقيح البكتيري داخل المفصل
- قبل الحقن، وتخدير الأرانب عن طريق الحقن العضلي الكيتامين (30 ملغ / كغ من وزن الجسم) مختلطة مع زيلازين (4 ملغ / كلغ) داخل المركب شوكات العضلات. ضمان الحيوانات هي تخدير كامل عن طريق التحقق أنها تفشل في الاستجابة لقرصة مخلب. يوفر هذا البروتوكول التخدير كافية لحقن داخل المفصل من مفصل الركبة. وضع الحيوانات تحت قناع الأكسجين أثناء التخدير.
- حلاقة الركبة الحيوانات. إعداد الركبة للحقن معقمة بنسبة 3 مناديل بالتناوب من فرك بوفيدون اليود والكحول ثم طلب من حل بوفيدون اليود.
- تحديد يدويا الوتر الرضفي كهيكل مرونة في الجانب الأمامي من الركبة باستخدام غطاء إبرة معقمة كما هو مبين أو تحقيق العقيمة.
- حقن كل الركبة مع 1 مل من تعليق البكتيرية من المكورات العنقودية الذهبية (سلالة نيومان) عند تركيز 10 6 UFC / مل. حقنة دون مقاومة يؤكد موقع داخل المفصل من رأس الإبرة.
- بعد إجراءات الحقن، والحفاظ على الحيوان تحت مصدر الحمل الحراري لتجنب فقدان الحرارة ورصد معدل التنفس من خلال مراقبة حركة الصدر. مرة واحدة مستيقظا، والحفاظ على الحيوانات في أقفاص مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
- إدارة الألم عن طريق إعطاء حقنة في العضل من 0.1 ملغ / كغ كل 8 بوبرينورفين ساعة.
- مراقبة سريريا الأرانب كل يوم، ومراقبة الكميات المستهلكة من الطعام والماء، وفقدان الوزن، ودرجة الحرارة، والسلوك العام.
- لصورة المرحلة الحادة من الإصابة تنفيذ أول دورة التصوير MR في أقرب وقتكما يعرض حيوان فقدان الوزن كبيرة (10٪)؛ عموما يحدث هذا بعد حوالي 2 أيام.
- إذا كان مطلوبا الدواء عن طريق الوريد قبل الفحص بالرنين المغناطيسي، يمكن تثبيت وصول وريدي أذني (راجع أدناه).
2. فحص التصوير بالرنين المغناطيسي
عندما التصوير الحيوانات الحية، تثبيت الحيوان الحذر هو سمة أساسية لضمان راحة الحيوان والتخدير الأمثل. وهذا سوف يسمح للحصول على أفضل نتائج التصوير، وضمان الحصول على الصور الإنجابية للدراسات طولية. ونظرا لحجم الحيوان، واستخدام وحدة MR السريرية بحجم (1.5 T أو T 3) هو الأكثر ملاءمة. يستخدم 8 قنوات لفائف الركبة السريرية، حيث أنه يوفر قرار مناسب ونسبة التباين إلى الضجيج للتنقيب في الركبة أرنب.
- قبل التثبيت على نظام التصوير، تثبيت الوصول الوريدية الطرفية من خلال الوريد الأذني. وسوف تخدم هذا الوصول لحقن عامل تباين.
- الحلاقة وتطهير الأذن.
- إدراج القسطرة G 25 داخل الوريد الأذني الجانبي.
- تقييم النفاذية عن طريق الحقن من 1 مل مصل الفسيولوجية العقيمة.
- الحفاظ على القسطرة مع التنصت لاصق.
- تخدير الحيوانات عن طريق الحقن العضلي الكيتامين (30 ملغ / كغ من وزن الجسم) مختلطة مع زيلازين (4 ملغ / كلغ). الحيوانات هي تخدير كامل مرة واحدة فشلوا في الرد على قرصة مخلب. وضع قناع الوجه على الأرنب، ويعطيها الأكسجين بمعدل تدفق 200 مل / دقيقة.
- مرة واحدة تخدير كامل، واتخاذ الحيوانات إلى وحدة التصوير MR. مكان الحيوانات بحيث الركبتين وتقع في وسط لفائف MR. وضع أرجل الحيوانات في تمديد كاملة، بحيث محور طويل من الساق موازية للMR التصوير طاولة وحدة. استخدام السحابات الفيلكرو أو أكياس الرمل للحفاظ على الموقف الأمثل الساق.
