Summary
אנו מדגימים כיצד לבצע מקרופאג MR הדמיה באמצעות חומר ניגוד פאראמגנטי ultrasmall (USPIO) בדלקת מפרקים ספיגה, המאפשרת ראשוני ואורכים
Abstract
המקרופאגים הם מפתח תאים בייזום, הפיתוח והרגולציה של התגובה הדלקתית לזיהום חיידקים. המקרופאגים מגויסים באופן אינטנסיבי ויותר ויותר במפרקים ספיגה מהשלבים המוקדמים של זיהום והחדירה אמורה לסגת ברגע ההסרה יעילה של פתוגנים מתקבלת. היכולת לזהות בפעילות מקרופאג vivo במפרק נגוע יכולה לכן לספק שני יישומים עיקריים: זיהוי המוקדם של קרום מוח חריף וניטור של טיפול.
In vivo גילוי לא פולשנית של מקרופאגים ניתן לבצע עם תהודה מגנטית באמצעות חלקיקי ברזל כגון תחמוצת ברזל פאראמגנטי ultrasmall (USPIO). לאחר מתן intravascular או intraarticular, USPIO הם phagocytized במיוחד על ידי מקרופאגים הופעל, ו, בשל התכונות המגנטיות שלהם, לגרום לשינויים באותות ברקמות המציגות חדירת מקרופאג. Quantitativההערכה של דואר לחדור אינה ריאלי, כפי שהאזור עם אובדן אות (מספר פיקסלים כהים) שנצפה בתמונות שיפוע הד MR לאחר הזרקת חלקיקים מתואמת עם כמות הברזל בתוך הרקמה, ולכן משקפת את מספר התאים USPIO טעונים.
אנו מציגים כאן פרוטוקול לבצע הדמיה באמצעות מקרופאג USPIO המשופרת MR הדמיה במודל חיה של דלקת מפרקים ספיגה, המאפשר ראשוני ואורך בהערכה לא פולשנית vivo של חדירת מקרופאגים והערכה של פעולת טיפול.
Introduction
דימות תהודה מגנטית (MRI) נחשבת לשיטת ההדמיה של בחירה עבור ההפגנה של קרום מוח מדבק עקב הרזולוציה מרחבית הגבוהה שלה ולעומת זאת רקמות רכות. שינויים באותות שנצפו ב-MRI בדלקת המפרקים T1 הנמוך ואות T2 גבוהה המשקפת את הנוכחות המוגברת של תכולת מים תאית, ושיפור ניכר לאחר מתן סוכן מבוסס ניגוד גדוליניום, התואמים את הממצאים בהיסטולוגיה בשל כלי דם מוגבר להרחבת כלי דם ואנגיוגנזה 1. עם זאת, ה-MRI הוא לעתים קרובות מסוגל להפגין רזולוציה של זיהום במהלך טיפול אנטיביוטי כפי שניתן לראות שיפור מתמשך במפרקים של חולים עם נרפאה קליני וביולוגי ספיגה דלקת בשל התמדה של מרחב תאי מוגדל (רקמת גרעון, צלקת fibrotic) 2. חוץ משינויים תאיים, תאים דלקתיים, כולל גיוס אינטנסיבי של מקרופאגים לחדור בצורה מאסיבית בfected משח. המקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי גם בשלב האקוטי וכרוני של זיהום חיידקי 3. הם לגרום תגובה הדלקתית הנדרשת למיגור מיקרואורגניזמים פתוגניים, ולתאם רזולוציה דלקת, כמו דלקת הנגרמת מקרופאג נמשכת כל עוד רקמות נימקים לא יוסרו, ומונע תיקון להתחיל 4. לפיכך, ההפחתה של חדירת מקרופאג במשח הנגוע לאחר טיפול יעיל יכולה להיות אינדיקטור אמין של הרזולוציה של הזיהום. נייד הדמיה היא הצליחה להוכיח ספציפית סלולרית חדירה בתוך רקמה פתולוגית. ספציפית מקרופאג MR הדמיה באמצעות ממוקדת חומר ניגוד נחקר באופן נרחב והוכיחה את יכולתה להפגין דלקת מפרקים או זיהום 5-7. לאחר הזרקה לוריד, כגון סוכנים ממוקדים בניגוד כגון USPIO (תחמוצות ברזל פאראמגנטי ultrasmall) חלקיקים נתפסים על ידי תאי phagocytic כגון מקרופאגים ו,בשל התכונות המגנטיות שלהם, לגרום לשינויים באותות ברקמות המציגות מקרופאג הסתננות 8. אורך מעקב של טיפול באלה MR אות שינויים מאפשר בהערכה לא פולשנית vivo של חדירת מקרופאג, והפחתה של טעון-מקרופגים שינויים באותות הקשורים USPIO תפגין הצלחה טיפול. מטרת דו"ח זה היא להציג כיצד לבצע מקרופאג MR הדמיה כדי לפקח על דלקת מפרקים ספיגה noninvasively על ידי הוכחת ההפחתה של חדירת מקרופאג במשח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים כרוכים בנושאי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית בית החולים האוניברסיטאי.
