In vivo Macrophage Imaging Met behulp van MR Gerichte Contrast Agent voor Longitudinale Evaluatie van septische artritis

Summary

We laten zien hoe om te presteren macrofaag MR beeldvorming met ultrakleine superparamagnetische contraststof (USPIO) in septische artritis, waardoor een eerste en longitudinale

Abstract

Macrofagen zijn de sleutel-cellen in de initiatie, de ontwikkeling en de regulatie van de inflammatoire respons op bacteriële infectie. Macrofagen intensief en steeds gerekruteerd septische voegen van de vroege fasen van infectie en de infiltratie wordt verondersteld eenmaal regressie efficiënte verwijdering van pathogenen verkregen. De mogelijkheid om te identificeren in vivo macrofaag activiteit in een geïnfecteerde gewricht kan daarom voorzien in twee belangrijke toepassingen: vroege opsporing van acute synovitis en controle van de behandeling.

In vivo niet-invasieve detectie van macrofagen kunnen worden uitgevoerd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming ijzer nanodeeltjes zoals ultrakleine superparamagnetische ijzeroxide (USPIO). Na intravasculaire of intra-articulaire toediening, worden USPIO specifiek phagocytized door geactiveerde macrofagen en door hun magnetische eigenschappen induceren signaalveranderingen in weefsels presenteren macrofaag infiltratie. Een quantitative evaluatie van het infiltreren is toegepast omdat het gebied met signaalverlies (aantal donkere pixels) waargenomen op gradiënt echo MR beelden na injectie deeltjes is gecorreleerd met de hoeveelheid ijzer in het weefsel en dekt dus het aantal USPIO geladen cellen.

We presenteren hier een protocol om macrofaag beeldvorming met behulp USPIO-versterkte MR beeldvorming in een diermodel van septische artritis, waardoor uitvoering van een voorlopige en longitudinale in vivo niet-invasieve evaluatie van macrofagen infiltratie en een beoordeling van de therapie optreden.

Introduction

Magnetic resonance imaging (MRI) wordt beschouwd als de beeldvormende modaliteit van keuze voor het aantonen van infectieuze synovitis vanwege de hoge ruimtelijke resolutie en contrast zacht weefsel. Veranderingen signaal waargenomen op MRI bij artritis lage T1 en T2 hoog signaal als gevolg van de verhoogde aanwezigheid van extracellulaire watergehalte, en een duidelijke verbetering na gadolinium gebaseerde-contrastmiddel administratie, in overeenstemming met de histologisch bevindingen van verhoogde vasculariteit gevolg van vaatverwijding en angiogenese ^1. Niettemin MRI dikwijls niet in oplossing van infecties tonen tijdens antibioticumtherapie persistent verbetering kan worden waargenomen in de gewrichten van patiënten met klinisch en biologisch genezen septische artritis toe aan persistentie van uitgebreide extracellulaire ruimte (granulatieweefsel, fibrotische litteken) ^2. Naast extracellulaire veranderingen ontstekingscellen inclusief een intense rekrutering van macrofagen massaal infiltreren ininfecteerd synovia. Macrofagen spelen een belangrijke rol in zowel de acute als de chronische fase van bacteriële infectie ^3. Ze induceren ontstekingsreactie nodig pathogene micro-organismen te roeien en coördineren ontsteking resolutie, zoals macrofaag-geïnduceerde ontsteking blijft zolang necrotisch weefsel niet verwijderd, waardoor reparatie te beginnen ^4. Zo kan de vermindering van de infiltratie van macrofagen in besmette synovia na efficiënte therapie een betrouwbare indicator van de resolutie van de infectie. Cellulaire beeldvorming is in staat om specifieke cellulaire infiltratie in pathologisch weefsel aan te tonen. Specifieke macrofaag MR beeldvorming met behulp van gerichte contrastmiddel is op grote schaal onderzocht en heeft de mogelijkheid om gezamenlijke ontsteking of infectie ^5-7 demonstreren aangetoond. Na intraveneuze injectie, worden dergelijke gerichte contrastmiddelen zoals USPIO (ultrakleine superparamagnetische ijzeroxide) deeltjes opgenomen door fagocytische cellen zoals macrofagen en,vanwege hun magnetische eigenschappen induceren signaalveranderingen in weefsels presentatie macrofaaginfiltratie ^8. De longitudinale follow-up van deze MR signaal verandert therapie zorgt voor een in vivo niet-invasieve evaluatie van macrofaag infiltratie, en een vermindering van USPIO geladen-macrofagen gerelateerde signaal veranderingen zouden therapie succes aantonen. Het doel van dit rapport is om te presenteren hoe de macrofaag MRI uit te voeren om niet-invasief monitoren septische artritis door het aantonen van de vermindering van de infiltratie van macrofagen in de synovia.