- ليس مطلوبا مراقبة القلب والجهاز التنفسي من الحيوانات مثلبروتوكول يسمح التخدير التخدير العميق على التنفس التلقائي، ولكن الحيوانات لا بد من تغطيتها لتجنب فقدان الحرارة الناجم عن التخدير.
- وترد تفاصيل بروتوكول MR في الجدول 1. متوسط الوقت لاقتناء الكلي بما في ذلك التثبيت الأمثل هو حوالي 20 دقيقة.
- أداء MR التصوير في طائرات مختلفة. ومع ذلك، فإن الطائرة عرضية من الركبتين (متعامدة على الساق) هو خطة مرجعية لأنه يضمن استنساخ التشريحية للموقف صورة للامتحانات طولية متتابعة ويسمح ارتباط الأمثل مع شرائح نسيجية.
- عند الانتهاء من تسلسل غير معززة، حقن عامل تباين UPSIO من خلال وصول وريدي أذني. إدارة ببطء جزيئات أكسيد الحديد في جرعة واحدة من 150 ميكرومول الحديد / كجم. شطف القسطرة عن طريق الحقن من 1 مل من المصل الفيزيولوجي المعقم.
- كرر GRE تعزيز مرجح تسلسل 24 ساعة بعد الحقن. هذا التأخير يسمح للجزيئات أن phagocytized من قبلالضامة.
- للدراسات طولية تقييم تأثير الأدوية (المضادات الحيوية، والمنشطات، والأجسام المضادة لمكافحة بلعم، الخ.)، كرر الامتحانات MR متتابعة باستخدام بروتوكول المبين أعلاه.
3. تحليل الصور
- لتقييم أداء قياسات الطولية في نفس المستوى التشريحي، وتحديد معلما يسهل التعرف عليها. على سبيل المثال، من خلال اقتناء الطائرة محوري حيث لوحظ أكبر القطر من الرضفة هو وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحصول على قياس استنساخه (الشكل 1).
- أداء تحليل الصور باستخدام البرامج المستندة إلى DICOM (مثل سيريكس) أو برامج معالجة الصور (يماغيج).
- باستخدام برنامج ImageJ، نفذ تجزئة للمنطقة الزليلي الذي يوضح فقدان إشارة على USPIO محسنة GRE صورة T2 المرجحة باستخدام "غير النظامية منطقة" أداة الرسم. مرة واحدة تم تفصيلها الغشاء الزليلي مع إشارة الظلام، انقر على "تحليل" للحصول على مساحة /عدد وحدات البكسل (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على الصور غير معززة، والغشاء الزليلي من الركبتين المصابة يعرض تورم منتشر على إشارة المتوسطة التي هي غير تمييزها عن المناطق المحيطة الأنسجة الرخوة، في حين عظم الفخذ والرضفة تبدو وكأنها هياكل إشارة منخفضة (الشكل 1).
على الصور USPIO محسنة، و24 ساعة بعد إدارة كيل النقيض، منطقة الزليلي تحتوي على الضامة USPIO محملة إثبات فقدان إشارة (الشكلان 1 و 2).
يمكن البرهنة تسلل البلاعم داخل الغشاء الزليلي باستخدام المناعية محددة (الشكل 3). بيرلز البروسي الأزرق وصمة عار يمكن الكشف عن جزيئات الحديد، والتي تبدو وكأنها النقاط الزرقاء (الشكل 4).
| GRE T2 المرجحة | |||
| الوقت التكرار (ميللي ثانية) | 450 | ||
| صدى الوقت (ميللي ثانية) | 4 | الوجه زاوية | 30 |
| عامل توربو | |||
| قمع الدهون | |||
| شريحة سمك (مم) | 1.5 | ||
| الفجوة الفاصلة | 0 | ||
| مجال الرؤية (مم) | 70 | ||
| قالب | 448 X 360 | ||
| عرض النطاق الترددي | 80 | ||
| التقط إشارات | 2 | ||
| تفحص طول | 3'10 |
الجدول 1. مثال على المعلمات من GRE T2 المرجحة تسلسل MR على وحدة MR 3T.