1. הרכבת חיסון חיידקי Intraarticular
- לפני הזריקה, להרדים ארנבים באמצעות הזרקה לשריר של קטמין (30 מ"ג / ק"ג משקל גוף) מעורבבת עם xylazine (4 מ"ג / ק"ג) בתוך שריר שרירי הארקטור ספינאה. ודא חיות מורדמים באופן מלא על ידי בדיקה כי הם אינם מגיבים לקמצוץ כפה. פרוטוקול זה מספק הרדמה מספיקה להזרקת intraarticular של מפרק הברך. הנח את החיות מתחת למסיכת חמצן במהלך הרדמה.
- לגלח את הברך של בעלי החיים. הכן את הברך להזרקה מזוהם על ידי 3 מגבונים מתחלפים של לשפשף povidone-יוד ואלכוהול ואחרי יישום של פתרון povidone-יוד.
- באופן ידני לזהות את גיד הפיקה כמבנה אלסטי בהיבט הקדמי של הברך באמצעות כובע מחט סטרילית כפי שמוצג או בדיקה סטרילית.
- הזרק כל ברך עם 1 מ"ל של השעיה חיידקים של סטפילוקוקוס (זן נוימן) בריכוז של 10 UFC 6 / מ"ל. הזרקה ללא התנגדות מאשרת את מיקום intraarticular של קצה המחט.
- לאחר הליכי הזרקה, לשמור על בעלי החיים במקור הסעה, כדי למנוע איבוד חום ולפקח על קצב נשימה על ידי התבוננות תנועה של החזה. ברגע ער, לשמור על בעלי חיים בכלובים עם גישה החופשית למזון ומים.
- לנהל את הכאב על ידי מתן זריקה תוך שרירית של 0.1 עצירות מ"ג / ק"ג כל 8 שעות.
- מבחינה קלינית להתבונן ארנבים בכל יום, ניטור כמויות נצרכות של מזון ומים, ירידה במשקל, טמפרטורה, והתנהגות כללית.
- לתמונה בשלב החריף של זיהום לבצע פגישת ההדמיה MR הראשונה בהקדםכחיה מציגה ירידה במשקל משמעותית (10%); בדרך כלל זה קורה לאחר כ 2 ימים.
- אם תרופות תוך ורידי נדרש לפני בדיקת MRI, ניתן הייתה להתקין גישה ורידי אוזניים (ראה להלן).
2. בדיקת MRI
כאשר הדמיה לחיות בעלי חיים, התקנת חיה זהירה היא תכונת מפתח כדי להבטיח נוחות והרדמת בעלי חיים אופטימלית. זה יאפשר לתוצאות ההדמיה הטובות ביותר ולהבטיח רכישת תמונת רבייה למחקרים ארוכי טווח. בשל גודלו של בעל החיים, השימוש ביחידת MR קליני בגודל (1.5 T או T 3) הוא מתאים ביותר. סליל הברך קליני 8 ערוצים משמש כפי שהוא מספק רזולוציה מתאימה ויחס ניגודיות לרעש לחקר הברך ארנב.
- לפני התקנה על מערכת ההדמיה, להתקין גישה ורידים היקפי דרך וריד אוזן. גישה זו תשמש כדי להזריק חומר הניגוד.
- לגלח ולחטא את האוזן.
- הכנס G 25 בתוך וריד אוזן רוחב קטטר.
- להעריך את החדירות על ידי הזרקה של סרום פיסיולוגי סטרילי 1 מ"ל.
