Summary
우리는 대식 세포 MR 영상이 허용 정화조 관절염의 초소형 초상 자성 조영제 (USPIO)를 사용하여 수행하는 방법을 보여주는 초기 및 종
Abstract
대식 세포 개시, 개발 및 세균 감염에 대한 염증 반응의 조절에 중요한 세포입니다. 대식 세포가 집중적으로 점점 감염의 초기 단계에서 패혈증 관절 모집 및 침투는 병원체의 효율적인 제거가 얻어지면 퇴보 할 예정이다. 치료 급성 활막염 및 모니터링의 조기 발견 : 감염된 관절의 생체 내 대 식세포의 활동에 식별하는 능력은 따라서 두 가지 애플리케이션을 제공 할 수 있습니다.
생체 내에서 대 식세포의 비 침습적 검출 등의 초소형 초상 자성 산화철 (USPIO) 등의 철 나노 입자를 사용하여 자기 공명 영상을 수행 할 수 있습니다. 혈관이나 관절 투여 후, USPIO는 특히 자신의 자기 적 특성에 의해 활성화 된 대 식세포, 그리고에 의해 phagocytized하는, 대식 세포 침투를 제시 조직의 신호 변화를 유도. quantitativ입자 분사 조직 내 철의 양의 상관 관계가 있으므로 USPIO로드 셀의 수를 반영 한 후 신호 손실 영역 (어두운 픽셀 수)가 경사 에코 자기 공명 영상에서 관찰로 침투의 전자 평가는 가능합니다.
우리는 수, 패혈증 성 관절염의 동물 모델에서 USPIO 강화 MR 영상을 사용하여 대식 세포 이미징을 수행하기 위해 여기 프로토콜을 제시한다 대식 세포 침투 및 치료 활동의 평가의 생체 내 비침 평가에서 초기 및 종.
Introduction
자기 공명 영상 (MRI)은 높은 공간 해상도와 부드러운 조직 대조에 의한 감염성 활막염의 데모에 대한 선택의 이미징 양상으로 간주됩니다. 혈관 확장 및 혈관 신생 1 증가 혈류의 때문에의 조직 학적 연구 결과와 일치 관절염 낮은 T1과 세포 외 수분 함량의 증가 존재를 반영하는 높은 T2 신호 및 가돌리늄 기반 대비 에이전트 투여 후 표시된 충실 MRI에서 관찰 된 신호 변화. 그럼에도 불구하고, MRI는 종종 지속적인 개선이 확대 세포 공간의 지속성 (육아 조직, 섬유 성 흉터) 2에 의한 임상 적 및 생물학적 치유 혈성 관절염 환자의 관절에서 관찰 할 수있는 항생제 치료시 감염의 해상도를 입증 할 수 없습니다. 세포 변화 외에, 대 식세포의 강렬한 모집 등의 염증 세포가 대량으로 침투관절 활액을 fected. 대식 세포가 세균 감염 3의 급성 및 만성 단계 모두에서 중요한 역할을한다. 대식 세포에 의한 염증이 4 시작 복구를 방지만큼 괴사 조직을 제거하지 않기 때문에 지속으로 그들은 병원성 미생물을 근절하는 데 필요한 염증 반응을 유도하고 염증 해상도를 조정. 따라서, 효율적인 치료 후 감염된 관절 활액 내의 대 식세포 침윤의 감소는 감염의 해상도의 신뢰할 수있는 지표가 될 수 있습니다. 세포 이미징 병리 조직 내부의 특정 세포의 침윤을 입증 할 수 있습니다. 특정 대식 세포의 MR 영상은 조영제 널리 연구 된 대상으로하여 관절 염증이나 감염 5-7을 입증 할 수있는 능력을 보여 주었다. 정맥 주사 한 후, 같은 USPIO (초소형 초상 자성 철 산화물) 입자와 같은 표적 조영제는 식세포로 포식 세포에 의해 촬영되고그들의 자기 특성으로 인해, 대 식세포의 침윤 8를 제시 조직에서 신호 변화를 유도. 종은 그 MR 신호 변경 치료의 후속은 대 식세포의 침윤의 생체 내 비침 평가에 사용할 수 있고 USPIO로드 - 대 식세포 관련 신호 변화의 감소는 치료의 성공을 입증한다. 이 보고서의 목적은 비 침습적 관절 활액 내에서 대 식세포 침윤의 감소를 보여줌으로써 혈성 관절염을 모니터링하는 대식 세포의 MR 영상을 수행하는 방법을 제시하는 것입니다.