الشكل 1. GRE المحوري الصور T2 المرجحة من الركبة أرنب في الحادةمرحلة من مراحل العدوى، وقبل (A) و 24 ساعة بعد (ب) الإدارة داخل الأوعية الدموية من USPIO؛ ويتم الحصول على الصور على مستوى الرضفة (ع) وعظم الفخذ (F). على صورة غير معززة (A)، والغشاء الزليلي هو سميكة (السهم)، ويقدم إشارة وسيطة غير واضحة متجانسة من الأنسجة الرخوة المحيطة بها. بعد إدارة USPIO (B)، يظهر الغشاء الزليلي الآن كمنطقة مثل عصابة من إشارة الظلام على نطاق واسع (رأس السهم) وذلك بسبب وجود الضامة USPIO محملة. (نقلا عن لوفيفر S. وآخرون. 9 بإذن).
الشكل 2. الإنقسام وتحديد منطقة الزليلي التي قدمت فقدان إشارة باستخدام يماغيج.
الشكل (3). صورة مجهرية من المناعية بلعم محددة يوضح تسلل مكثفة من الضامة داخل الغشاء الزليلي المصابة (السهم). (RAM 11 المناعية، التكبير الأصلي 40X).
الشكل 4. صورة مجهرية (بيرلز البروسي الأزرق وصمة عار، التكبير الأصلي 40X) يبين متعددة الخلايا الزرقاء الملطخة correspondig إلى الضامة USPIO محملة (السهم). (نقلا عن لوفيفر S. وآخرون. 9 بإذن).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين توفر عوامل التباين القائم الجادولينيوم غير محدد معلومات عن حجم ونضح من الفضاء خارج الخلية، بلعم التصوير بواسطة USPIO محسنة MR يسمح للتوطين التشريح الدقيق والتقييم النوعي للتسلل داخل الغشاء الزليلي البلاعم المصابة دون الحاجة إلى أخذ عينات الأنسجة 9. ونظرا لحساسيتها عالية، ويمكن أن تثبت حتى USPIO الخلوية خفية التسلل الحالي في المراحل المبكرة من العدوى. تحت العلاج بالمضادات الحيوية ناجحة كما يتم إزالة تدريجيا مسببات الأمراض، ويعتبر هذا التسلل، في الانخفاض، مما يؤدي إلى الحد من امتصاص USPIO داخل الغشاء الزليلي. كما يرتبط مجال إشارة الظلام لمحتوى الحديد نسيجي، إشارة الزليلي بعد تناوله USPIO يمكن اعتبار العلامات البيولوجية، والتمثيل الكمي للتسلل الخلوية التي يمكن أن تكون طولية تقييم 10. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من طرائق التصوير الأخرى مثل الأراضي الفلسطينية المحتلةالتصوير أو التصوير كال النظائر الخلوية MR التصوير لديه القدرة على توليد صور عالية الدقة التشريحية التي تسمح توطين دقيقة من التغييرات إشارة الخلايا ذات الصلة.
بلعم التصوير يسمح للتقدير وجود خلية وتوزيعها داخل الأنسجة من الاهتمام من دون الحاجة إلى أخذ عينات الأنسجة. وبالتالي فإنه يتجنب اثنين من العوائق الرئيسية لتكرار أخذ عينات الأنسجة التي غالبا ما تكون مطلوبة في الدراسات البيولوجية في الجسم الحي التي هي الغازية وتعديل أنسجة الأم البيولوجيا العادي. وعلاوة على ذلك، وأخذ عينات الأنسجة متسلسلة قد يكون غير ممكن في الحيوانات الصغيرة التي لا تتسامح مع الإجراءات المجهدة المتكررة، مما يحول دون تقييم طولية. في المقابل، في الجسم الحي المتابعة التصوير من المحتويات البلاعم داخل الأنسجة باستخدام متسلسلة USPIO محسنة MR المسح الضوئي ويمكن تطبيقها بسهولة على الحيوانات الصغيرة لرصد طولية من العلاج بالمضادات الحيوية في الأمراض المعدية، والعلاج بالعقاقير المضادة للالتهابات في نماذج من noninالتهاب المفاصل fectious، أو في المعاملة في أية أمراض الضامة-المعنية.