- לשמור את הקטטר עם הקשה הדבקה.
- להרדים בעלי חיים בדרך של זריקה תוך שרירית של קטמין (30 מ"ג / ק"ג משקל גוף) מעורבבת עם xylazine (4 מ"ג / ק"ג). חיות מורדמים באופן מלא ברגע שהם אינם מגיבים לקמצוץ כפה. מניחים מסיכת פנים על הארנב, זה נותן חמצן עם קצב זרימה של 200 מ"ל / דקה.
- פעם אחת בהרדמה מלאה, לקחת את בעלי החיים ליחידת ההדמיה MR. בעלי חיים מקום כל כך שהברכיים נמצאות במרכז סליל MR. הנח את רגליהם של בעלי החיים ברחבה מלאה, כך שציר האורך של עצם השוק הוא במקביל לשולחן יחידת ההדמיה MR. השתמש במחברי סקוטש או שקי חול כדי לשמור על מיקום רגל אופטימלי.
- ניטור לב ונשימה של בעלי החיים אינו נדרש כפרוטוקול מאפשר הרדמה הרדמה עמוקה בנשימה ספונטנית, אבל חיות חייבת להיות מכוסות, כדי למנוע אובדן חום-Induced הרדמה.
- MR פרוטוקול מפורט בטבלה 1. הזמן הממוצע לרכישה כוללת כולל התקנה אופטימלית הוא כ -20 דקות.
- לבצע MR הדמיה במישורים שונים. עם זאת, במישור הרוחבי של הברכיים (מאונך לעצם השוק) הוא תכנית העזר כפי שהיא מבטיחה שחזור האנטומי של מיקום תמונה לבחינות אורך רציפים ומאפשרת התאמה אופטימלית עם פרוסות היסטולוגית.
- בסיום של רצפי unenhanced, להזריק חומר ניגוד UPSIO דרך הגישה ורידי אוזן. לאט לנהל את חלקיקי תחמוצת הברזל במנה בודד של 150 פה μmol / ק"ג. יש לשטוף את הצנתר בזריקה של 1 מ"ל של סרום פיסיולוגי סטרילית.
- חזור על משאבי האנוש המשופר GRE המשוקלל רצף 24 לאחר ההזרקה. עיכוב זה מאפשר לחלקיקים שphagocytized ידיאת מקרופאגים.
- עבור מחקרים ארוכי טווח להערכת השפעת תרופות (אנטיביוטיקה, סטרואידים, נוגדנים נגד macrophage, וכו '.), חזור על בדיקות רציפות MR באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל.
3. ניתוח תמונה
- להערכת אורך לבצע מדידות באותה הרמה האנטומית, ולהגדיר נקודת ציון לזיהוי בקלות. לדוגמה, רכישה דרך המישור הצירי בו הקוטר הגדול ביותר של הפיקה הוא ציין היא דרך אמינה כדי להשיג מדידה לשעתק (איור 1).
- ביצוע ניתוח תמונה באמצעות תוכנה לעיבוד תמונה (ImageJ) מבוססת תוכנת DICOM (כגון Osirix) או.
- באמצעות תוכנת ImageJ, לבצע פילוח של האזור הסינוביאלי המדגים אובדן אות בתמונת T2 משוקללת GRE USPIO המשופרת שימוש באפשרות "לא סדירה האזור" הציור. ברגע שהסינוביום עם אות אפלה מתואר, לחץ על "נתח" כדי להשיג את האזור /מספר הפיקסלים (איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על תמונות unenhanced, הסינוביום של ברכיים נגועות מציג נפיחות מפוזרת של אות ביניים שהיא לא להבדיל בין רקמות רכות, ואילו עצם ירך והפיקה יופיעו כאות מבנים נמוכים (איור 1).
על תמונות USPIO המשופרות, 24 שעות לאחר שממשל חומר הניגוד, המכיל אזור הסינוביאלי מקרופאגים USPIO טעונים תדגים אובדן אות (איורים 1 ו -2).