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Protocol
동물 주제와 관련된 모든 절차는 대학 병원 기관 동물 관리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 관절 세균 접종
- 주입하기 전에, 건설자 Spinae 근육 내 xylazine (4 ㎎ / ㎏)와 혼합 마취제의 근육 주사 (30 ㎎ / 체중 kg)에 의해 토끼를 마취. 동물들이 발 핀치에 응답하지 않는 것을 확인하여 완전히 마취되어 있는지 확인합니다. 이 프로토콜은 무릎 관절의 관절 주사에 대한 충분한 마취를 제공합니다. 마취 중에 산소 마스크에서 동물을 놓습니다.
- 동물의 무릎을 면도. 포비돈 - 요오드 용액의 응용 프로그램에서 다음 포비돈 - 요오드 스크럽과 알코올 3 교대 잎사귀에 의해 무균 주입 무릎을 준비합니다.
- 수동과 같이 멸균 바늘 모자 또는 멸균 프로브를 사용하여 무릎의 전방 측면에서 탄성 구조로 슬개골 건을 식별합니다.
- 10 6의 농도 UFC / ㎖에서 황색 포도상 구균의 세균 현탁액 (노이만 변형) 1 ㎖와 각 무릎을 주입. 저항없이 주사 바늘의 끝의 관절 위치를 확인합니다.
- 분사 절차 후 열 손실을 방지하고 가슴의 움직임을 관찰하여 호흡을 모니터하는 대류 소스에서 동물을 유지합니다. 일단 깨어, 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 케이지에 동물을 유지합니다.
- 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀 매일 8 시간의 근육 주사를 투여하여 통증을 관리 할 수 있습니다.
- 임상 적으로 음식과 물, 체중 감소, 온도, 일반적 행동의 소비 수량을 모니터링, 매일 토끼를 관찰합니다.
- 이미지로 감염의 급성 단계는 즉시 최초의 MR 영상 세션을 수행동물이 상당한 체중 감량을 선물로 (10 %), 일반적으로 약 2 일 후에 발생합니다.
- 정맥 주사 약물 투여가 MRI 검사를하기 전에 필요한 경우, 귀 정맥 액세스 (참조 아래)를 설치할 수 있습니다.
2. MRI 검사
이미징 동물을 살 때 조심 동물의 설치 동물의 편안함과 최적의 마취를 보장하는 핵심 기능입니다. 이 최고의 이미징 결과를 허용하고 종단 연구를위한 생식 이미지 수집을 보장합니다. 동물의 크기로 인해, 임상 크기의 MR 기기 (1.5 T 또는 3 T)의 사용에 최적입니다. 이 토끼 무릎 탐사에 적합한 해상도와 대비 잡음 비율을 제공하기 때문에 8 채널 임상 무릎 코일이 사용됩니다.
- 영상 시스템에 설치하기 전에 귀 정맥을 통해 주변 정맥 접근을 설치합니다. 이 액세스는 조영제를 주입하는 역할을합니다.
- 면도 귀를 소독.
- 측면 귀 정맥 내부에 25 G 카테터를 삽입합니다.
- 1 ML 멸균 생리 혈청 주사로 투수를 평가합니다.
- 접착제 도청에 카테터를 유지합니다.
- xylazine (4 ㎎ / ㎏)와 혼합 마취제의 근육 주사 (30 ㎎ / 체중 kg)에 의해 동물을 마취. 그들은 발 핀치에 응답하는 데 실패 후 동물은 완전히 마취 있습니다. 200 ml / min의 유속으로 그것에게 산소를주고, 토끼 얼굴 마스크를 놓습니다.
- 일단 완전히 마취, 자기 공명 영상 장치에 동물을 가져 가라. 장소 동물은 그래서 무릎이 MR 코일의 중심에 위치합니다. 경골의 긴 축이 공명 영상 장치 테이블에 평행이되도록 완전한 확장에 동물의 다리를 놓습니다. 최적의 다리의 위치를 유지하기 위해 벨크로 잠 그개 또는 모래 주머니를 사용합니다.
- 동물의 심장 - 호흡 모니터링이 필요하지 않습니다마취 프로토콜은 자발적 호흡에 깊은 마취를 수 있지만, 동물은 마취 유도 열 손실을 방지하기 위해 적용해야합니다.
- MR 프로토콜은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 최적의 설치를 포함하여 총 취득을위한 평균 시간은 20 분 정도입니다.