Protocol

Alle procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door het Universitair Ziekenhuis Institutional Animal Care commissie.

1. Intra-articulaire Bacteriële Enten

1. Vóór injectie verdoven konijnen door intramusculaire injectie van ketamine (30 mg / kg lichaamsgewicht) gemengd met xylazine (4 mg / kg) in erector spinae spieren. Zorgen voor dieren zijn volledig verdoofd door te controleren dat ze niet reageren op poot knijpen. Dit protocol voldoende verdoving voor de intra-articulaire injectie van het kniegewricht. Plaats de dieren onder zuurstofmasker tijdens anesthesie.
2. Shave knie dieren '. Bereid de knie voor aseptische injectie met 3 afwisselende doekjes van povidonjood scrub en alcohol gevolgd door toepassing van povidonjood-oplossing.
3. Handmatig identificeren van de kniepees als een elastische structuur op de voorste aspect van de knie met behulp van een steriele naald dop zoals getoond of een steriele sonde.
4. Injecteer elke knie met 1 ml van een bacteriële suspensie van Staphylococcus aureus (Neumann-stam) in een concentratie van 10 ⁶ UFC / ml. Een injectie zonder weerstand bevestigt de intra-articulaire locatie van de punt van de naald.
5. Na injectie procedures, houdt het dier onder convectieve bron om warmteverlies te voorkomen en te controleren ademfrequentie door het observeren van beweging van de borstkas. Eenmaal wakker, houden dieren in kooien met vrije toegang tot voedsel en water.
6. Pijn beheren door toediening van een intramusculaire injectie van 0,1 mg / kg elke 8 uur buprenorfine.
7. Klinisch observeren konijnen elke dag, monitoren geconsumeerde hoeveelheden voedsel en water, gewichtsverlies, temperatuur, en algemeen gedrag.
8. Om het beeld van de acute fase van de infectie de eerste MRI-sessie uit te voeren zo snelals een dier aanzienlijk gewichtsverlies (10%), dat later in het algemeen ongeveer 2 dagen.
9. Als intraveneuze toediening is vereist voordat MRI-onderzoek, zou een auricular veneuze toegang worden geïnstalleerd (zie hieronder).

2. MRI onderzoek

Bij beeldvorming levende dieren, een zorgvuldige dier installatie is een belangrijk kenmerk om dierlijke comfort en optimale anesthesie te garanderen. Dit zal zorgen voor de beste imaging resultaten en zorgen voor een reproductieve beeldaanwinst voor longitudinale studies. Vanwege de grootte van het dier, het gebruik van een grote klinische MR unit (1,5 T of T 3) het meest geschikt. 8-kanaals klinische knie spoel wordt gebruikt omdat het geschikte resolutie en contrast-ruisverhouding voor konijnenknie exploratie.