חדירה בתוך מקרופאג הסינוביום ניתן להדגים באמצעות immunostaining הספציפי (איור 3). 'פרלס כחול הפרוסים הכתם יכול לזהות חלקיקי ברזל, המופיעים כנקודות כחולות (איור 4).
| GRE T2 משוקלל | |||
| זמן החזרה (אלפיות השני) | 450 | ||
| הד זמן (אלפיות השני) | 4 | פליפ זווית | 30 |
| גורם טורבו | |||
| דיכוי שומן | |||
| עובי פרוס (מ"מ) | 1.5 | ||
| פער מרווח | 0 | ||
| שדה הראייה (מ"מ) | 70 | ||
| מטריצה | 448 x 360 | ||
| רוחב פס | 80 | ||
| אותות שנרכשו | 2 | ||
| סרוק את האורך | 3'10 |
טבלת מס '1. דוגמה לפרמטרים של רצף MR T2 המשוקלל GRE על יחידת MR 3T.
איור 1. הצירי GRE תמונות T2 משוקלל של הברך בארנב החריףשלב של זיהום, לפני () ואחרי 24 שעות (ב ') ממשל intravascular של USPIO; תמונות מתקבלות ברמה של הפיקה (P) ועצם הירך (ו). על תמונת unenhanced (), הסינוביום הוא מעובה (חץ), ומציג את אות ביניים הומוגנית לא ברורה מהרקמות הרכות שמסביב. לאחר USPIO ממשל (ב '), מופיע כעת כסינוביום אזור כמו להקה של אות מסיבית כהה (ראש החץ) בשל נוכחותם של מקרופאגים USPIO טעונים. (נדפס מפברה S. et al. 9 באישור).
איור 2. פילוח וקביעת האזור הסינוביאלי שהציג אובדן אות באמצעות ImageJ.
איור 3. Photomicrograph של immunostaining מקרופאג הספציפי מדגימה את החדירה האינטנסיבית של מקרופאגים בתוך הסינוביום הנגוע (חץ). (Immunostaining זיכרון RAM 11, הגדלה 40X המקורית).
איור 4. Photomicrograph ('פרלס כחול הפרוסים הגדלת כתם, 40X מקורי) מראה תאים כחולים מוכתמים מרובים correspondig למקרופאגים USPIO הטעון (חץ). (הודפס מחדש מפברה S. et al. 9 באישור).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד סוכנים בניגוד גדוליניום מבוסס ספציפיים לספק מידע על ההיקף והטפטוף של המרחב תאי, הדמיה על ידי מקרופאג USPIO משופר MR מאפשרת לוקליזציה האנטומי מדויקת והערכה איכותית של חדירת מקרופאג בתוך הסינוביום הנגוע ללא צורך בדגימה של רקמת 9. בשל הרגישות הגבוהה שלהם, USPIO יכול להדגים אפילו סלולרי מתוחכם לחדור נוכחי בשלבים המוקדמים של זיהום. תחת טיפול אנטיביוטי מוצלח, כמו פתוגנים יוסרו בהדרגה, חדירה זה נחשבת לירידה, מה שמוביל להפחתת ספיגת USPIO בתוך הסינוביום. מכיוון שהאזור של אות כהה מתואם לתכולת ברזל tissular, אות סינוביאלי לאחר USPIO ממשל יכולה להיחשב כסמן ביולוגי, ייצוג כמותי של חדירה סלולרית שיכול להיות מוערך אורך 10. בנוסף לכך, וזאת בניגוד לשיטות הדמיה אחרות, כגון optיש הדמיה iCal או הדמיה איזוטופית, סלולרית MR הדמיה את היכולת ליצור דימויים אנטומיים ברזולוציה גבוהה המאפשרים איתור מדויק של שינויים באותות הקשורים לתאים.
מקרופאג הדמיה מאפשרת הערכה של נוכחות תא והפצה בתוך רקמה של עניין ללא צורך בדגימת רקמה. לכן נמנע משני חסרונות עיקריים של דגימת רקמה חזר לעתים קרובות נדרשת במחקרים ביולוגיים vivo כי הם הפולשנות ושינוי של ביולוגיה נורמלית רקמת ילידים. יתר על כן, דגימת רקמה רציפה עשויה להיות לא אפשרית בבעלי חיים קטנים שאינם סובלים נהלים מלחיצים חוזרים ונשנים, לא ניתן הערכת אורכי. לעומת זאת, בתחום ההדמיה vivo מעקב של תוכן מקרופאג בתוך רקמות באמצעות סריקת MR USPIO המשופרת רציפה יכולה להיות מיושמת בקלות לבעלי חיים קטנים לניטור האורך של טיפול אנטיביוטי במחלות זיהומיות, טיפול אנטי דלקתי במודלים של בלתי פולשניתדלקת מידבקת, או טיפול בכל מחלות מקרופאגים-מעורבות.