- 다른 비행기에 MR 영상을 수행합니다. 그것은 연속 종 시험에 대한 이미지 위치의 해부학 재현성을 보장하고 조직 학적 슬라이스 최적의 상관 관계를 허용하는 그럼에도 불구하고, 무릎의 횡단면 (경골에 직교)는 참조 계획이다.
- unenhanced 시퀀스의 완료시, 귀 정맥 액세스를 통해 UPSIO 조영제를 주입. 천천히 150 μmol의 철 / kg의 단일 투여에 산화철 입자를 관리 할 수 있습니다. 멸균 생리 혈청 1 mL를 주입하여 카테터를 씻어.
- 주사 후 향상된 GRE 가중 연속 24 시간을 반복합니다. 이 지연은 입자에 의해 phagocytized 할 수 있습니다대식.
- 약물 효과 (항생제, 스테로이드, 안티 대식 세포 항체, 등.) 평가 종단 연구의 경우, 상술 한 프로토콜을 사용하여 순차적 MR 시험을 반복한다.
3. 이미지 분석
- 길이 평가를 위해 동일한 해부학 적 수준에서 측정을 수행하고, 쉽게 식별 랜드 마크를 정의합니다. 예를 들어, 슬개골의 가장 큰 직경이 관찰되는 축 평면을 통해 획득 재현성 측정 (그림 1)를 얻을 수있는 확실한 방법이다.
- DICOM 기반 소프트웨어 (예 : Osirix) 또는 이미지 처리 소프트웨어 (ImageJ에)를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다.
- ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 "불규칙한 영역"그리기 도구를 사용하여 USPIO 강화 GRE T2-강조 영상에서의 신호 손실을 보여줍니다 활액 영역의 분할을 수행합니다. 어두운 신호 활막이 개설되면, / 영역을 얻기 위해 "분석"을 클릭픽셀 수 (그림 2).
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Representative Results
unenhanced 이미지에 감염된 무릎의 활막은 대퇴골과 슬개골이 낮은 신호 구조 (그림 1)로 표시하면서 부드러운 조직을 둘러싼 구별 비입니다 중간 신호의 확산 붓기를 제공합니다.
USPIO 향상된 이미지에서 조영제 투여 후 24 시간, USPIO로드 대식 세포를 포함하는 활액 영역 신호 손실 (그림 1 및 2)를 보여줍니다.
활막 내 대 식세포의 침윤는 특정 면역 염색 (그림 3)를 사용하여 설명 할 수 있습니다. 얼룩 Perls '러시안 블루는 파란색 점 (그림 4)로 표시 철 입자를 감지 할 수 있습니다.
| GRE T2는 가중치 | |||
| 반복 시간 (밀리 초) | 450 | ||
| 에코 시간 (밀리 초) | 4 | 각도를 뒤집기 | 30 |
| 터보 요인 | |||
| 지방 억제 | |||
| 슬라이스 두께 (mm) | 1.5 | ||
| 간격의 차이 | 0 | ||
| 시야 (mm) | 70 | ||
| 매트릭스 | 448 X 360 | ||
| 대역폭 | 80 | ||
| 신호 획득 | 2 | ||
| 길이를 스캔 | 3'10 |
표 1. 3T MR 장치의 GRE T2 강조 MR 시퀀스의 매개 변수의 예.
그림 1. 급성의 토끼 무릎의 축 GRE는 T2 강조 영상이미지가 슬개골 수준 (P)과 대퇴골 (F)에서 얻을 수 있습니다, (A)와 24 시간 USPIO의 (B) 혈관 내 투여 후 전에 감염의 단계입니다. unenhanced 이미지 (A), 활막이 두꺼워입니다 (화살표)과 주변의 연부 조직에서 불명료 한 균일 한 중간 신호를 제공합니다. USPIO 투여 후 (B), 활막은 USPIO로드 식세포의 존재로 인해 대규모 어두운 신호의 밴드와 같은 지역 (화살촉) 지금처럼 나타납니다. (권한이 LEFEVRE S. 하였다. 9에서 재 인쇄).
그림 2. 분할 및 ImageJ에를 사용하여 신호 손실을 제시하는 활액 영역의 결정.
그림 3. 특정 대식 세포 면역 염색 현미경 사진은 감염된 활막 (화살표) 내 대 식세포의 강렬한 침투를 보여줍니다. (RAM 11 면역 염색, 원래 배율 40X).
그림 4. 현미경 사진 (Perls '감청 얼룩, 원래 배율 40X)은 USPIO로드 대식 세포 (화살표)에 correspondig 여러 푸른 스테인드 세포를 보여줍니다. (권한 르페브르 S. 하였다. 9 일부터 재판).