1. Voor de installatie op de imaging-systeem, het installeren van een perifere veneuze toegang via een auricular ader. Deze toegang zal dienen om het contrastmiddel te injecteren.
   1. Scheren en desinfecteren het oor.
   2. Breng een 25 G katheter in de laterale auricular ader.
   3. Beoordeel de permeabiliteit door injectie van 1 ml steriel fysiologisch serum.
   4. Onderhouden van de katheter met lijm tikken.
2. Verdoven dieren via intramusculaire injectie van ketamine (30 mg / kg lichaamsgewicht) gemengd met xylazine (4 mg / kg). Dieren zijn volledig verdoofd als ze niet reageren op poot knijpen. Plaats een gezichtsmasker bij konijnen, waardoor het zuurstof met een debiet van 200 ml / min.
3. Eenmaal volledig verdoofd, neem dieren naar de MRI-eenheid. Place dieren zodat de knieën in het midden van de spoel MR. Plaats poten van de dieren in volledige extensie, zodat de lengteas van de tibia parallel aan de MR beeldeenheid tabel. Gebruik klittenband of zandzakken om optimale been positie te handhaven.
4. Cardio-respiratoire monitoring van de dieren is niet vereist als deanesthesie protocol maakt diepe narcose op spontane ademhaling, maar dieren moeten worden afgedekt om de anesthesie geïnduceerd warmteverlies te voorkomen.
5. MR protocol wordt beschreven in Tabel 1. De gemiddelde tijd voor het totale overnameprijs inclusief optimale installatie is ongeveer 20 minuten.
6. Presteren MRI in verschillende vlakken. Niettemin, het dwarsvlak van de knieën (loodrecht op de tibia) is de referentie-plan zoals het zorgt anatomische reproduceerbaarheid van het beeld positie voor sequentiële longitudinale onderzoeken en verleent optimale correlatie met histologische plakjes.
7. Bij de voltooiing van onversterkte sequenties, injecteer de UPSIO contrastmiddel via de auricular veneuze toegang. Langzaam beheert de ijzeroxidedeeltjes in een enkele dosis van 150 umol Fe / kg. Spoel de katheter door injectie van 1 ml steriel fysiologisch serum.
8. Herhaal de verbeterde GRE gewogen sequentie 24 uur na de injectie. Deze vertraging kan de deeltjes worden door phagocytizedde macrofagen.
9. Voor longitudinale studies die drugs effect (antibiotica, steroïden, anti-macrofaag-antilichamen, enz..) Herhaal sequentiële MRI-onderzoeken met behulp van de hierboven beschreven protocol.

3. Beeldanalyse

1. Voor longitudinale evaluatie uit te voeren metingen op hetzelfde anatomisch niveau, en bepalen een herkenbaar landmark. Bijvoorbeeld verkregen worden vanuit de axiale vlak waar de grootste diameter van de patella wordt waargenomen is een betrouwbare manier om reproduceerbare meting (figuur 1) te verkrijgen.
2. Voer beeldanalyse met behulp van een DICOM-gebaseerde software (zoals Osirix) of een software voor beeldverwerking (ImageJ).
3. Met behulp van ImageJ software, voeren de segmentatie van de synoviale ruimte die een goede illustratie signaalverlies op USPIO-enhanced GRE T2-gewogen beeld met behulp van de "onregelmatige gebied" tekenprogramma. Zodra het synovium met donker signaal wordt geschetst, klik op "Analyze" om het gebied te verkrijgen /aantal pixels (figuur 2).

Representative Results

Op onversterkte beelden, het synovium van geïnfecteerde knieën presenteert een diffuse zwelling van tussensignaal dat niet onderscheiden van de omringende zachte weefsel, terwijl femur en patella verschijnen vanaf signaalstructuur (figuur 1).

Op de USPIO-verbeterde beelden, zal 24 uur na het contrastmiddel administratie, synoviale gebied met USPIO-beladen macrofagen signaalverlies (figuren 1 en 2) te tonen.

Infiltratie van macrofagen in synovium kunnen worden aangetoond met specifieke immunokleuring (figuur 3). Perls 'Pruisisch blauwe vlek kan detecteren ijzerdeeltjes, die verschijnen als blauwe stippen (figuur 4).

	GRE T2 gewogen
Herhalingstijd (msec)	450
Echo tijd (msec)	4	Flip hoek	30
Turbo factor
Vet onderdrukking
Slice dikte (mm)	1.5
Interval kloof	0
Gezichtsveld (mm)	70
Matrix	448 x 360
Bandbreedte	80
Signalen verworven	2
Scannen lengte	3'10

Tabel 1. Voorbeeld van de parameters van de GRE T2-gewogen MR volgorde op een 3T MR-eenheid.

Figuur 1. Axiale GRE T2-gewogen beelden van een konijn knie bij de acutefase van infectie, voor (A) en 24 uur na (B) intravasculaire toediening van de USPIO, Beelden worden verkregen op het niveau van de patella (p) en de femur (f). Op het onversterkte beeld (A), het synovium verdikt (pijl) en toont een homogene tussensignaal niet verschillend van de omringende zachte weefsels. Na USPIO toediening (B), wordt het synovium nu als een band-achtig gebied van massaal donker signaal (pijl) door de aanwezigheid van USPIO beladen macrofagen. (Overgenomen uit Lefevre S. et al.. ⁹ met toestemming).

Figuur 2. Segmentatie en de bepaling van de synoviale gebied dat gepresenteerd signaalverlies behulp ImageJ.