ברגע שהמודל של עניין נבחר (דלקת פרקים, ספיגה קרום מוח, וכו '.), ממשל חומר ניגוד מתבצע בקלות באמצעות הזרקת intravascular איטית והוא בכלל לא מבחינה טכנית מאתגרת. המגבלה העיקרית של MR הסלולרי הדמיה באמצעות חומר ניגוד USPIO היא צורך בהזרקה חוזר ונשנה סריקת הפועל 24 שעות, עיכוב זה מאפשר phagocytosis הספציפי על ידי מקרופאגים 5-7. לכן, על מנת לקבל נתוני הדמיה דומים, התקנת חיה מדויקת בתוך יחידת MR היא חובה. מניסיוננו, אנו ציינו כי התקנת חיה בעמדה נוטה בתוך סליל MR קשור עם סיומת מלאה נמוכה רגל מתקבלת על ידי דבק מקליטה אפשרה לשחזור ותמונות דומות מאוד.
הצגנו בדוח זה איך לתייג בקלות במקרופאגים vivo עם USPIO, תוך ניצולם הטבעיפעילות phagocytic. גם אם ייתכן שיידרש הליך vivo לשעבר ראשוני נוסף (כדי לאפשר חדירת חומר ניגוד לתוך תאים לא טבעי phagocytic), ניתן להחיל תא תיוג עם חומר ניגוד MR רגיש ביותר כגון חלקיקי תחמוצת ברזל לתאים מסוגים אחרים, כגון לימפוציטים, polymorphonuclear כדוריות דם לבנות או תאי פיטום. MR הדמיה נייד ולכן יכולה להיות כלי מאוד מעניין לחקירת noninvasively של הגיוס הרציף של כל סוגי התאים מעורבים בדלקת הקשורה לזיהום, ולהעריך את השפעתו של הגנרל, כמו גם טיפולים בתאים במיקוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו מאוד מודים לי פ Bierry לסיוע בהפקת וידאו ועריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| P904 | Guerbet | Dose: 150 μmol Fe/kg | |
| Ketamine (500 mg/ml ketamine) | Virbac | Dose: 30 mg/kg | |
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Axience | Dose: 4 mg/kg | |
| Buprenorphine | Vetoquinol | Dose: 0.1 mg/kg/8 hr | |
| BD 22 G, 1 inch | BD Biosciences | 381423 | |
| BD 25 G, 5/8 inch | BD Biosciences | 305122 |
References
- Madri, J. Inflammation and healing. Anderson's Pathology. Kissane, J. , 67-110 (1990).
- Sephel, G., Woodward, S. Repair, regeneration, and fibrosis. Rubin's Pathology. Rubin, R., Strayer, D. , 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. 71-98 (2008).
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of macrophages in Staphylococcus aureus-induced arthritis and sepsis. Arthritis Rheum. 43 (10), 2276-2282 (2000).
- Heale, J., Speert, D. Macrophages in bacterial infection. The Macrophage. Burke, B., Lewis, C. , Oxford University Press. Oxford, England. 210-252 (2008).
- Bierry, G., et al. Macrophage activity in infected areas of an experimental vertebral osteomyelitis model: USPIO-enhanced MR imaging--feasibility study. Radiology. 248 (1), 114-123 (2008).
- Bierry, G., et al. MRI of macrophages in infectious knee synovitis. AJR Am. J. Roentgenol. 194 (6), W521-W526 (2010).
- Lutz, A. M., et al. Detection of synovial macrophages in an experimental rabbit model of antigen-induced arthritis: ultrasmall superparamagnetic iron oxide-enhanced MR imaging. Radiology. 233 (1), 149-1457 (2004).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175 (2), 494-498 (1990).
- Lefevre, S., et al. Septic arthritis: monitoring with USPIO-enhanced macrophage MR imaging. Radiology. 258 (3), 722-728 (2011).
- Sigovan, M., et al. Rapid-clearance iron nanoparticles for inflammation imaging of atherosclerotic plaque: initial experience in animal model. Radiology. 252 (2), 401-409 (2009).