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Discussion
특이 가돌리늄 기반 대비 요원은 세포 공간의 볼륨과 관류에 대한 정보를 제공하는 반면, USPIO 강화 된 MR에 의해 대식 세포 이미징은 조직 표본 9의 필요없이 정확한 해부학 적 지역화 및 감염 활막 내 대 식세포의 침윤의 질적 평가를 할 수 있습니다. 자신의 높은 감도 때문에, USPIO도 미묘한 세포는 감염의 초기 단계에 존재 침투 입증 할 수 있습니다. 병원균이 점진적으로 제거 할 때 성공적으로 항생제 치료에서이 침투은 활막 내 USPIO 섭취의 감소로 이어지는, 감소하는 것으로 간주됩니다. 어두운 신호의 영역이 tissular 철분 상관 관계되기 때문에, USPIO 투여 후 활액 신호 바이오 마커, 세로 평가 10 할 수 세포 침윤의 정량적 인 표현으로 간주 될 수 있습니다. 또한, 그리고 OPT와 같은 다른 영상 기법과 달리iCal의 영상이나 동위 원소 이미징, 세포 MR 영상은 세포 관련 신호 변화의 정확한 현지화를 허용 고해상도 해부학 적 이미지를 생성 할 수있는 능력을 가지고 있습니다.
대식 세포 이미징 조직 표본의 필요없이 세포의 존재와 그 조직 내 분포 추정을 할 수 있습니다. 따라서 기본 조직 일반 생물학의 침입 및 수정되어 생체 내 생물학적 연구에 자주 필요한 반복적 인 조직 표본의 두 가지 주요 단점을 피할 수 있습니다. 또한, 순차적 조직 샘플링은 세로 평가를 배제 반복 스트레스 절차를 용납하지 않는 작은 동물이 불가능 할 수 있습니다. 반면, 연속 USPIO 강화 MR 스캔이 쉽게 nonin의 모델에서 항 염증 요법, 감염성 질환에 항생제 치료의 길이 모니터링을위한 작은 동물에 적용 할 수있는 사용하여 조직 내에서 대 식세포 내용의 후속 생체 내 이미징fectious 관절염, 또는 대식 세포 - 참여 질환 치료.
그 모델 (관절염, 패혈증 활막염 등). 선택되면, 조영제 관리를 쉽게 천천히 혈관 주사를 통해 수행하고 일반적으로 기술적 도전이 아니다.입니다 USPIO 조영제를 사용하여 MR 세포 영상의 주요 제한은 24 시간 주입, 5-7 대 식세포에 의해 특정 식균 작용을 허용이 지연을 스캔 반복의 필요성이다. 따라서, 비교 영상 데이터를 가지고하기 위해 MR 장치에서 정확한 동물의 설치가 필수입니다. 우리의 경험, 우리는 높은 재현성과 유사한 이미지를 허용 접착 테이핑에 의해 얻어진 낮은 다리 전체 확장명과 연결된 MR 코일에서 발생하기 쉬운 위치에 그 동물의 설치를 관찰했다.
우리는 그들의 자연을 활용, 쉽게 USPIO와 생체 내 대 식세포의 레이블을하는 방법이 보고서에 제시된식세포 활동. 추가 예비 전직 생체 절차가 필요할 수도 (안 천연 식세포에 조영제 침투를 허용하기 위해), 철 산화물 입자와 같은 매우 민감한 MR 조영제와 셀 라벨은 다형 같은 림프구와 같은 다른 세포 유형에 적용 할 수 백혈구, 또는 비만 세포. 세포 MR 영상은 따라서 감염과 관련된 염증에 관련된 모든 세포 유형의 순차적 모집 간접적으로 조사를 위해 매우 흥미로운 도구가 될 수 있고, 일반의 영향뿐만 아니라 세포 표적으로 한 치료를 평가할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 진심으로 비디오 제작 및 편집에 도움 F. Bierry 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| P904 | Guerbet | Dose: 150 μmol Fe/kg | |
| Ketamine (500 mg/ml ketamine) | Virbac | Dose: 30 mg/kg | |
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Axience | Dose: 4 mg/kg | |
| Buprenorphine | Vetoquinol | Dose: 0.1 mg/kg/8 hr | |
| BD 22 G, 1 inch | BD Biosciences | 381423 | |
| BD 25 G, 5/8 inch | BD Biosciences | 305122 |
References
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