Figuur 3. Photomicrograph van specifieke macrofaag immuunkleuring toont de intense infiltratie van macrofagen in de geïnfecteerde synovium (pijl). (RAM 11 immunostaining, originele vergroting 40x).

Figuur 4. Photomicrograph (Perls 'Pruisisch blauwe vlek, originele vergroting 40x) toont meerdere blauw-gekleurde cellen correspondig aan de USPIO-beladen macrofagen (pijl). (Herdruk van Lefevre S. et al.. ⁹ met toestemming).

Discussion

Terwijl de niet-specifieke gadolinium-gebaseerde contrastmiddelen geven informatie over de omvang en perfusie van de extracellulaire ruimte, macrofaag beeldvorming door USPIO-versterkte MR maakt een nauwkeurige anatomische lokalisatie en een kwalitatieve evaluatie van macrofaaginfiltratie in besmette synovium zonder de noodzaak van weefselmonsters ^9. Vanwege hun hoge gevoeligheid, kunnen USPIO demonstreren zelfs subtiele cellen in de vroege fasen van infectie zit. Onder succesvolle antibiotica, zoals de ziekteverwekkers geleidelijk verwijderd, wordt deze infiltratie geacht te dalen, waardoor de vermindering van de opname USPIO in het synovium. Omdat het gebied van donkere signaal gecorreleerd aan de tissular ijzergehalte kan synoviale signaal nadat USPIO toediening worden beschouwd als een biomarker, een kwantitatieve weergave van cellulaire infiltratie die de lengterichting geëvalueerd ^10. Bovendien, en in tegenstelling tot andere beeldvormingsmodaliteiten zoals optsche beeldvorming of isotopen beeldvorming, cellulaire MRI heeft de mogelijkheid om hoge-resolutie anatomische beelden die precieze lokalisatie van cellen-gerelateerde signaal veranderingen mogelijk te maken te genereren.

Macrofaag imaging maakt de schatting van aanwezigheid cel en distributie in weefsel van belang, zonder de noodzaak van weefselmonsters. Het vermijdt daarom twee belangrijke nadelen van herhaald weefselbemonstering vaak vereist in in vivo biologische studies die zijn invasief en modificatie van inheemse weefsel normale biologie. Bovendien zou sequentiële weefselbemonstering niet mogelijk zijn in kleine dieren die niet herhaald stressvolle procedures tolereren, zich verzet tegen een longitudinale evaluatie. In tegenstelling, in vivo follow-up weergave van macrofagen in een weefsel met sequentiële USPIO-enhanced MR scanning kan eenvoudig worden toegepast op kleine dieren de longitudinale controle van antibiotica in infectieziekten, anti-inflammatoire therapie bij modellen van Noninfectious artritis of behandeling in een macrofagen-betrokken ziekten.

Zodra het model van belang wordt gekozen (artritis, septische synovitis, enz.), Wordt contrastmiddel administratie eenvoudig uitgevoerd door langzame intravasculaire injectie en is in het algemeen niet technisch uitdagend. De belangrijkste beperking van MR beeldvorming met cellulaire USPIO contrastmiddel is de noodzaak voor het scannen 24 uur injectie, deze vertraging zodat de specifieke fagocytose door macrofagen ^5-7 herhaald. Teneinde vergelijkbare beeldgegevens hebben een nauwkeurig dierlijk inrichting als MR unit is verplicht. In onze ervaring, we hebben geconstateerd dat dier installatie in buikligging binnen de MR spoel geassocieerd met onderbeen volledige verlenging verkregen door zelfklevende tape toegestaan ​​zeer reproduceerbare en vergelijkbare afbeeldingen.

We in dit rapport gepresenteerde hoe gemakkelijk labelen in vivo macrofagen met USPIO, gebruik te maken van hun natuurlijkefagocytoseactiviteit. Zelfs wanneer een bijkomende voorafgaande ex vivo procedure kan nodig (om contrastmiddel penetratie toelaten in niet-natuurlijke fagocytische cellen), cellen labeling met zeer gevoelige contraststof zoals ijzeroxide deeltjes kunnen worden toegepast op andere soorten cellen zoals lymfocyten, polymorfonucleaire leukocyten of mestcellen. Mobiele MRI kan daarom een ​​interessant hulpmiddel voor het niet-invasief onderzoek van de sequentiële werving van alle celtypes die deze infectie-gerelateerde ontsteking, en het effect van zowel algemene als cel-gerichte therapie te evalueren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122