مرة واحدة يتم اختيار نموذج من الفائدة (التهاب المفاصل، داء التهاب الغشاء المفصلي الصرف الصحي، الخ.)، يتم تنفيذ إدارة كيل النقيض بسهولة من خلال الحقن داخل الأوعية الدموية بطيئة وبشكل عام ليس تحديا تقنيا. القيد الرئيسي للMR الخلوية التصوير باستخدام USPIO كيل النقيض هو الحاجة إلى تكرار المسح 24 ساعة حقن، هذا التأخير السماح للالبلعمة محددة من قبل الضامة 5-7. ولذلك، من أجل الحصول على بيانات قابلة للمقارنة التصوير، تثبيت الحيوان دقيقة داخل وحدة MR إلزامي. في تجربتنا، لاحظنا أن تركيب الحيوان في موقف المعرضة داخل لفائف MR يرتبط مع انخفاض تمديد الساق كاملة حصلت عليها بالشريط اللاصق يسمح الصور استنساخه للغاية وقابلة للمقارنة.
قدمنا في هذا التقرير كيفية تسمية بسهولة في الضامة في الجسم الحي مع USPIO، والاستفادة من مواردهم الطبيعيةالنشاط أكلة. حتى إذا قد تكون هناك حاجة لإجراء مزيد الأولية المجراة سابقا (للسماح النقيض من الاختراق وكيل في الخلايا الطبيعية لا البلعمية)، ووضع العلامات خلية حساسة للغاية مع MR عامل تباين مثل جسيمات أكسيد الحديد يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا اللمفية، النوى الكريات البيض، أو الخلايا البدينة. وبالتالي يمكن الخلوية MR التصوير يكون أداة مثيرة جدا للاهتمام للتحقيق noninvasively تجنيد متسلسلة من جميع أنواع الخلايا ذات الصلة بالالتهاب العدوى ذات الصلة، وتقييم أثر العام وكذلك العلاجات التي تستهدف الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن نتقدم بخالص الشكر F. Bierry للحصول على المساعدة في إنتاج وتحرير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| P904 | Guerbet | Dose: 150 μmol Fe/kg | |
| Ketamine (500 mg/ml ketamine) | Virbac | Dose: 30 mg/kg | |
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Axience | Dose: 4 mg/kg | |
| Buprenorphine | Vetoquinol | Dose: 0.1 mg/kg/8 hr | |
| BD 22 G, 1 inch | BD Biosciences | 381423 | |
| BD 25 G, 5/8 inch | BD Biosciences | 305122 |
References
- Madri, J. Inflammation and healing. Anderson's Pathology. Kissane, J. , 67-110 (1990).
- Sephel, G., Woodward, S. Repair, regeneration, and fibrosis. Rubin's Pathology. Rubin, R., Strayer, D. , 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. 71-98 (2008).
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of macrophages in Staphylococcus aureus-induced arthritis and sepsis. Arthritis Rheum. 43 (10), 2276-2282 (2000).
- Heale, J., Speert, D. Macrophages in bacterial infection. The Macrophage. Burke, B., Lewis, C. , Oxford University Press. Oxford, England. 210-252 (2008).
- Bierry, G., et al. Macrophage activity in infected areas of an experimental vertebral osteomyelitis model: USPIO-enhanced MR imaging--feasibility study. Radiology. 248 (1), 114-123 (2008).
- Bierry, G., et al. MRI of macrophages in infectious knee synovitis. AJR Am. J. Roentgenol. 194 (6), W521-W526 (2010).
- Lutz, A. M., et al. Detection of synovial macrophages in an experimental rabbit model of antigen-induced arthritis: ultrasmall superparamagnetic iron oxide-enhanced MR imaging. Radiology. 233 (1), 149-1457 (2004).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175 (2), 494-498 (1990).
- Lefevre, S., et al. Septic arthritis: monitoring with USPIO-enhanced macrophage MR imaging. Radiology. 258 (3), 722-728 (2011).
- Sigovan, M., et al. Rapid-clearance iron nanoparticles for inflammation imaging of atherosclerotic plaque: initial experience in animal model. Radiology. 252 (2), 401-409 (2009).
